גזירה האוסטאוקלסטים מעכבר מח עצם

Summary

Osteoclasts הוא תא resorbing-עצם העיקרי בגוף. יכולת לבודד osteoclasts במספרים גדולים הביאה התקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לבידוד, טיפוח וכימות פעילות האוסטאוקלסטים במבחנה.

Abstract

Osteoclasts הם תאים מאוד מיוחדים שנובעים משושלת מונוציטים / מקרופאג של מח העצם. היכולת הייחודית שלהם לנספגות שוב שני מטריצות אורגניות ואי-אורגניות של עצם משמעות הדבר היא כי הם משחקים תפקיד מפתח בויסות שיפוץ שלד. יחד, osteoblasts וosteoclasts אחראים לתהליך הצימוד הדינמי שכולל גם ספיגת עצם ויצירת עצם פועלת יחד כדי לשמור על השלד הנורמלי במהלך מחלה ובריאות.

כתא resorbing-העצם העיקרי בגוף, שינויים בבידול האוסטאוקלסטים או פונקציה יכולים לגרום להשפעה עמוקה בגוף. מחלות הקשורות לתפקוד האוסטאוקלסטים שינה יכולים טווח חומרת מחלה בילוד קטלנית עקב אי ליצור חלל מוח לhematopoiesis, לנצפתה יותר בכינוי פתולוגיות כגון אוסטאופורוזיס, שבו ספיגת עצם osteoclastic מוגזמת לתשומה כדי לשבר היווצרות.

אף אוזן גרון "> יכולת לבודד osteoclasts במספרים גבוהים במבחנה אפשרה להתקדמות משמעותית בהבנה של מחזור שיפוץ עצם וסללה את הדרך לגילוי של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות שמאבק במחלות אלו.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבודד ולטפח osteoclasts ממח העצם של עכבר שיניב מספר גדול של osteoclasts.

Introduction

שיפוץ עצם הוא דינמי וכרוך בצימוד של יצירת עצם עם ספיגת עצם ^1. תהליך חוזקה מוסדר זו הוא אחראי לשמירה על השלד במהלך הומאוסטזיס נורמלי, ובתגובה לפציעה ומחלה.

Osteoclasts הם תאים ייחודיים, multinucleated המסוגלים resorbing שתי מטריצות אורגניות ואי-אורגניות של עצם. Osteoclasts נגזרים משושלת מונוציטים / מקרופאג של מח עצם ^2-5. ליקויים בתפקוד או ההיווצרות של osteoclasts יכולים לגרום למגוון רחב של פתולוגיות קליניות, כוללים מצבים שכיחים כמו אוסטאופורוזיס.

היכולת ליצור osteoclasts במבחנה אפשרה להתקדמות משמעותית בהבנה של ביולוגיה עצם ^6. כתוצאה מכך, סוכנים טיפוליים חדשים צצים לטיפול במחלות הקשורות להאוסטאוקלסטים אשר אחראים על תחלואות ותמותה משמעותיות של ⁷ 8,9. הומאוסטזיס העצם משתנה במספר המחלות, כוללים אוסטאופורוזיס לאחר גיל מעבר, שבו פעילות מוגברת האוסטאוקלסטים מובילה לאובדן פתוגניים של מסת עצם וצפיפות ^10. עם עלייה בזמינות של דגמים עכבריים מהונדסים של מחלות בבני אדם, יש יותר הזדמנות לפענח את התפקיד של osteoclasts במחלת עצם אנושי ^11-13.

פרוטוקולים רבים לטכניקות culturing האוסטאוקלסטים מופיעים בספרות, בוריאציות רבות תיארו ^9,12,14. Xing ועמיתיו מתארים שיטה דומה לפרוטוקול מתואר להלן, בתיאורם של מבחני osteoclastogenic מתאי מח עצם עכבריים. עם זאת כדי לשחרר את תאי מח העצם הבאים קציר עצם ארוך, Xing לשטוף et al. העצם חלול בתקשורת מלאה α ממ^14. Catalfamo בוחן את ההשפעה של היפרגליקמיה על תפקוד האוסטאוקלסטים ומתאר שיטה שבה כל התאים מגויסים על ידי שטיפת מוח עצם בתרבית למשך 24 שעות, ובנקודה שאינם חסיד התאים מבוטלים ^12, טכניקה המשמשת גם על ידי בויל אח ' . ⁹ פרוטוקולים שפורסמו בעבר אלה מחייבים את הנוהג של שטיפת מוח העצם, תרגול מייגע, שגם מציג את הסיכון לפגיעת מחט מקל ואובדן מח עצם יקר, כאחד חייב לחתוך את שני הקצוות של העצם. הפרוטוקול, שאנו מתארים, מיישם את השימוש במכתש ועלי כדי לבודד osteoclasts, שהוא דומה לשיטה של בידוד מקרופאג שתואר על ידי et Weischenfeldt אל. ¹⁵

הניסיון שלנו, לעומת זאת, הוא שבידוד האוסטאוקלסטים ובתרבות חוץ גופית באמצעות תוצאות טכניקות שפורסמו בעבר בתוצאות משתנים במונחים של ייצור האוסטאוקלסטים, ופעמים רבות תוצאהבחוסר יכולת לטפח osteoclasts. לכן, אנו פיתחנו פרוטוקול המאפשר לבידוד העקבי של מח עצם עכבר כדי לייצר מספר גדול של osteoclasts multinucleated במבחנה, עם תשואה של כ 70-80% מתאים בתחילה מצופים יוצר מקרופאגים ולאחר מכן osteoclasts, בנוכחות תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים.

Protocol

הערה: הצהרה אתית: כל המחקר מעורב בעלי חיים בעלי חוליות בוצע בפרוטוקולים בהתאם אושרו על ידי אוניברסיטת סטנפורד המנהלית הלוח במעבדת טיפול בבעלי חיים (APLAC).

1. הכנה

1. שלו 10 מיליליטר של תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות זמינה מסחרי (המכילה diatrizoate polysucrose ונתרן, מותאם לצפיפות של 1.077 גר '/ מיליליטר) לבוא לRT בצינור חרוטי 50 מיליליטר.
2. הכן cytometry זרימה (FACS) חיץ עם פוספט 1x סליין (PBS) ו- 2% עוברי עגל בסרום (FCS). קח aliquot 50 מ"ל ולשמור aliquot זה ב RT לשימוש במהלך שלב תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות.
3. יש לי דלי הקרח מוכן כדי לשמור על רקמה מבודדת ותאים בבמהלך הליך הבידוד.

2. הכן תרבות מדיה

1. הכן תקשורת בסיסית: ממ (בינוני חיוני מינימאלי), ללא פנול אדום (500 מיליליטר), גלוטמט (1x), FCS (10x), 10,000 יחידות / מיליליטר penicillin (1x).
2. סנן תקשורת בסיסית עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
3. הכן תקשורת האינדוקציה מקרופאג מח עצם:
   1. קח 50 מיליליטר של התקשורת הבסיסית מוכנה בשלב 2.1.
   2. להוסיף פרוסטגלנדין E2 (PGE2, ז מר 352.465 / mol) בשעה 10 ^-7 ריכוז סופי M.
   3. להוסיף מקרופאג-מושבה מגרה פקטור (M-CSF) בשעה 10 ng / ml.
   4. אל תסנן את הפתרון הסופי של מקרופאג מח עצם גירוי תקשורת.
4. הכן תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים:
   1. קח 50 מיליליטר של התקשורת הבסיסית מוכנה בשלב 2.1.
   2. להוסיף פרוסטגלנדין E2 (PGE2, ז מר 352.465 / mol) בשעה 10 ^-7 ריכוז סופי M
   3. להוסיף מקרופאג-מושבה מגרה פקטור (M-CSF) בשעה 10 ng / ml.
   4. להוסיף RANKL ב 10 ng / ml.
   5. אל תסנן את הפתרון הסופי של תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים.

בידוד 3. מח העצם

1. להרדים C57BL עכבר אחד / 6בשיטת שאיפת פחמן דו חמצני, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
   הערה: מכרסמים חייבים להיות מורדמים על ידי צוות מיומן תוך שימוש בטכניקה, ציוד וסוכנים מתאימים.
2. עמדה ולאבטח את העכבר על לוח לנתיחה ולרסס עם אלכוהול 70%.
3. לנתח את עצמות הירך, tibiae, humeri ועמוד השדרה.
   1. תתחיל עם העכבר במצב שכיבה. עושה חתך אנכי לאורך הגפה התחתונה ולהתחיל לנתח לאורכו של עצם הירך ועצם השוק על ידי חלוקת קבצים מצורפים רקמות רכות. לבסוף, לנקוע עצמות ממפרק הברך והירך לשחרר עצמות באופן מלא מהשלד.
   2. המשך לעשות חתך לאורכו של האיבר העליון לבודד את הזרוע. לנקוע הקרסול במפרקי כתף ומרפק ידי לנתח קובץ מצורף קופסית רקמה רכה.
   3. לבסוף, להפוך את העכבר מעל, כך שהעכבר שכובה פרקדן. לעשות חתך בעור לאורכו של עמוד השדרה, בקו האמצע. שים לב הרך ליד חוליות עמוד שדרהרקמה בכל צד של עמוד השדרה ולַחתוֹך לאורך הקצה הגרמי של עמוד השדרה, לנתח באמצעות מסת הרקמה הרכה ליד חוליות עמוד השדרה. בעזרת מספריים, לעשות חתך אופקי על פני עמוד השדרה בבסיס הצוואר, ובסופו של עמוד השדרה, רק הפרוקסימלי להחדרת הזנב, לשחרר את עמוד השדרה מקובץ מצורף רקמות רכות.
4. ברגע שהעצמות נקצרים, לשמור אותם במאגר FACS על קרח.
5. השתמש בנייר טישו כדי לנקות שרירים ורקמות רכות מהעצמות.
6. הנח את העצמות ניקו למכתש ועלי עם 3 מיליליטר של חיץ FACS.
7. לרסק את העצמות בעדינות במכתש ועלי.
8. לשאוב את הנוזל מוכתם בדם ולהעביר לתוך צינור 50 מיליליטר חרוטי על ידי העברת הפתרון דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
9. הוסף 5 מיליליטר FACS חיץ עד לשד העצמות המרוסקים ולמחוץ נוסף. שוב, להסיר את הנוזל בעזרת פיפטה ולהעביר לצינור חרוטי 50 מיליליטר דרך מסננת 70 מיקרומטר.
10. בדרך כלל לרסק את השפה טווית עצמותce עד שלוש פעמים במאגר FACS טרי, בעזרת מכתש ועלי, בכל פעם מוסיפה 5 מיליליטר נוסף של חיץ FACS הטרי, עד שהנוזל לא כתם אדום.
11. צנטריפוגה פתרון מח העצם ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להניב תא גלולה.

4. הפרדת צבע של תאי מח העצם

1. לשאוב supernatant וגלול ב 10 מיליליטר של חיץ FACS (שמרו על RT).
2. קח את צינור חרוטי 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של תקשורת זמינה מסחרי הפרדת תא שיפוע צפיפות (RT).
3. שכבת פתרון מח עצם על תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות. לעשות זאת באמצעות פיפטה חשמלית לאט. זווית קצה פיפטה כנגד המשטח הפנימי בחלקו העליון של צינור חרוטי ולהטות את צינור חרוטי לכ -30 מעלות. שימוש בהגדרת מהירות איטית בפיפטה, בעדינות לגרש את פתרון מח עצם כדי שלא להפריע לתקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות.
   הערה: בסופו של יהיולהיות הגדרה ברורה בין שני הפתרונות (פתרון סלולארי ופתרון תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות).
4. באמצעות צנטריפוגות RT, צנטריפוגות תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות ופתרון תא בצנטריפוגה מאוזנת ב XG 200 במשך 15 דקות. בנוסף, להסיר את האצה ההאטה בצנטריפוגות כדי להבטיח הפרדה פאזות נאותה באמצעות שיפוע תקשורת הפרדת תא שיפוע צפיפות.
5. לאחר צנטריפוגה, לשאוב את השכבה האמצעית מעונן המכילה את תאי מח עצם של עניין.
6. העבר את התאים האלה לתוך צינור חרוטי חדש. להוסיף 20 מיליליטר של חיץ נוסף FACS (שמר על קרח) כדי לשטוף את התאים.
7. צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להניב תא גלולה.
8. Resuspend גלולה תא הסופי ב1ml של מקרופאג גירוי תקשורת, כדי לאפשר ספירת תאים באמצעות hemocytometer.

ספירת 5. תא

1. קח 10 μl של פתרון התא ומערבביםעם 10 μl של trypan כחול. טען 10 μl של תמהיל התוצאה על hemocytometer ולהשיג את ספירת תאים לכל מיליליטר של תמיסה.

Culturing 6. הנייד

1. מקום 2 מיליליטר של תקשורת מקרופאג גירוי לבאר כל צלחת 24 גם.
2. להוסיף 200,000 תאים היטב כל אחד.
   הערה: מניסיוננו, צפיפות תאי ציפוי היא אחת הדרישות החשובות ביותר עבור נאות בתרבית במבחנה של osteoclasts.
3. בעדינות להתסיס את הצלחת ומניחים בחממה רגילה על 37 מעלות צלזיוס.
4. לא לשנות את התקשורת במשך 3 ימים.
5. אחרי 3 ימים בתקשורת מקרופאג גירוי, לשנות את התקשורת לתקשורת האוסטאוקלסטים.
6. מכאן והלאה, לשנות את התקשורת מדי יום במשך 5-7 ימים, ובשלב זה, osteoclasts הגדול, multinucleated צריך להיות גלוי על צלחת התרבות.

7. צביעה עם Tartrate עמיד החומצה phosphatase (TRAP)

1. לאחר 5-7 ימים של במבחנה רחוב ללא מוצאמכשור, לשאוב את התקשורת מהתרבות היטב.
2. לשטוף את הבארות בעדינות עם פעמים PBS שלוש 1x.
3. תקן את התאים על ידי הוספת 4% פתרון paraformaldehyde ולהשאיר למשך שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס.
4. במהלך תקופה זו, להכין את כתם המלכודת (שהוא זמין באופן מסחרי) על ידי התחממות מראש ל -37 מעלות צלזיוס.
5. לאחר שעה 1 בparaformaldehyde, לשאוב את paraformaldehyde ולשטוף בעדינות 3 פעמים עם 1X PBS.
6. הוסף 1 מיליליטר של כתם מלכודת מראש חימם לבאר כל הצלחת להיות מוכתם.
7. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, מוגן מפני אור.
8. אחרי שעה 1, לשאוב את כתם TRAP.
9. לשטוף את הבארות 3 פעמים עם מים ללא יונים מחוממים מראש.
10. Counterstain היטב עם Hematoxylin של גיל (זהירות) ל1-2 דקות.
11. osteoclasts תמונה באמצעות מיקרוסקופ שדה הבהיר.
12. לשטוף בארות עם מים ללא יונים עד עוצמת צבע מספקת של הכתם מושגת, בדרך כלל, כאשר גרעינים מופיעים Bluדואר.

8. האוסטאוקלסטים הספיגה Assay

1. השתמש בצלחת תרבות קלקר 24 גם זמינה מסחרי שהיא מראש מצופה גם עם מצע עצם או ציפוי גבישי סידן זרחה אי-אורגני.
2. מקום 2 מיליליטר של תקשורת מקרופאג גירוי לכל אחד.
3. להוסיף 200,000 תאי מח עצם מבודדים טרי שהושגו בסופו של שלב 2 זה טוב.
4. בעדינות להתסיס את הצלחת לפני הצבתו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.
5. ביום 3, לשנות את התקשורת לתקשורת בידול האוסטאוקלסטים.
6. לבצע שינויי תקשורת יומיומיים עם תקשורת בידול האוסטאוקלסטים 5-7 ימים.

9. כימות האוסטאוקלסטים ספיגת הפעילות

1. לאחר 5-7 ימים של תרבות במבחנה בתקשורת בידול האוסטאוקלסטים על מצע mineralized, לנתח את פני השטח mineralized, כפי שיתואר להלן, על מנת להעריך את יכולתו של osteoclasts כדי ליצור resorptiעל בורות, אינדיקציה לפעילות osteoclastic.
2. תקשורת לשאוב מצלחת assay הספיגה ולהוסיף 10% פתרון אקונומיקה 100 μl היטב כל אחד.
3. דגירה התאים עם פתרון אקונומיקה 10% במשך 15 דקות ב RT.
4. לשטוף את הבארות 3 פעמים במים מזוקקים.
5. לשאוב את כל מים שנותרו ולהתנער ממים עודפים מהצלחת ולאפשר לאוויר יבש במשך 3-5 שעות.
6. Counterstain הצלחת עם ערכת צביעת פון Kossa זמינה מסחרי כדי לאפשר להדמיה קלה יותר של המצע-resorbed האו"ם.
7. השתמש במיקרוסקופ שדה הבהיר לקחת תמונות של חלקי נציג של פני השטח resorbed.
8. שימוש בתוכנת ניתוח תמונה, לחשב את אחוז שטח resorbed כדי לאפשר כימות של פעילות resorptive osteoclastic.

Representative Results

מטרתה של שיטה זו הייתה לבודד בקלות מספר רב של osteoclasts במבחנה, בדרך כלל בשבוע אחד. בידוד מוצלח של מספר רב של osteoclasts אושר באמצעות מכתים tartrate עמיד phosphatase החומצה (איור 1 א). osteoclasts גדול הם דמיינו כתאים סגולים גדולים עם גרעינים רבים (בדרך כלל ≥ 3 גרעינים). שימוש בפרוטוקול זה, זה נפוץ לבודד osteoclasts עם כ -30 גרעינים להאוסטאוקלסטים (איור 1).

שימוש במשטח mineralized נחשב שיטת תקן הזהב להערכת פעילות resorptive האוסטאוקלסטים במבחנה. באמצעות שיטה זו, אחוז משטח mineralized, או "בורות ספיגה" שיצר מאפשרת לקביעת קיבולת resorptive האוסטאוקלסטים (איור 2).

_upload / 52,056 / "width =" 52056fig1highres.jpg 500 "/>
צביעת איור 1. (א) Tartrate חומצה עמידה phosphatase של מח עצם בתרבית הבאה 10 ימים בתרבות בתנאים אינדוקטיביים האוסטאוקלסטים. מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה 10x מדגים osteoclasts מרובה גדול, multinucleated כי הם מלכודת (כתמים סגולים) חיוביים. דוגמה להאוסטאוקלסטים גדול, multinucleated מתואר על ידי קו מקווקו אדום. מיקרוסקופ שדה (ב) מואר בהגדלה 10x מפגינה האוסטאוקלסטים חיובי גדול, multinucleated, TRAP. דוגמא לגרעין בתוך האוסטאוקלסטים multinucleated מוצגת על ידי החץ האדום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. מיקרוסקופ שדה מואר בהגדלה 10x מדגים בורות ספיגה שהוקמה על ידי פעילות ספיגת osteoclastic. מטריצת Mineralized מוכתמת בכתם פון Kossa כדי לאפשר להדמיה. שחור קווים מקווקווים מתארים דוגמא לאזורי resorbed של מטריצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

יכולת לבודד בקלות ולטפח מספר גדול של osteoclasts במבחנה הייתה אחראית על סיוע לקידום הבנה של ביולוגיה עצם ומחלות תיווך האוסטאוקלסטים. זה היה זיהוי של RANKL שיובילו לכך, בעת שזוהה לאחרונה כרגולטור העיקרי של היווצרות האוסטאוקלסטים, בידול והישרדות ^16-18.

זה היה הניסיון שלנו כי הטיפוח במבחנה של osteoclasts ממח עצם תלוי במידה רבה בצפיפות זריעה. הבחנו כי כישלון של פרוטוקול זה כדי להניב osteoclasts הוא בדרך כלל עקב צפיפות זריעה הכי מוצלחת כאשר ציפוי תאים שמקורם במח עצם. כך, בפרוטוקול זה, מומלץ לזרע 200,000 תאים לכל צלחת 24 גם כן. יתר על כן, על מנת להשיג הצלחה מקסימלית עם טכניקה זו, מומלץ להכין את תקשורת האינדוקציה האוסטאוקלסטים בדיוק כפי שתואר לעיל ולשנות את התקשורת ביםזמן ame בכל יום, לאחר 3 הימים הראשונים שבם לא צריך להפריע לתרבות צלחות. הדבר עשוי לאפשר ריכוז קבוע של גורמי תקשורת אינדוקציה האוסטאוקלסטים. בנוסף, מצאנו כי השימוש בחומרים כימיים מסוימים גם מאפשר פוטנציאל גדול יותר לculturing של מספר הגדול של osteoclasts multinucleated.

טכניקה זו היא מוגבלת על ידי הזמינות של צנטריפוגות RT, שבו אפשר לשנות את פרמטרים של האצה האטה ורכש של חומרים כימיים מסוימים. זה אחרת פרוטוקול מאוד פשוט, שבה היה לנו הרבה הצלחה, במגוון רחב של עכברים ברמות שונים של גיל ורקע גנטי (למשל, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, db LEP - / -).

טכניקה זו מציעה שיטה אמינה ליצירת osteoclasts במבחנה ולקבוע את היכולת שלהם נספגת שוב מטריצת mineralized. שימוש בפרוטוקול זה, ניתן לבודד מספר גדול של osteoclasts multinucleated בvitro בדרך כלל בשבוע אחד. הניסיון שלנו הוא שבידוד האוסטאוקלסטים ובתרבות חוץ גופית באמצעות תוצאות טכניקות שפורסמו בעבר בתוצאות משתנים מאוד במונחים של ייצור האוסטאוקלסטים, ופעמים רבות תוצאת חוסר יכולת לטפח osteoclasts ^9,12,14.

הפונקציה האוסטאוקלסטים היא מורכבת וספיגת עצם היא תהליך מתוזמר ביותר שמתווך ברמה המקומית על ידי הצטלבות בין osteoblasts וosteoclasts ^19. בנוסף לשליטה המקומית של איזון עצם, מתעורר ראיות מצביע על כך שהפעילות האוסטאוקלסטים נשלטת באופן מערכתי על ידי גורמים הקשורים למערכת חיסונית, עצבי, וגורמים שיטתיים אחרים ^20-24.

כהבנה של ביולוגיה האוסטאוקלסטים ממשיכה להתקדם במהירות, ובכלל זה תפקידם השונים בתהליכים הנעים בין שיפוץ עצם לתפקידם בויסות גרורות סרטן לעצם ^25-27, פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים למורכביםently לבודד כמויות גדולות של osteoclasts במבחנה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200-038
M-CSF, recombinant mouse	Gibco	PMC2044
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)	R&D Systems	462-TEC-010
Prostaglandin E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates	Corning Life Sciences	3987