Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hızlı Floresan Published: November 26, 2014 doi: 10.3791/52053
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1, 1,2
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

Immünfloresans (immün-FISH) ile in situ hibridizasyon (FISH) RNA floresan proteinleri birleştiren, epigenetik değişiklikler ve diğer detaylar lokalizasyonu içine eşzamanlı bir bakış açısı ile RNA lokalizasyonu mekansal dinamiklerini tespit etmek için tek hücre düzeyinde istihdam edilebilir bir teknik oluşturur hangi immünofloresan vurgulanmış olabilir. X-kromozomu inaktivasyonu uzun olmayan kodlama RNA (lncRNA) aracılı gen susturulması için bir paradigma olduğunu. Memeli kadınlarda iki X-kromozom birinde (bir Xist bulut denir) X-inaktif özel transkript (Xist) lncRNA birikimi X-kromozomu inaktivasyonu başlatmak için kritik bir adımdır. Xist RNA doğrudan veya dolaylı olarak çeşitli kromatin-modifiye enzimler ile etkileşim ve inaktif X-kromozomu (Xi) için ayrı epigenetik manzara tanıttı. Xi biri bilinen epigenetik damgasını Histone H3 trimetil-lizin 27 (H3K27me3) değişiklik. Burada, biz basit ve hızlı bir immün FISH tarifXist RNA lokalizasyonu ve ilişkili epigenetik değişiklikleri incelemek için H3K27me3 immünofloransı ile birleştiğinde birden oligonükleotid probları ile RNA FISH kullanarak Xist RNA tespiti için protokol. Oligonükleotid probları daha kısa bir kuluçkalama süresi sonuçları in vitro ötelenmiş RNA probları (riboprobları) göre Xist RNA daha hassas algılama kullanılması. Bu protokol lncRNAs dinamiklerini ve ilgili epigenetik değişiklik, kromatin yapısı, nükleer organizasyon ve transkripsiyon düzenleme anlamak için güçlü bir araç sağlar.

Introduction

Memeli X-kromozomu inaktivasyonu (XCI) kadınlarda iki X-kromozomu biri transkripsiyonel 1 inaktive burada XX ve XY arasındaki X-bağlantılı gen doz dengesizliği telafi etmek için bir stratejidir. X-kromozomu inaktivasyonu uzun olmayan kodlama RNA (lncRNA) araştırma için harika bir model sistemidir. X-kromozomu inaktivasyonu birden lncRNAs tarafından düzenlenir ve yoğun lncRNAs, transkripsiyon, kromatin yapısı ve nükleer organizasyonu 2, 3 arasındaki karışma mekanizmaları ortaya çıkarmak için son birkaç yılda çalışılmıştır.

X kromozomunda bulunan X inaktivasyon merkezi (XIC) kodlayıcı olmayan RNA'lar 4 üreten genlerin bir dizi içeren bir kompleks genetik lokus olduğu. X-aktif spesifik transkript (Xist) lncRNA eutherian memelilerde X kromozomu inaktivasyonu 5,6 çok önemli bir rol oynar böyle bir lncRNA olup. Xist transkript fu yerini çevreleyenTure Xi X-kromozomu inaktivasyonu başlatmak ve RNA FISH kullanılarak görüntülendi zaman bir bulut gibi görünmesini; Bu oluşum "Xist Cloud" 7 olarak adlandırılır. Xist RNA, çeşitli kromatin değiştirici enzimler ile etkileşim için, sessiz bir kromatin ve baskı transkripsiyon için farklı epigenetik değişiklikler ile Xist bulutlar eş-lokalizasyonu X kromozomu inaktivasyonu 8 süresince gözlenir. Örneğin, Xist RNA H3K27me3 sorumludur ve baskıcı bir kromatin devlet 9 uyaran Polycomb baskıcı kompleksi 2 (PRC2) ile etkileşime girer. Xi ve yoğun H3K27me3 modifikasyonu ile birlikte yerelleştirme Xist bulut oluşumu Xi 10,11 bir fakültatif heterokromatinin manzara temsil eder.

Böyle DNA / RNA FISH gibi sitogenetik teknikler, gelişmiş hassasiyet ile son ve gelişmiş teknikler, radyoaktif işaretli problar 12 kullanılarak geleneksel yöntemle uzun bir yol katettikBirden fazla oligonükleotid sondaları 13,14 kullanılarak flüoresan görüntüleme. Immünofloresan ile birleştiğinde DNA / RNA BALIK rutin Spatiotemporal nükleer organizasyonu, RNA lokalizasyonu, kromatin yapısını ve değişiklikleri anlamak için bir sitolojik araç olarak kullanılmıştır. RNA, FISH için pek çok standart prob hazırlama plazmid ya da bakteriyel yapay kromozom (BAC) klonu ve çentik translasyonu veya rastgele prime 15 ya da daha sonraki etiketi kullanılmasını içerir. Bununla birlikte, farelerde genlerin yaklaşık% 70 ve insanlarda genlerin% 40 sens ve antisens transkriptleri ayırmak için bu nedenle bir büküm özel FISH yöntem gerektiren, sens ve antisens transkriptleri 16 bir üst üste göstermektedir. İn vitro transkribe RNA sondaları (riboprob ) genellikle iplik-spesifik RNA FISH 17,18 için kullanılır; bununla birlikte, bu, T7, SP6 veya T3 promoteri ve sentezlenmesi riboprobes bir plazmid klonu ya da PCR ürün hazırlama içerir. Ayrıca, genomunun elde riboproblarıic DNA veya cDNA sık sık yüksek arka plan gürültüsü neden non-spesifik bölgeleri ve tekrarlayan unsurlar içerir. Diğer konu da, uzunluğu bir kaç yüz nükleotidlerdir ve birden florofor içeren riboprobları, etkili bir çekirdek içine girmek edemezler. Bu aşmak için, ucunda tek bir florofor ile işaretlenmiş çok sayıda daha kısa oligonükleotid probları iyi hassasiyet, düzgün sinyal kuvveti ve saflaştırma kolaylığı ve 14 taşıma olduğu geliştirilmiştir. Buna ek olarak, DNA oligonükleotidleri, genel olarak RNA daha stabildir. Bu X kromozomu etkisizleştirme işlemi sırasında Xist lncRNA neden Xi epigenetik dinamiklerini anlamak için immünofloresan ile Xist RNA, FISH 19 oligonükleotidleri kullanılarak benzer bir strateji uygulanır. Bu protokol, oligonükleotid prob ve hücrelerin uygun hazırlama oluşturma, hem de bağışıklık ve RNA FISH kullanımını tarif etmektedir. Birden oligonucle kullanarak Xist RNA BALIKXist RNA BALIK kişinin laboratuvarında rutin olarak ise, SEK, uzun vadede maliyet etkin bir yaklaşımdır. Bu teknik aynı zamanda epigenetik değişiklikler ya da faktörleri ile birlikte-lokalizasyonunu haritalama ise hücrelerinde lncRNAs tanımlamak için kullanılabilir. Protokolün bir büyük avantajı kolayca kişinin araştırma çıkarlarına uygun şekilde değiştirmek için yeteneğidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prob Hazırlık

  1. 5'-amino modifikasyon ile birden fazla benzersiz Xist oligonükleotitlerin (20-30 nükleotid uzunlukta oligonükleotitlerin, 63-65 ° C, erime sıcaklığı, Tablo 1) elde edilir ve su içinde askıya.
  2. 5'-amino modifikasyon (toplam 4.5 ug) ve imalatçının talimatları izlenerek, amin-reaktif bir floresan boya ile etiket ile oligonükleotidler havuzu, eşit molar miktarlarda.
    1. Nükleaz içermeyen suyun nihai 5 ul toplanmış oligonükleotidler çözülür ve oligonükleotit solüsyonuna 1 M sodyum bikarbonat ve 3 ul ekleyin.
    2. Kısaca, amin-reaktif boya ve girdap şişeye 2 ul DMSO ekleyin.
    3. DMSO içinde reaktif boya ile oligonükleotid çözeltisi karıştırılır ve karanlıkta 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım inkübe edin.
  3. Etanol ile çökeltme, ardından G-25 kolonu ile floresan etiketli oligonükleotid probları arındırın.
    1. Adım 1.2.3 üretilen etiketleme karışımına 40 ul nükleaz ücretsiz su ekleyin ve G-25 kolonuna uygulanır. 2 dakika boyunca 750 x g'de santrifüjleyin.
    2. Aşama 1.3.2 arıtılmış proba 50 ul nükleaz içermeyen su, 10 ul 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 250 ul etanol ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 21,000 x g'de 30 dakika santrifüj için -80 ° C'de saklayın.
    3. % 70 etanol, 1 ml ile bir kez çöktürülerek oligonükleotidler yıkayın.
    4. 50 ul içinde yeniden askıya nükleaz içermeyen su veya TE (10 mM Tris-HCI, pH 7.5; 1 mM EDTA) içinde yaklaşık 10 uM bir nihai konsantrasyonu.
  4. Hibridizasyon tampon maddesi ile 250 nM arasında bir nihai konsantrasyona floresan etiketli oligonükleotit problar seyreltin (% 10 formamid, 2X SSC [300 mM NaCI, 30 mM sodyum sitrat] 2 mg / ml BSA;% 10 dekstran sülfat).
    NOT: Bu hızlı BALIK protokolü ile, oligonükleotid pXist elbiseler tasarlanmış ve hibridizasyon için kuluçka süresini kısaltmak için, oligonükleotit problar kullanılarak normal BALIK protokollerine göre daha yüksek bir konsantrasyonda kullanılmıştır.

2. Slayt Hazırlama

NOT: Slaytlar fare embriyonik kök (ES) veya embriyoid gövdesini (EB) kullanarak bağışıklık FISH için hazırlanabilir ya poli-lizin-tedavi slayt üzerinde doğrudan büyüyen veya hücre süspansiyonu ile sitospin kullanarak hücreleri 20, 21 farklılaştırarak. Burada, Sitospin slayt hazırlama gösterilir.

  1. 6 gözlü tabak içinde kültür ortamı aspire. İyice PBS (oda sıcaklığı) ve aspirasyon ile yıkayın.
  2. 37 ° C'de 5-10 dakika süreyle inkübe, 6-çukurlu tabağa tripsin 0.5 ml ilave edilir.
  3. Ortamın 5 ml ilave edilir ve bir kaç kez özenle aşağı yukarı pipetleme hücreleri dağıtılır.
  4. Oda sıcaklığında, 200 x g'de 5 dakika boyunca, bir 15 ml tüp santrifüj hücreleri aktarın.
  5. Ortam, bir atınyavaşça 2 ml PBS içinde hücrelerin süspansiyonu d.
  6. Hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve PBS ile 4 x 10 5 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltin.
  7. Bir slayt, bir filtre kartı ve bir klip ile bir odayı birleştirin ve Sitospin rotor uygun yuvalara yerleştirin. Sitospin monte birimlerin her odasına adım 2.6 hazırlanan her numunenin 250 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüj.
  8. 40 ml buz-soğuğu PBS CSK tamponu her biri buz üzerinde 3 coplin kavanoz doldurun (10mM PIPES pH 6.8; 100 mM NaCI, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl2) ve CSKT tamponu (% 0.5 Triton CSK tampon X-100) idi.
  9. Sitospin tamamlandıktan sonra hızla buz gibi soğuk PBS içine slayt aktarmak ve 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  10. Buz soğukluğunda CSK tampon içine slayt aktarın ve 1 dakika boyunca inkübe edin.
  11. Buz soğukluğunda CSKT arabelleğe slayt aktarın ve 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  12. Buz-soğuk CSK buf geri slayt aktarınfer ve 1 dakika boyunca inkübe edin.
  13. PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde slayt aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.

3. İmmünofloresan

  1. Birkaç saniye (% 0.1 Tween-20 ile 1x PBS), PBST ile coplin kavanoza slaytlar yerleştirin.
  2. Slayt aşağı akmasına tampon kalan izin eğik slaytlar yerleştirin. Dikkatle slayt kapalı aşırı sıvı silin ve su ile boş bir pipet ucu kutusuna yerleştirin. Yumuşak bir lamel, bloke etme çözeltisi 40 ul (1 x PBS,% 1 BSA,% 0.1 Tween-20) ile slayt Yerleşimi, ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
  3. Lamel Bloke etme çözeltisi uzaklaştırılır kaldırmak ve 1 bir konsantrasyona seyreltilmiştir Histon H3K27me3 birincil antikor 40 ul: 500 çözüm engelleme. Geri slayt lamel yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
    Not: bloke çözeltisi içinde bir RNaz inhibitör bu RNA FIS RNA'yı korumak için yararlı olabilirPoliklonal antikorlar kullanılmıştır lH protokolüdür.
  4. Yıkama hafifçe yıkama sırasında sallayarak, 5 dakika her biri için, PBST ile dolu coplin kavanozlarda 2 kez kaydırın.
  5. Slayt aşağı akmasına tampon kalan izin eğik slaytlar yerleştirin. Dikkatle aşırı sıvı silin ve tekrar ucu kutuya slayt yerleştirin. Ikincil antikor (1: 500) 40 ul Kaplama çözeltisi engelleme seyreltilmiş, bir lamel ve karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Aşağıdaki adımları için, her zaman karanlıkta slayt tutun.
  6. Adım 3.4 gibi PBST ile kavanoz Coplin 2 kez yıkayın.

Oligonükleotid Probları 4. RNA BALIK

  1. Adım 4.3 RNA FISH için 37 ° C'de kurumasını önlemek için slaytlar altındaki su ile boş bir pipet ucu kutusu Ön-sıcak.
  2. Slayt aşağı akmasına tampon kalan izin eğik slaytlar yerleştirin. Dikkatle adım 3,6 slayt kapalı aşırı sıvı silin ve wat ile pipet ucu kutusu içine slayt yerleştirinalt er. Slayt üzerinde FISH yıkama tamponu (2x SSC,% 10 formamid) 500 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
  3. FISH yıkama solüsyonu çıkarın slayt üzerine oligonükleotid prob 8 ul ekleyin, bir kapak kayma yerleştirin ve alt su ile önceden ısıtılmış pipet ucu kutusu slayt aktarmak; 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. BALIK yıkama tamponu, DAPI FISH yıkama tamponu ve 2 x SSC ile 37 ° C'de bir su banyosu içinde 3 önceden ısıtılmış coplin kavanoz yerleştirin.
  5. RNA FISH için 1-2 saat inkübasyondan sonra, önceden ısıtılmış BALIK yıkama tamponu içine slayt koydu.
  6. Lamel slayt düşer kadar birkaç dakika için slayt inkübe.
  7. Geri yıkama tamponu içine slayt yerleştirin ve 5 dakika inkübasyon devam ediyor.
  8. 0.5 ng / ml DAPI ile önceden ısıtılmış BALIK yıkama tamponu ile bir coplin kavanoza slayt aktarın ve 5 dakika boyunca inkübe edin.
  9. Önceden ısıtılmış 2x SSC ile başka coplin kavanoza slayt aktarın ve 5 mil inküben.
  10. Slayt aşağı akmasına tampon kalan izin eğik slaytlar yerleştirin. Dikkatle aşırı sıvı silin ve kuru bir ucu kutuya geri slayt yerleştirin. Slayt üzerine DAPI ile antifade 4 ul ekleyin ve bir lamel yerleştirin.
  11. Oje ile lamel Seal ve bir mikroskop altında gözlemlemek. Lam, bir kaç ay boyunca karanlıkta 4 ° C de muhafaza edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pratik immüno-FISH temsili görüntüleri Şekil 1A'da gösterilmiştir. Xi Xist RNA bulut ve H3K27me3 sinyalinin Eş-lokalizasyonu kadın hücrelerin ayırt saptandı. Farklılaşması üzerine 12. günde EB hücrelerinin% 90'dan daha fazla bir Xist bulut (Şekil 1B) vardı. (; 150% 97, n = Şekil 1C) Kısa oligonükleotid probları etkin bir şekilde neredeyse tüm H3K27me3 sinyalleri Xist RNA ile birlikte lokalize bir görselleştirme yol, çekirdeklerin içine nüfuz.

Şekil 1,
Şekil 1: Xist RNA ve H3K27me3 farklılaşma üzerine günde 12 dişi EB hücreleri ayırt H3K27me3 değişiklik ile Xist RNA için fare EB (A) Immuno-FISH ayırt Xi birlikte lokalize.. Xist probları Alexa Fluor 488 ile işaretlendi, ve anti-H3K27me3 birincil antikor de edildianti-fare IgG ve Alexa Fluor 555-konjuge sekonder antikor ile korunan. Çekirdekler DAPI ile zıt. kutulu bölge alt panellerde büyütülür. Ölçek çubukları:... 10 um (B), farklılaşma üzerine 12. günde EB Xist Cloud ve H3K27me3-pozitif hücrelerin frekansı (C), farklılaşma üzerine 12. günde EB H3K27me3 sinyali Xist bulut eş-lokalizasyonu sıklığı , lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Tablo 1: Xist RNA FISH için floresan markajlı oligonükleotidlerin dizisi. 48 oligonükleotid Xist RNA, FISH için floresan etiketli oligonükleotid probları hazırlamak için 5'-amino modifikasyon ile sentezlenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, H3K27me3 için slayt hazırlama, Xist RNA FISH ve immünoflüoresans tamamlamak için en az 5 saat sürer hızlı bir bağışıklık BALIK protokolü sundu. Genellikle RNA FISH gecede inkübasyon ihtiyacı Xist RNA saptanması, genel bağışıklık FISH yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu protokol önemli ölçüde harcanan zamanı azaltır, aynı zamanda oligonükleotid probları kullanılarak bağışıklık FISH duyarlılığını artırır sadece.

Xist yüksek X-kromozomu inaktivasyonu sırasında transkripsiyonu ve yoğun sis içinde Xi birikir onun transkript bulundu olduğundan, farklılaştırarak ve RNA FISH ile farklılaşmış hücrelerin nispeten kısa bir inkübasyon süresi kullanılmasında Xist RNA sinyal tespit etmek kolaydır. Bağışıklık ve RNA FISH optimizasyon gerekli olabilir, ancak bu immüno-BALIK protokol, ilgi ve bol RNA 'sının diğer proteinler için uygulanabilir. Amacıyla, diğer RNA num protokolünü uygulamakolası oligonükleotid prob ber RNA FISH için sondanın konsantrasyon deneme-yanılma optimizasyonu, inkübasyon süresi ve sıcaklığı takip, dikkate alınması gerekir. Diğer uygulamaların bir örneği tek LNA probları 22 ile telomer RNA tespit önceki başarı. Sonda tasarımı ve düşük miktarda RNA hedeflerinin tespiti için hazırlanması için, Raj ve Tyagi 23 ile makaleye bakın. Dikkate alınması gereken bir başka konu permeabilizasyon adımdır. Farklı permeabilizasyon durumuyla ilgili dikkatli bir değerlendirme gereklidir; Örneğin, bizim protokol açıklanan olandan daha hafif etkileri tespit 15 sonra permeabilization ile oluşabilir. Çeşitli permeabilizasyon prosedürleri de farklı hücre tipleri kullanılarak immün-FISH yaparken dikkat edilmesi gereken. immunfloresan ve RNA FISH sırası da bağışıklık FISH ile hedef proteinlerin, değişiklikler, ve RNA tespiti etkileyebilir. RNA BALIK gerçekleştirmek iseed önce Immünofloresan için, RNA BALIK segmentinde sırasında bir saatlik inkübasyon Xist RNA sinyal tespit etmek yeterlidir. Hibridizasyon tamponu ve FISH yıkama tamponu bulunan formamıd olumsuz H3K27me3 immünoflüoresans etkiler çünkü Ancak, biz her zaman bu protokol Xist RNA FISH önce H3K27me3 immünoflüoresans yürütmek. Diğer uygulamalar için, hedef proteinler ve epigenetik değişiklikler bağlıdır prosedürlerle sırası bağışıklık uyması gereken. Biz H3K27me3 Immünofloresan için kullanılan birincil antikor H3K27me3 24 yüksek bir titreye ve özgüllüğü, biz immünofloresans için kısa inkübasyon süresi kullanmak mümkün. Bununla birlikte, reaksiyon süresi ve immün için, sıcaklık, kullanılan antikora bağlı olduğu ve bu nedenle en iyi duruma getirme her bir antikor için gereklidir.

Oligonükleotid probları kullanarak, RNA FISH ile Xist RNA algılama düzelme olduğu saptandı. Daha önceki çalışmalarda, bulduğumuz bu dif bir alt kümesiXi H3K27me3 boyama ile ferentiating hücreler Xist RNA sinyali 25 ile ilişkili değildir. Xi H3K27me3 değişiklik Xist RNA 9 ile PRC2 işe ilişkili olduğundan - 11, 26, biz bu immünofloresans için antikor göre çekirdeklerin içine riboprobes verimsiz penetrasyon nedeniyle olduğunu iddia. Bu protokolde oligonükleotid problar kullanarak, neredeyse her zaman Xist RNA (Şekil 1) ile birlikte lokalize dişi hücrelerin ayırt o H3K27me3 sinyalini gözlendi.

Bu hızlı bağışıklık BALIK protokolü bize Xist lncRNA etrafında dönen dinamik değişikliklerin bir anlık kazanç sağlar ve lncRNA işleri şekilde bir anlayışa yardımcı olmak için yeni bir araç sunuyor. Böyle genomik imprinting, gen düzenlemesi, RNA çeviri ve RNA olgunlaşması 27 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları etkileyen IncRNAs. Farklı rolü artmış anlayış geliştirmekileri alanını itmek ve insan vücudunun içinde yaşamsal hücresel süreçlerin düzenlenmesinde gelecek keşifler için izin, yanı sıra hastalık tedavileri için potansiyel hedefler gelişimine katkıda yardımcı olacağını lncRNA tarafından oynanan s. Bu protokol kolayca diğer belirteçlerin ve ilgi lncRNAs göre optimize edilebilir olduğundan, hücrelerde çeşitli lncRNAs sırlarını mücadele yardımcı olmak için harika bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Xp1 ggtaagtatccaaaaccccgttgg
Xp2 cgatcagcagcaacagtacacg
XP3 gcaattggttgcttttatccagtcc
XP4 cgcaacaccgcacactaatacg
Xp5 gccatcttagacacattcaagagcat
XP6 cacacgtgaagtaccaagcgaaac
Xp7 gccacgtatagagcactgtaagagactatg
XP8 caaagcacactatcagacgtgtcg
Xp9 ggagaatctagatgccataaaggcaag
XP10 tgatggacactgcattttagcactg
Xp11 ggacactgcattttagcaatacgattc
Xp12 gtgatgggcactgcattttagc
Xp13 agatgggctatctcagtcttataggct
XP14 ggaagtcagtatggagggggtatg
Xp15 tgggactgtgactactacagcaatga
Xp16 aagactcaattcctagtcaggattatccac
Xp17 gggctgtagctctatgacagtgcttt
Xp18 gtcttcaccagatgcagattactacagtg
XP19 aatagtttgaggaaggggtttcaagtg
XP20 gctgttcaggtttccttctgtagtga
Xp21 gcaagagatacaatggtccgaaaagt
Xp22 agcacttcgtacaaccctctttctg
Xp23 gaagagagcaggtcattcgtcagag
XP24 gcaactgagacactgtagccatatgaag
XP25 ttcctggaggaagaacggaaaga
Xp26 tgattagaaggcttaggtcatcttcca
XP27 ttttgttcagagtagcgaggacttga
Xp28 aatagagcagaatggcttcctcgaa
Xp29 acattgcttgatcacgctgaagac
XP30 gcaaggaagaaatagacacacaaagc
XP31 ggaagaaatagatgtaacaaagaattagacaca
XP32 cacttcagagccacttgaatcctg
Xp33 agtcacaggtgtcctgtagaaacagttc
Xp34 cctttatgggcaatggcaacaat
Xp35 ggcacatctgcatattgcttgtcta
XP36 gcaactaagaccatgaacccacaa
Xp37 aaacacactggccttaagtatatggactg
Xp38 cattcatttgcacacatggaacaat
Xp39 tgggagacaatatttagcctccaggt
Xp40 cctagcaagggcactgttttgtaataa
Xp41 taacatttagcacactgccttgcac
Xp42 cagtgatctacactaggtccacctcaca
Xp43 ttatgttgaaggaatcttggccttg
Xp44 aagtgagagctgtagtctcaaggtgtga
Xp45 gtattcaacctctgaggcaaactgtg
Xp46 agattgtggaacttagatggctgtca
Xp47 tggaactgcattaaagtcccaacttag
Xp48 gaactcccagacctcttcaacctg
Name Company Catalog Number Comments
oligonucleotides with 5’-amino modification IDT
Alexa Fluor 488 Reactive Dye Life Technologies A32750
MicroSpin G-25 columns GE Healthcare 27-5325-01
Cytospin 2 Shandon 59900102
Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) Roche 10715859103
Histone H3K27me3 antibody Active Motif 61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed Life Technologies A21424
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36931

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

Tags

Genetik Sayı 93 Xist X-kromozomu inaktivasyonu BALIK histon metilasyonu epigenetik uzun olmayan kodlama RNA
Hızlı Floresan<em&gt; In Situ</emX-kromozomu İnaktivasyonu içinde histon Modifikasyon İmmünofloresan ile Xist RNA Kombine için&gt; Hibridizasyon Protokolü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yue, M., Charles Richard, J. L.,… More

Yue, M., Charles Richard, J. L., Yamada, N., Ogawa, A., Ogawa, Y. Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation. J. Vis. Exp. (93), e52053, doi:10.3791/52053 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter