Abstract
Сочетание РНК люминесцентные в гибридизация (FISH) с иммунофлюоресценции (иммуно-FISH) создает технику, которая может быть использована в одном уровне клетки для выявления пространственной динамики РНК локализации с одновременным проникновением в локализации белков, эпигенетических модификаций и других деталей которые могут быть выделены с помощью иммунофлуоресценции. Инактивация Х-хромосомы является парадигмой для длительного некодирующая РНК (lncRNA) опосредованной сайленсинга. X-неактивной конкретных стенограмма (Xist) накопление lncRNA (так называемый Xist облако) на одном из двух Х-хромосом у самок млекопитающих является важным шагом для начала инактивации Х-хромосомы. Xist РНК, прямо или косвенно взаимодействует с различными хроматина модифицирующие ферменты и вводит различные эпигенетические ландшафты в неактивной Х-хромосомы (XI). Один известный эпигенетические отличительной чертой Xi является гистонов H3 триметил-лизин 27 (H3K27me3) модификация. Здесь мы опишем простой и быстрый иммуно-FISHпротокол для обнаружения Xist РНК с использованием РНК FISH с несколькими датчиками олигонуклеотидных в сочетании с иммунофлюоресценции H3K27me3 изучить локализацию Xist РНК и связанные изменения эпигенетических. С использованием олигонуклеотидных зондов результатов в более короткие сроки инкубации и более чувствительного обнаружения Xist РНК по сравнению с в пробирке транскрибируемых РНК-зондов (рибозонды). Этот протокол обеспечивает мощный инструмент для понимания динамики lncRNAs и связанных с ним эпигенетические модификации, структура хроматина, ядерной организации и регуляции транскрипции.
Introduction
Млекопитающих Х-хромосомы инактивации (XCI) представляет собой стратегию для компенсации дисбаланса в Х-хромосомой гена дозе между XX и XY, в котором один из двух Х-хромосом у женщин является транскрипционно инактивированные 1. Инактивация Х-хромосомы является большая модель системы долго некодирующих РНК (lncRNA) исследований. Инактивация Х-хромосомы регулируется несколькими lncRNAs, и была тщательно изучена в течение последних нескольких десятилетий, чтобы раскрыть механизмы перекрестных помех между lncRNAs, транскрипция, структуры хроматина и ядерной организации 2, 3.
Х инактивации центр (XIC) расположен на Х-хромосоме представляет собой комплекс генетический локус состоит из ряда генов, продуцирующих некодирующих РНК 4. X-неактивной конкретных стенограмма (Xist) lncRNA в плацентарные млекопитающие, является одним из таких lncRNA который играет важнейшую роль в X-хромосоме инактивации 5,6. XIST транскрипты окружают расположение фура Xi инициировать инактивации Х-хромосомы, и появляются в виде облака, когда визуализированы с помощью РНК рыбы; Это образование называется как "облако" Xist 7. С Xist РНК взаимодействует с различными хроматина изменения ферменты, со-локализация облака Xist с различными эпигенетических модификаций для молчащего хроматина и репрессивного транскрипции наблюдается при X-хромосомы инактивации 8. Например, Xist РНК взаимодействует с Поликомб репрессивного комплекса 2 (PRC2), который отвечает за H3K27me3 и вызывает репрессивный хроматина 9. Появление Xist облако на Си и его совместной локализации с интенсивным модификации H3K27me3 представляет собой добровольную гетерохроматина ландшафт Xi 10,11.
Цитогенетические методы, такие как ДНК / РНК FISH прошли долгий путь от традиционного метода используются меченые зонды 12 на последние и передовые технологии с повышенной чувствительностью ифлуоресцентных изображений с использованием нескольких олигонуклеотидных зондов 13,14. ДНК / РНК FISH в сочетании с иммунофлюоресценции регулярно используется в качестве цитологического инструментом для понимания пространственно-временной ядерной организации, локализация РНК, структура хроматина и модификации. Наиболее стандартный препарат зонд для РНК FISH включает использование плазмиды или бактериальных искусственных хромосом (ВАС) клонов и их последующей классификации либо с переводом ник или случайного праймера 15. Тем не менее, почти 70% генов у мышей и 40% генов у человека показывают, перекрытие смысловых и антисмысловых транскриптов 16, следовательно, требует метод FISH нити конкретным районам в целях отличить смысл и антисмысловых транскриптов. В пробирке, транскрибируемые РНК-зондов (Riboprobe ) часто используются для цепи РНК с FISH 17,18; Однако, это включает подготовку плазмиды клона или ПЦР-продукта с Т7, SP6 или T3 промотора и синтеза рибонуклеотидными зондами. Кроме того, рибозонды получены из геномаIC ДНК или кДНК часто содержат не конкретные регионы и повторяющиеся элементы, что приводит к высокой фонового шума. Другой вопрос, что рибозонды, которые несколько сотен нуклеотидов в длину и содержат несколько флуорофоры, не может эффективно проникать в ядро. Чтобы обойти это, несколько короче олигонуклеотидных зондов, меченных с помощью одного флуорофора в конце были разработаны, которые имеют хорошую чувствительность, равномерную силу сигнала и простоту очистки и обработки 14. Кроме того, олигонуклеотиды, ДНК, как правило, более стабильны, чем РНК. Мы применили подобную стратегию с использованием олигонуклеотидов в Xist РНК FISH 19 с иммунофлуоресценции понимать эпигенетические динамику Xi, вызванные Xist lncRNA в процессе инактивации Х-хромосомы. Этот протокол описывает создание олигонуклеотидных зондов и надлежащей подготовки клеток, а также использование иммунофлуоресценции и РНК рыбы. Xist РНК FISH с использованием нескольких oligonucleotides является экономически эффективным подходом в долгосрочной перспективе, если Xist РНК FISH проводится на регулярной основе в своей лаборатории. Этот метод может быть использован для идентификации lncRNAs в клетках, одновременно отображение его совместную локализацию с эпигенетических модификаций или факторов. Одно из главных преимуществ протокола является возможность легко изменять его в соответствии с своих научных интересов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Зонд Подготовка
- Получить несколько уникальных олигонуклеотидов в Xist (20-30 нуклеотидов, длины олигонуклеотидов, 63-65 ° С температуры плавления, таблица 1) с 5'-амино модификации и приостановить в воде.
- Бассейн эквимолярные количества олигонуклеотидов с 5'-амино модификации (всего 4,5 мкг) и этикетка с амин-реактивным флуоресцентным красителем следующей инструкцией изготовителя.
- Растворите объединенных олигонуклеотидов в финале 5 мкл нуклеазы без воды и добавить 3 мкл 1 М бикарбоната натрия для олигонуклеотидным решения.
- Добавить 2 мкл ДМСО во флакон амина-реактивного красителя и вихря кратко.
- Смешайте олигонуклеотидного раствора реакционноспособного красителя в ДМСО и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте.
- Очищают флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов от колонке G-25 с последующим осаждением этанолом.
- Добавить 40 мкл нуклеазы без воды в меченой смеси, полученной на стадии 1.2.3 и применить к колонке G-25. Центрифуга при 750 мкг в течение 2 мин.
- Добавить 50 мкл нуклеазы без воды, 10 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 250 мкл этанола в очищенном зонда с шага 1.3.2. Хранить при -80 ° С в течение 30 мин и центрифугируют при 21000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
- Вымойте осажденных олигонуклеотидов один раз 1 мл 70% этанола.
- Повторное приостановить в 50 мкл нуклеазы без воды или ТЕ (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТА) до конечной концентрации приблизительно 10 мкМ.
- Развести флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов до конечной концентрации 250 нМ с гибридизации буфера (10% формамида; 2Х SSC [300 мМ NaCl; 30 мМ цитрат натрия]; 2 мг / мл БСА, 10% сульфат декстрана).
ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого быстрого протокола рыба, олигонуклеотид родежды в Xist были разработаны и использованы при более высокой концентрации, чем в нормальном протокола FISH с использованием олигонуклеотидных зондов, с тем, чтобы сократить время инкубации в течение гибридизации.
2. Презентация Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть подготовлены для иммуно-FISH с использованием мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) или эмбриональных тело (EB) дифференциации клеток 20, 21 либо растет их непосредственно на поли-лизин-обработанной слайд или с помощью Cytospin с клеточной суспензии. Здесь, подготовка слайд в Cytospin показано.
- Аспирируйте культуральной среды в чашке с 6-а. Промыть PBS (комнатная температура), и аспирата тщательно.
- Добавить 0,5 мл трипсина на блюдо 6-а, инкубировать в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С.
- Добавить 5 мл среды и дисперсных клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз несколько раз.
- Передача клеток в 15 мл пробирку, центрифуги в течение 5 мин при 200 х г при комнатной температуре.
- Откажитесь от средой вбы мягко приостановить клетки в 2 мл PBS.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра и разводят клеточной суспензии в 4 х 10 5 клеток / мл по PBS.
- Соберите слайд, фильтр карты и камеру с зажимом и поместите их в соответствующие пазы в роторе Cytospin. Добавить 250 мкл каждого образца, полученного на стадии 2.6 в каждую камеру из собранных единиц в цитоспина. Центрифуга при 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Заполните 3 Коплин банки на льду с 40 мл каждого из ледяной PBS, ЦСК буфере (10 мМ, рН ТРУБЫ 6,8; 100 мМ NaCl; 300 мМ сахарозы; 3 мМ MgCl 2), и CSKT буферные (ЦСК буфер с 0,5% Triton Х-100), соответственно.
- После завершения цитоспина, быстро передавать слайд в ледяной PBS и инкубировали в течение 5 мин.
- Передача слайд в ледяной ЦСК буфера и инкубировать в течение 1 мин.
- Передача слайд в ледяной CSKT буфера и инкубировать в течение 5 мин.
- Передача слайд обратно в ледяной ЦСК BUFфер и инкубировать в течение 1 мин.
- Передача слайд в 4% параформальдегид в PBS и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. Иммунофлуоресценции
- Поместите слайды в Коплин банку с PBST (1x PBS с 0,1% твина-20) в течение нескольких секунд.
- Поместите слайды под наклоном, позволяющей остальные буфер стечь слайда. Тщательно протрите лишнюю жидкость от слайда и поместите его в пустую пипетку кончиком коробке с водой. Перекрытие слайд с 40 мкл блокирующего раствора (1x PBS, 1% BSA, 0,1% Твин-20), осторожно поместить покровное и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Удалить покровное, удалить блокирующий раствор, и добавить 40 мкл первичного антитела гистонов H3K27me3 разбавленного до концентрации 1: 500 в блокирующем растворе. Поместите покровное обратно на предметное стекло и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: РНКазы ингибитор в блокировании решения могут быть полезны для сохранения РНК в этом РНК FISH Протокол когда поликлональные антитела используются. - Вымойте слайд в 2 раза в Коплин банки, наполненные ФБРТ, в течение 5 минут каждый, осторожно встряхивая время мытья.
- Поместите слайды под наклоном, позволяющей остальные буфер стечь слайда. Тщательно протрите лишнюю жидкость и поместить слайд обратно в коробку наконечника. Наложение с 40 мкл вторичного антитела (1: 500), разведенного в блокирующем растворе, разместить покровное и инкубировать в течение 15 мин в темноте. Для следующих шагов, сохранить слайд в темноте во все времена.
- Вымойте 2 раза в Коплин банки с PBST как в шаге 3.4.
4. РНК FISH с олигонуклеотидных зондов
- Предварительно разогреть пустой пипетки кончика коробку с водой на дне, чтобы предотвратить слайды из сушки при 37 ° С в течение РНК рыбу в шаге 4.3.
- Поместите слайды под наклоном, позволяющей остальные буфер стечь слайда. Тщательно протрите лишнюю жидкость от слайда, начиная с шага 3.6 и поместить слайд в пипетку кончиком коробке с Ватэр в нижней части. Добавить 500 мкл промывочного буфера FISH (10% формамида в 2х SSC) на слайде и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить FISH промывочного раствора, добавить 8 мкл олигонуклеотидных зондов на слайде, место покровное, и передать слайда в подогретого поле пипетки наконечника с водой на дне; инкубировать при 37 ° С в течение 1-2 ч.
- 3 место подогретого банки Коплин на водяной бане при 37 ° С с рыбой промывочного буфера, рыба промывочного буфера с DAPI и 2х SSC.
- После 1-2 часов инкубации для РНК FISH, положить слайд в предварительно нагретой буфера FISH стирки.
- Выдержите слайд в течение нескольких минут, пока покровное не падает на слайде.
- Поместите затвор назад в промывочного буфера, и продолжают инкубацию в течение 5 мин.
- Передача слайда к другому Коплин банку с подогретого FISH промывочного буфера с 0,5 нг / мл DAPI и инкубировать в течение 5 мин.
- Передача слайда к другому Коплин банку с подогретого 2х SSC и инкубировать в течение 5 мип.
- Поместите слайды под наклоном, позволяющей остальные буфер стечь слайда. Тщательно протрите лишнюю жидкость и поместить слайд обратно в сухом боксе наконечника. Добавить 4 мкл antifade с DAPI на слайд и поместите покровное.
- Печать покровное с лаком для ногтей и наблюдать под микроскопом. Слайд может храниться при температуре 4 ° С в темноте в течение нескольких месяцев.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характерные изображения быстро иммуно-FISH показаны на рис 1А. Со-локализация РНК Xist облака и H3K27me3 сигнала на Xi была обнаружена при дифференцировке клеток женщин. В день 12 после дифференцировки, более 90% клеток ЕВ была Xist облако (фиг.1В). Краткое олигонуклеотидные зонды эффективно проникали в ядрах, что приводит к визуализации почти все H3K27me3 сигналы со-локализуется с Xist РНК (фиг 1С; 97%, N = 150).
Рисунок 1: Xist РНК и H3K27me3 ко-локализуются на Си в дифференциации мыши EB () иммуно-FISH для Xist РНК с модификацией H3K27me3 в дифференциации женские EB клетки на 12 день после дифференцировки.. XIST зонды были помечены Alexa Fluor 488, и анти-H3K27me3 первичное антитело было дезащищаемого анти-IgG мыши Alexa Fluor 555-конъюгированного второго антитела. Ядра контрастно с DAPI. В коробке область увеличивается в нижних панелей. Scale бары:... 10 мкм (Б) Частота Xist cloud- и H3K27me3-положительных клеток в EB в день 12 после дифференцировки (С) Частота со-локализации Xist облаке с сигналом H3K27me3 в EB в день 12 после дифференцировки Пожалуйста Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
Xp1 | ggtaagtatccaaaaccccgttgg |
Xp2 | cgatcagcagcaacagtacacg |
Xp3 | gcaattggttgcttttatccagtcc |
XP4 | cgcaacaccgcacactaatacg |
XP5 | gccatcttagacacattcaagagcat |
XP6 | cacacgtgaagtaccaagcgaaac |
XP7 | gccacgtatagagcactgtaagagactatg |
XP8 | caaagcacactatcagacgtgtcg |
XP9 | ggagaatctagatgccataaaggcaag |
XP10 | tgatggacactgcattttagcactg |
Xp11 | ggacactgcattttagcaatacgattc |
Xp12 | gtgatgggcactgcattttagc |
XP13 | agatgggctatctcagtcttataggct |
Xp14 | ggaagtcagtatggagggggtatg |
XP15 | tgggactgtgactactacagcaatga |
Xp16 | aagactcaattcctagtcaggattatccac |
XP17 | gggctgtagctctatgacagtgcttt |
Xp18 | gtcttcaccagatgcagattactacagtg |
Xp19 | aatagtttgaggaaggggtttcaagtg |
XP20 | gctgttcaggtttccttctgtagtga |
Xp21 | gcaagagatacaatggtccgaaaagt |
Xp22 | agcacttcgtacaaccctctttctg |
Xp23 | gaagagagcaggtcattcgtcagag |
Xp24 | gcaactgagacactgtagccatatgaag |
Xp25 | ttcctggaggaagaacggaaaga |
Xp26 | tgattagaaggcttaggtcatcttcca |
Xp27 | ttttgttcagagtagcgaggacttga |
Xp28 | aatagagcagaatggcttcctcgaa |
Xp29 | acattgcttgatcacgctgaagac |
XP30 | gcaaggaagaaatagacacacaaagc |
Xp31 | ggaagaaatagatgtaacaaagaattagacaca |
XP32 | cacttcagagccacttgaatcctg |
Xp33 | agtcacaggtgtcctgtagaaacagttc |
Xp34 | cctttatgggcaatggcaacaat |
Xp35 | ggcacatctgcatattgcttgtcta |
Xp36 | gcaactaagaccatgaacccacaa |
Xp37 | aaacacactggccttaagtatatggactg |
Xp38 | cattcatttgcacacatggaacaat |
Xp39 | tgggagacaatatttagcctccaggt |
Xp40 | cctagcaagggcactgttttgtaataa |
Xp41 | taacatttagcacactgccttgcac |
Xp42 | cagtgatctacactaggtccacctcaca |
Xp43 | ttatgttgaaggaatcttggccttg |
Xp44 | aagtgagagctgtagtctcaaggtgtga |
Xp45 | gtattcaacctctgaggcaaactgtg |
Xp46 | agattgtggaacttagatggctgtca |
Xp47 | tggaactgcattaaagtcccaacttag |
Xp48 | gaactcccagacctcttcaacctg |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы представили краткий протокол иммуно-FISH, что занимает меньше 5 ч завершить подготовку слайдов, Xist РНК рыбу, и иммунофлюоресценции H3K27me3. По сравнению с общим подходом иммуно-FISH для Xist РНК обнаружение, которые, как правило, нуждается в инкубации в течение ночи для РНК FISH, этот протокол не только значительно сокращает время, затрачиваемое, но и улучшает чувствительность иммунной-FISH с использованием олигонуклеотидных зондов.
Поскольку Xist высоко транскрибируется в ходе инактивации Х-хромосомы и его транскрипт обнаружено интенсивно накапливаются на Xi в цис, это легко обнаружить РНК Xist сигнал в дифференциации и дифференцированные клетки РНК FISH с использованием сравнительно небольшой период времени инкубации. Этот протокол иммуно-FISH может применяться для других белков, представляющих интерес и обильным РНК, хотя может потребоваться оптимизация иммунофлуоресценции и РНК рыбы. Для того, чтобы применить протокол в другой РНК, НЮМBER возможных зондов олигонуклеотидных нужно будет рассмотреть, а затем путем оптимизации методом проб и ошибок концентрации зонда, время инкубации и температуры для РНК рыбы. Одним из примеров других приложений наш предыдущий успех в обнаружении теломерную РНК с использованием одиночных LNA зондов 22. Для проектирования и подготовки для обнаружения низких обильные целей РНК-зонда, обратитесь к статье Власти и Тяги 23. Другой вопрос, что следует считать это шагом пермеабилизации. Особое внимание в отношении различных условий пермеабилизации необходимо; Например, более мягкие эффекты, чем то, что описано в нашей протокола может происходить с проницаемости после фиксации 15. Различные процедуры пермеабилизирующего также необходимо учитывать при проведении иммуно-FISH с использованием различных типов клеток. Порядок иммунофлюоресценции и РНК FISH может также повлиять на обнаружение белков-мишеней, модификаций и РНК иммуно-FISH. Если РНК рыба выполнитьред до иммунофлуоресценции, один час инкубации в течение РНК FISH сегмента достаточно для обнаружения РНК Xist сигнал. Однако, поскольку диметилформамид, содержащиеся в буфере гибридизации и рыба промывочного буфера негативно влияет H3K27me3 иммунофлюоресценции, мы всегда выполнять H3K27me3 иммунофлюоресценции до Xist РНК FISH в этом протоколе. Для других приложений, порядок процедур будет зависеть от белков-мишеней и эпигенетических модификаций, которые должны соблюдаться иммунофлюоресценции. Как первичное антитело мы использовали для H3K27me3 иммунофлюоресценции имеет высокий титр и специфичность H3K27me3 24, мы можем использовать более короткий инкубационный период для иммунофлуоресценции. Тем не менее, время реакции и температура иммунным зависит от антитела, используемого и, таким образом оптимизации необходим для каждого антитела.
Использование олигонуклеотидных зондов, Xist обнаружения РНК РНК-рыба была значительно улучшена. В наших предыдущих исследованиях мы обнаружили, что подмножество DIFferentiating клетки с H3K27me3 окрашивания на Си не связаны с РНК Xist сигнала 25. Так модификация H3K27me3 на Си связано с набором PRC2 по Xist РНК 9 - 11, 26, мы предположили, что это было из-за неэффективного проникновения рибонуклеотидных зондов в ядра по сравнению с антителом для иммунофлуоресценции. С помощью олигонуклеотидных зондов в этом протоколе мы обнаружили, что сигнал H3K27me3 в дифференциации женские клетки почти всегда со-локализуется с Xist РНК (рис 1).
Этот быстрый протокол иммуно-FISH позволяет получить снимок динамических изменений, вращающихся вокруг Xist lncRNA и предлагает новый инструмент, чтобы помочь получить лучшее понимание того, как lncRNA работает. IncRNAs влияют на различные клеточные функции, такие как геномного импринтинга, регуляции генов, перевод РНК, и РНК созревания 27. Разработка более глубокому пониманию разнообразных ролиы играет lncRNA поможет продвинуть вперед поле и позволяют для будущих открытий в регулировании жизненно важных клеточных процессов в организме человека, а также способствовать развитию потенциальных мишеней для лечения болезни. Так этот протокол легко можно оптимизировать по отношению к другим маркерам и lncRNAs интересов, это отличный инструмент, чтобы помочь решить тайны различных lncRNAs в клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
oligonucleotides with 5’-amino modification | IDT | ||
Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 | |
MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 | |
Cytospin 2 | Shandon | 59900102 | |
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 | |
Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 | |
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 | |
ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
- Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
- Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
- Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
- Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
- Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
- Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
- Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
- Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
- Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
- Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
- Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
- Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
- Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
- Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
- Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
- Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).