Summary
Los osteoclastos son las células de resorción ósea principal en el cuerpo. La capacidad para aislar los osteoclastos en grandes cantidades ha resultado en avances significativos en el entendimiento de la biología de los osteoclastos. En este protocolo, se describe un método para el aislamiento, cultivo y la cuantificación de la actividad de los osteoclastos in vitro.
Abstract
Los osteoclastos son células altamente especializadas que se derivan del linaje de monocitos / macrófagos de la médula ósea. Su capacidad única para reabsorber tanto las matrices orgánicas e inorgánicas de hueso significa que juegan un papel clave en la regulación de la remodelación esquelética. Juntos, los osteoblastos y los osteoclastos son responsables para el proceso de acoplamiento dinámico que implica tanto la resorción ósea y la formación ósea actuando juntos para mantener el esqueleto normal durante la salud y la enfermedad.
Como la célula de resorción ósea principal en el cuerpo, los cambios en la diferenciación o la función de los osteoclastos pueden resultar en efectos profundos en el cuerpo. Enfermedades asociadas con la función de los osteoclastos alterada pueden variar en severidad de la enfermedad neonatal letal debido a un fallo para formar un espacio para la hematopoyesis de la médula, a patologías tales como la osteoporosis, en la que la resorción ósea osteoclástica excesiva predispone a la fractura de la formación observado más comúnmente.
ent "> Una capacidad de aislar los osteoclastos en grandes cantidades in vitro ha permitido avances significativos en la comprensión del ciclo de remodelación ósea y ha allanado el camino para el descubrimiento de nuevas estrategias terapéuticas que combaten estas enfermedades.A continuación, describimos un protocolo para aislar y cultivar los osteoclastos de médula ósea de ratón que producirá un gran número de osteoclastos.
Introduction
El remodelado óseo es dinámico e implica el acoplamiento de la formación de hueso con la resorción ósea 1. Este proceso estrechamente regulado es responsable de mantener el esqueleto durante la homeostasis normal, y en respuesta a la lesión y la enfermedad.
Los osteoclastos son células multinucleadas únicos, que son capaces de resorción tanto las matrices orgánicas e inorgánicas de hueso. Los osteoclastos se derivan del linaje de monocitos / macrófagos de la médula ósea 2-5. Las anormalidades en la función o la formación de osteoclastos puede resultar en una variedad de patologías clínicas, incluyendo las condiciones comunes como la osteoporosis.
La capacidad de generar los osteoclastos in vitro ha permitido importantes avances en nuestra comprensión de la biología del hueso 6. Como resultado, los nuevos agentes terapéuticos están surgiendo para tratar enfermedades relacionadas con osteoclastos que son responsables de morbilidades y mortalidades significativas 7 8,9. La homeostasis ósea está alterado en un número de enfermedades, incluyendo la osteoporosis post-menopáusica, en el que aumentó la actividad de los osteoclastos conduce a la pérdida patógena de masa y densidad ósea 10. Con el aumento de la disponibilidad de modelos murinos transgénicos de enfermedades humanas, hay más oportunidades para descifrar la función de los osteoclastos en la enfermedad ósea humana 11-13.
Numerosos protocolos para técnicas de cultivo de osteoclastos aparecen en la literatura, con muchas variaciones describen 9,12,14. Xing y sus colegas describen metodología similar con el protocolo descrito a continuación, en su descripción de los ensayos de osteoclastogenic a partir de células de médula ósea murina. Sin embargo, para liberar las células de la médula ósea después de la cosecha de los huesos largos, Xing et al. Enjuagar la cavidad ósea con α-MEM medio completo14. Catalfamo examina el efecto de la hiperglucemia sobre la función de los osteoclastos y describe un método en el que todas las células movilizadas por lavado de la médula ósea se cultivan durante 24 h, momento en el cual las células no adherentes se descartan 12, una técnica también utilizada por Boyle et al . 9 Estos protocolos publicados anteriormente requieren la práctica de lavado de la médula ósea, una práctica tediosa, que también introduce el riesgo de una lesión por pinchazo de aguja y la pérdida de valiosa médula ósea, como se debe cortar en ambos extremos del hueso. El protocolo, que se describen, implementa el uso de un mortero y mano de mortero para aislar los osteoclastos, que es similar al método de aislamiento de macrófagos descrito por Weischenfeldt et al. 15
Nuestra experiencia, sin embargo, es que el aislamiento de los osteoclastos y cultivo in vitro usando técnicas de resultados previamente publicados en los resultados variables en términos de producción de los osteoclastos, resultando a menudoen una incapacidad para cultivar los osteoclastos. Por lo tanto, hemos ideado un protocolo que permite el aislamiento consistente de médula ósea de ratón para producir un gran número de osteoclastos multinucleados in vitro, con un rendimiento aproximado del 70-80% de células sembradas inicialmente la formación de macrófagos y osteoclastos, posteriormente, en presencia de medios de inducción de los osteoclastos.
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Protocol
NOTA: Declaración de Ética: Toda la investigación con animales vertebrados se realizó en los protocolos de Accordance aprobados por el grupo administrativo de expertos de Stanford en Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC).
1. Preparación
- Permitir 10 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad disponible comercialmente (que contiene polysucrose y diatrizoato de sodio, ajustadas a una densidad de 1,077 g / ml) para llegar a RT en un tubo cónico de 50 ml.
- Preparar citometría de flujo (FACS) de tampón de fosfato 1x con solución salina tamponada (PBS) y suero de ternera fetal al 2% (FCS). Tomar una parte alícuota de 50 ml y mantener esta alícuota a temperatura ambiente para su uso durante el paso de los medios de separación de células en gradiente de densidad.
- Tener un cubo de hielo listo para mantener el tejido y las células aisladas durante el procedimiento de aislamiento.
2. Prepare Medios de Cultivo
- Preparar medio basal: MEM (medio esencial mínimo), sin rojo de fenol (500 ml), glutamato (1x), FCS (10x), 10.000 unidades / ml penicillin (1x).
- Filtra medio basal con un filtro de 0,22 micras.
- Preparar los medios de comunicación de la médula ósea de los macrófagos de inducción:
- Tomar 50 ml de los medios basales preparado en la etapa 2.1.
- Añadir prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352.465 g / mol) a 10 -7 M concentración final.
- Añadir macrófagos factor estimulante de colonias (M-CSF) a 10 ng / ml.
- No filtrar la solución final de los macrófagos de médula ósea estimulando los medios de comunicación.
- Preparar los medios de inducción de los osteoclastos:
- Tomar 50 ml de los medios basales preparado en la etapa 2.1.
- Añadir prostaglandina E2 (PGE2, Sr. 352.465 g / mol) a 10 -7 M concentración final
- Añadir macrófagos factor estimulante de colonias (M-CSF) a 10 ng / ml.
- Añadir RANKL a 10 ng / ml.
- No filtrar la solución final de los medios de inducción de los osteoclastos.
3. Aislamiento de Médula Ósea
- La eutanasia a un ratón C57BL / 6usando el método de inhalación de dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical.
NOTA: Los roedores deben ser sacrificados por personal capacitado utilizando una técnica, equipos y agentes apropiados. - Coloque y asegure el ratón sobre una tabla de disección y rociar con alcohol al 70%.
- Diseccionar el fémur, la tibia, el húmero y la columna vertebral.
- Comience con el ratón en la posición supina. Hacer una incisión vertical a lo largo de la extremidad inferior y comenzar mediante la disección a lo largo de la longitud del fémur y la tibia dividiendo los archivos adjuntos de tejidos blandos. Por último, dislocar huesos de la articulación de la rodilla y de la cadera para liberar a los huesos del esqueleto completo.
- Proceder a realizar una incisión a lo largo de la longitud de la extremidad superior para aislar el húmero. Dislocar el húmero en las articulaciones del hombro y del codo mediante la disección suave inserción capsular tejido.
- Por último, gire el ratón sobre, por lo que el ratón está en decúbito prono. Hacer una incisión en la piel a lo largo de la longitud de la columna vertebral, en la línea media. Observe el suave paravertebraltejido en cada lado de la columna vertebral y de incisión a lo largo del borde óseo de la columna vertebral, la disección a través de la masa de tejido blando paravertebral. Usando unas tijeras, hacer un corte horizontal a través de la columna vertebral en la base del cuello, y al final de la columna vertebral, justo proximal a la inserción de la cola, liberando la columna vertebral de la fijación del tejido blando.
- Una vez que los huesos se cosechan, mantenerlos en tampón FACS en el hielo.
- Utilice un pañuelo de papel para limpiar el músculo y los tejidos blandos de los huesos.
- Coloque los huesos limpios en un mortero con 3 ml de tampón FACS.
- Aplastar los huesos suavemente en el mortero.
- Aspirar el líquido manchado de sangre y la transferencia en un tubo cónico de 50 ml pasando la solución a través de un filtro de células de 70 micras.
- Añadir 5 ml de tampón FACS al hueso triturado y aplastar aún más. Una vez más, extraer el líquido con una pipeta y transferir al tubo cónico de 50 ml a través de un filtro de 70 micras.
- Normalmente aplastar el twi huesosce a tres veces en tampón FACS fresco, utilizando un mortero y mano de mortero, añadiendo cada vez otros 5 ml de tampón de FACS fresca, hasta que el líquido no mancha roja.
- Centrifugar la solución de médula ósea a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para producir un sedimento celular.
4. Separación de degradado de células de médula ósea
- Aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 ml de tampón de FACS (mantenida a temperatura ambiente).
- Tome el tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de medio de separación de células en gradiente de densidad disponible comercialmente (RT).
- Capa de la solución de la médula ósea en los medios de separación de células en gradiente de densidad. Haga esto lentamente utilizando una pipeta eléctrica. Ángulo de la punta de la pipeta contra la superficie interior cerca de la parte superior del tubo cónico y inclinar el tubo cónico a aproximadamente 30 °. El uso de un ajuste de velocidad lenta en la pipeta, expulsar suavemente la solución de la médula ósea a fin de no perturbar el medio de separación de células en gradiente de densidad.
NOTA: En última instancia habráser una definición clara entre las dos soluciones (solución celular y medios de solución de separación de células en gradiente de densidad). - El uso de una centrífuga RT, centrifugar los medios de separación de células de gradiente de densidad y solución de células en una centrífuga equilibrada a 200 xg durante 15 min. Además, eliminar la aceleración y desaceleración en la centrífuga para garantizar la separación de fases adecuada utilizando el gradiente de densidad de gradiente de medios de separación de células.
- Después de la centrifugación, aspirar fuera de la capa media nublado que contiene las células de médula ósea de interés.
- Transferir estas células en un nuevo tubo cónico. Añadir 20 ml de tampón de FACS adicional (mantener en hielo) para lavar las células.
- Centrifugar a 200 xg durante 5 min a 4 ° C para producir un sedimento celular.
- Resuspender el sedimento celular final en 1 ml de macrófagos estimulante de los medios de comunicación para permitir el recuento de células usando un hemocitómetro.
5. Conteo Celular
- Tomar 10 l de la solución de células y mezclarcon 10 l de azul de tripano. Cargar 10 l de la mezcla resultante en un hemocitómetro y obtener el recuento de células por ml de solución.
El cultivo 6. celular
- Coloque 2 ml de medio de macrófagos estimulante en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Añadir 200.000 células a cada pocillo.
NOTA: En nuestra experiencia, la densidad celular de galvanoplastia es uno de los requisitos más importantes para la adecuada en el cultivo in vitro de los osteoclastos. - Agitar suavemente la placa y el lugar en una incubadora normal a 37 ° C.
- No cambie los medios de comunicación durante 3 días.
- Después de 3 días en los medios de comunicación de macrófagos estimulante, cambiar los medios de comunicación para medios de comunicación de los osteoclastos.
- De aquí en adelante, cambiar los medios de comunicación al día durante 5-7 días, y en ese momento, grandes osteoclastos multinucleadas, debe ser visible en la placa de cultivo.
7. La tinción con tartrato resistente a la fosfatasa ácida (TRAP)
- Después de 5-7 días de in vitro cultura, aspirar los medios de comunicación desde la cultura también.
- Lave los pozos suavemente con 1x PBS tres veces.
- Fijar las células mediante la adición de solución de paraformaldehído al 4% y se deja durante 1 hora a 4 ° C.
- Durante este tiempo, preparar la mancha TRAP (que está disponible comercialmente) por el pre-calentamiento a 37 ° C.
- Después de 1 hora en paraformaldehído, aspirar fuera de paraformaldehído y lavar suavemente 3 veces con PBS 1x.
- Añadir 1 ml de tinción TRAP pre-calentado en cada pocillo de la placa para ser teñido.
- Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 1 hora, protegida de la luz.
- Después de 1 hora, aspirar fuera de la mancha TRAP.
- Lavar los pocillos 3 veces con agua desionizada precalentada.
- Contratinción el bien con hematoxilina de Gill (PRECAUCIÓN) durante 1-2 minutos.
- Osteoclastos imagen usando microscopía de campo brillante.
- Lavar los pocillos con agua desionizada hasta una intensidad de color adecuada de la mancha se logra, típicamente cuando los núcleos aparecen blue.
8. La resorción de osteoclastos ensayo
- Utilice una placa de cultivo comercialmente disponible de poliestireno de 24 pocillos que se pre-recubrieron con sustrato óseo o un recubrimiento de fosfato de calcio cristalino inorgánico.
- Coloque 2 ml de medio de macrófagos estimulante en cada pocillo.
- Añadir 200.000 células de médula ósea recién aisladas obtenidos al final de la etapa 2 a cada pocillo.
- Agitar suavemente la placa antes de colocarlo en una incubadora a 37 ° C durante 3 días.
- El día 3, cambiar los medios de comunicación para medios de comunicación diferenciación de los osteoclastos.
- Realizar cambios de medios de comunicación diaria con los medios de comunicación diferenciación de los osteoclastos durante 5-7 días.
9. Cuantificación de osteoclastos Reabsorción Actividad
- Después de 5-7 días de cultivo in vitro en medios de diferenciación de los osteoclastos sobre un sustrato mineralizado, analizar la superficie mineralizada, como se describe a continuación, para evaluar la capacidad de los osteoclastos para formar resorptien pozos, un indicador de la actividad osteoclástica.
- Aspirar los medios de comunicación a partir de la placa de ensayo de resorción y añadir 100 l de solución de lejía al 10% a cada pocillo.
- Se incuban las células con la solución de lejía al 10% durante 15 min a TA.
- Lavar los pocillos 3 veces con agua destilada.
- Aspirar fuera de cualquier resto de agua y sacuda el exceso de agua de la placa y dejar secar al aire durante 3-5 horas.
- Contratinción la placa con un kit de tinción de Von Kossa disponible comercialmente para permitir la fácil visualización del sustrato un-reabsorbido.
- Utilice la microscopía de campo claro para tomar imágenes de partes representativas de la superficie reabsorbido.
- El uso de software de análisis de imagen, calcular el porcentaje de la superficie reabsorbido para permitir la cuantificación de la actividad de resorción osteoclástica.
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Representative Results
El objetivo de este método fue aislar fácilmente un gran número de osteoclastos in vitro, normalmente en una semana. Éxito en el aislamiento de un gran número de osteoclastos se confirmó mediante la tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato (Figura 1A). Las grandes osteoclastos se visualizan como células grandes de color púrpura con múltiples núcleos (normalmente ≥ 3 núcleos). Usando este protocolo, es común para aislar los osteoclastos con hasta 30 núcleos por los osteoclastos (Figura 1B).
Uso de una superficie mineralizada se considera el método estándar de oro de la evaluación de la actividad de resorción de osteoclastos in vitro. Usando este método, el porcentaje de superficie mineralizada, o "cavidades de resorción" que se han formado permite para la determinación de la capacidad de resorción de los osteoclastos (Figura 2).
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Figura 1. (A) resistente al ácido tartrato tinción fosfatasa de médula ósea cultivadas después de 10 días de cultivo en condiciones de inducción de los osteoclastos. Micrografía de campo brillante en un aumento de 10X demuestra múltiples osteoclastos multinucleadas grandes, que son TRAP (coloración púrpura) positivo. Un ejemplo de un grande, los osteoclastos multinucleados se describe mediante una línea discontinua de color rojo. (B) Micrografía de campo brillante en un aumento de 10X demostrando un gran, multinucleadas, osteoclastos TRAP positiva. Un ejemplo de un núcleo dentro de un osteoclastos multinucleados se muestra por la flecha roja. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 2. Micrografía de campo brillante en un aumento de 10X demuestra resorción piscinas formadas por la actividad de resorción osteoclástica. Matriz mineralizada se tiñe con Von Kossa mancha para permitir la visualización. El negro líneas discontinuas esbozar un ejemplo de zonas reabsorbidas de matriz. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
Una capacidad de aislar fácilmente y cultivar un gran número de osteoclastos in vitro ha sido responsable de ayudar a avanzar en la comprensión de la biología del hueso y los osteoclastos mediada por enfermedades. Era la identificación de RANKL que conducen a esto, cuando se identificó recientemente como el principal regulador de la formación de osteoclastos, la diferenciación y la supervivencia 16-18.
Ha sido nuestra experiencia que el cultivo in vitro de los osteoclastos de la médula ósea depende en gran medida de la densidad de siembra. Hemos observado que el incumplimiento de este protocolo para obtener los osteoclastos es normalmente debido a una densidad de siembra subóptimo cuando chapado células derivadas de médula ósea. Por lo tanto, en este protocolo, se recomienda sembrar 200,000 células por placa de 24 pocillos bien. Además, a fin de lograr el máximo éxito con esta técnica, se recomienda para preparar los medios de inducción de los osteoclastos, precisamente como se describe anteriormente y para cambiar los medios de comunicación en la stiempo ame cada día, después de los 3 primeros días en que uno no tiene que molestar a las placas de cultivo. Esto puede permitir una concentración constante de los factores de los medios de inducción de los osteoclastos. Además, hemos encontrado que el uso de reactivos específicos también permite un mayor potencial para el cultivo de un gran número de osteoclastos multinucleadas.
Esta técnica está limitada por la disponibilidad de una centrifugadora de RT, en la que uno puede alterar los parámetros y la adquisición de reactivos específicos de aceleración y deceleración. Es de lo contrario un protocolo muy sencillo, con la que hemos tenido mucho éxito, en una gama de ratones de diferente edad y antecedentes genéticos (por ejemplo, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, Lep db - / -).
Esta técnica ofrece un método fiable para generar los osteoclastos in vitro y para determinar su capacidad para reabsorber matriz mineralizada. El uso de este protocolo, es posible aislar un gran número de osteoclastos multinucleadas en Vitro típicamente en una semana. Nuestra experiencia es que el aislamiento de los osteoclastos y cultivo in vitro usando técnicas previamente publicados los resultados en resultados muy variables en cuanto a la producción de osteoclastos, a menudo resulta en una incapacidad para cultivar los osteoclastos 9,12,14.
Función de los osteoclastos es complejo y la resorción ósea es un proceso altamente orquestada que está mediada a nivel local por la diafonía entre los osteoblastos y osteoclastos 19. Además de control local de equilibrio de hueso, la evidencia emergente sugiere que la actividad de los osteoclastos se rige sistémicamente por factores relacionados con inmune, neuronal, y otros factores sistemáticos 20-24.
A medida que la comprensión de la biología de osteoclastos continúa avanzando rápidamente, incluyendo su papel en diversos procesos que van desde la remodelación ósea a su papel en la regulación de las metástasis del cáncer de hueso 25-27, este protocolo permitirá a los investigadores consistentemente aislar grandes cantidades de osteoclastos in vitro.
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Disclosures
Ninguno de los autores tiene divulgación o conflicto de intereses que declarar.
Acknowledgments
Queremos agradecer el apoyo de subvenciones del NIH R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, la Fundación Oak y el Laboratorio Hagey Pediátrica Medicina Regenerativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
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