Summary
الخلايا الآكلة هي الخلايا الرئيسية resorbing العظام في الجسم. وقد أدت القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في تحقيق تقدم جوهري في فهم علم الأحياء ناقضة العظم. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لعزل وزراعة وقياس النشاط ناقضة العظم في المختبر.
Abstract
الخلايا الآكلة هي الخلايا المتخصصة جدا التي هي مستمدة من النسب الوحيدات / بلعم من نخاع العظام. قدرة فريدة ليرتشف كل من المصفوفات العضوية وغير العضوية من العظام يعني أنها تلعب دورا رئيسيا في تنظيم إعادة الهيكل العظمي. معا، وبانيات الآكلة هي المسؤولة عن عملية الربط الديناميكية التي تنطوي على حد سواء ارتشاف العظام وتكوين العظام تعمل معا للحفاظ على الهيكل العظمي العادي أثناء الصحة والمرض.
كما أن خلايا العظام resorbing الرئيسية في الجسم، ويمكن التغيرات في التفريق ناقضة العظم أو وظيفة يؤدي إلى آثار عميقة في الجسم. الأمراض المرتبطة ظيفة ناقضة العظم المتغيرة يمكن أن تتراوح في شدتها من أمراض حديثي الولادة قاتلة بسبب الفشل في تشكيل الفضاء لنخاع الدم، لاحظ أكثر شيوعا الأمراض مثل هشاشة العظام، والتي المفرط ارتشاف العظم ناقضة العظم يهيئ لكسر تشكيل.
وقد سمح الأنف والحنجرة "> القدرة على عزل الخلايا الآكلة بأعداد كبيرة في المختبر لتقدم كبير في فهم دورة إعادة تشكيل العظام ومهدت الطريق لاكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة أن مكافحة هذه الأمراض.هنا، نحن تصف بروتوكول لعزل وزراعة الخلايا الآكلة من نخاع العظم الماوس التي من شأنها أن تسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة.
Introduction
إعادة تشكيل العظام هو دينامية وينطوي على اقتران تكوين العظام مع ارتشاف العظم 1. هذه العملية للتنظيم محكم مسؤولة عن الحفاظ على الهيكل العظمي خلال التوازن الطبيعي، وردا على الاصابة والمرض.
الخلايا الآكلة هي الخلايا متعددة النوى الفريدة القادرة على resorbing كلا من المصفوفات العضوية وغير العضوية من العظام. وتستمد الخلايا الآكلة من نسب الوحيدات / بلعم من نخاع العظم 2-5. تشوهات في وظيفة أو تشكيل الخلايا الآكلة يمكن أن يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأمراض السريرية، بما في ذلك الحالات الشائعة مثل مرض هشاشة العظام.
وقد سمح القدرة على توليد الخلايا الآكلة في المختبر لتقدما كبيرا في فهمنا للبيولوجيا العظام 6. ونتيجة لذلك، عوامل علاجية جديدة آخذة في الظهور لعلاج الأمراض المرتبطة ناقضة العظم المسؤولة عن الحالات المرضية والوفيات كبيرة 7 8،9. يتم تبديل التوازن العظام في عدد من الأمراض، بما في ذلك مرحلة ما بعد انقطاع الطمث وهشاشة العظام، والتي زاد النشاط ناقضة العظم يؤدي إلى فقدان المسببة للأمراض من كتلة العظام وكثافتها 10. مع زيادة توافر نماذج الفئران المعدلة وراثيا من الأمراض التي تصيب البشر، هناك المزيد من الفرص لفك دور الخلايا الآكلة في أمراض العظام البشرية 11-13.
ويبدو أن العديد من البروتوكولات لتقنيات زراعة ناقضة العظم في الأدب، مع العديد من الاختلافات وصفت 9،12،14. ووصف زملاء شينغ منهجية مماثلة لبروتوكول المبينة أدناه، في وصفها للفحوصات osteoclastogenic من خلايا نخاع العظام في الفئران. لكن للافراج عن خلايا نخاع العظام العظام الطويلة بعد الحصاد، شينغ وآخرون مسح تجويف نخاع مع α-MEM وسائل الإعلام كاملة14. Catalfamo يدرس تأثير ارتفاع السكر في الدم على وظيفة ناقضة العظم ويصف الطريقة التي حشدت من قبل جميع الخلايا نخاع العظم التنظيف ومثقف لمدة 24 ساعة، وعند هذه النقطة يتم تجاهل الخلايا غير ملتصقة 12، وهي تقنية تستخدم أيضا من قبل بويل وآخرون 9 هذه البروتوكولات نشرت سابقا تتطلب ممارسة بيغ نخاع العظام، وهي ممارسة شاقة، الذي يدخل أيضا من خطر الإصابة إبرة عصا وفقدان نخاع العظم قيمة، كما لا بد من قطع طرفي العظم. البروتوكول، الذي وصفنا، بتطبيق استخدام هاون ومدقة لعزل الخلايا الآكلة، وهي مشابهة لطريقة عزل بلعم صفها Weischenfeldt وآخرون (15).
تجربتنا، ومع ذلك، هو أن العزلة ناقضة العظم والثقافة في المختبر باستخدام تقنيات النتائج المنشورة سابقا في نتائج متفاوتة من حيث الإنتاج ناقضة العظم، مما يؤدي في كثير من الأحيانفي عدم القدرة على زراعة الخلايا الآكلة. لذا، قمنا بوضع البروتوكول الذي يسمح لعزل متسقة من نخاع العظم لإنتاج الماوس أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة متعددة النوى في المختبر، مع العائد التقريبي 70-80٪ من خلايا مطلي في البداية تشكيل الضامة والخلايا الآكلة في وقت لاحق، في حضور ناقضة العظم وسائل الإعلام تحريض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: البيان الأخلاقي: تم تنفيذ كافة البحوث التي تنطوي على الحيوانات الفقارية في بروتوكولات فقا افق الفريق الإداري ستانفورد في رعاية الحيوان المعملية (APLAC).
1. إعداد
- تمكين 10 مل من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا الفصل كثافة الخلية التدرج (الذي يحتوي polysucrose والصوديوم دياتريزوات، تعديلها لكثافة 1.077 غ / مل) للقدوم إلى RT في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
- إعداد التدفق الخلوي (نظام مراقبة الأصول الميدانية) العازلة مع 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و 2٪ مصل العجل الجنين (FCS). اتخاذ قسامة 50 مل والحفاظ على هذه قسامة على RT لاستخدامها خلال خطوة وسائل الاعلام فصل الخلايا كثافة التدرج.
- ديك دلو من الجليد على استعداد للحفاظ على الأنسجة والخلايا المعزولة في أثناء إجراء العزل.
2. إعداد الثقافة وسائل الإعلام
- إعداد وسائل الاعلام القاعدية: MEM (الحد الأدنى الضروري المتوسطة)، دون أحمر الفينول (500 مل)، الغلوتامات (1X)، FCS (10X)، 10،000 وحدة / مل العسائلن (1X).
- تصفية وسائل الاعلام القاعدية مع فلتر 0.22 ميكرون.
- إعداد نخاع العظم وسائل الإعلام بلعم الاستقراء:
- خذ 50 مل من وسائل الإعلام القاعدية التي أعدت في الخطوة 2.1.
- البروستاغلاندين E2 إضافة (PGE2، السيد 352،465 غ / مول) في 10 -7 M تركيز النهائي.
- إضافة بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) في 10 نانوغرام / مل.
- لا تصفية الحل النهائي لنخاع العظم بلعم تحفيز وسائل الإعلام.
- تعد وسائل الإعلام تحريض ناقضة العظم:
- خذ 50 مل من وسائل الإعلام القاعدية التي أعدت في الخطوة 2.1.
- البروستاغلاندين E2 إضافة (PGE2، السيد 352،465 غ / مول) في 10 -7 M التركيز النهائي
- إضافة بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) في 10 نانوغرام / مل.
- إضافة RANKL في 10 نانوغرام / مل.
- لا تصفية الحل النهائي للتحريض وسائل الإعلام ناقضة العظم.
3. عزل نخاع العظم
- الموت ببطء واحدة C57BL / 6 الماوسثاني أكسيد الكربون باستخدام طريقة الاستنشاق، تليها خلع عنق الرحم.
ملاحظة: يجب أن يتم التخلص القوارض من قبل الموظفين المدربين باستخدام التقنية المناسبة والمعدات وكلاء. - موقف وتأمين الماوس على لوحة التشريح ورذاذ مع 70٪ كحول.
- تشريح خارج عظام الفخذ، الظنبوب، للعضد والعمود الفقري.
- تبدأ مع الماوس في موقف ضعيف. إجراء شق عموديا على طول الطرف السفلي وتبدأ من خلال تشريح على طول عظم الفخذ والظنبوب بقسمة إرفاق ملفات الأنسجة اللينة. أخيرا، خلخل العظام من مفصل الركبة والورك لاطلاق سراح العظام تماما من الهيكل العظمي.
- الشروع في إجراء شق على طول الطرف العلوي لعزل العضد. خلخل العضد في الكتف والكوع المفاصل من خلال تشريح لينة مرفق المحفظة الأنسجة.
- أخيرا، وتحويل الماوس فوق، بحيث الماوس يكمن عرضة. جعل شق الجلد على طول العمود الفقري، في خط الوسط. مراقبة مجاور للفقار ينةالأنسجة على كل جانب من العمود الفقري وشق على طول الحافة العظمية في العمود الفقري، من خلال تشريح مجاورة للفقرة كتلة الأنسجة اللينة. باستخدام مقص، وجعل قطع الأفقي عبر العمود الفقري عند قاعدة العنق، وعند نهاية العمود الفقري والداني فقط لإدخال الذيل، وتحرير العمود الفقري من التعلق الأنسجة اللينة.
- مرة واحدة ويتم حصاد العظام، والاحتفاظ بها في المخزن FACS على الجليد.
- استخدام المناديل الورقية لتنظيف العضلات والأنسجة اللينة من العظام.
- وضع العظام وتنظيفها في مدقة وهاون مع 3 مل من العازلة FACS.
- سحق العظام برفق في مدقة وهاون.
- نضح من السائل ملطخة بالدماء ونقل في أنبوب 50 مل المخروطية عن طريق تمرير الحل من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر.
- إضافة 5 مل FACS العازلة إلى العظام سحق وسحق أكبر. مرة أخرى، وإزالة السائل باستخدام ماصة ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل من خلال مصفاة 70 ميكرومتر.
- عادة سحق عظام التويم إلى ثلاث مرات في المخزن FACS جديدة، وذلك باستخدام هاون ومدقة، في كل مرة إضافة 5 مل مزيد من العازلة FACS جديدة، حتى لا صمة عار السائل الأحمر.
- أجهزة الطرد المركزي في حل نخاع العظام في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لانتاج بيليه الخلية.
4. الفصل المتدرج من خلايا نخاع العظام
- نضح وطاف resuspend في 10 مل من العازلة FACS (الحفاظ على RT).
- خذ 50 مل أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام المتاحة تجاريا الفصل كثافة الخلية التدرج (RT).
- طبقة الحل نخاع العظام على كثافة التدرج وسائل الاعلام فصل الخلايا. القيام بذلك ببطء باستخدام ماصة الكهربائية. زاوية غيض ماصة ضد السطح الداخلي بالقرب من أعلى أنبوب مخروطي الشكل ويميل أنبوب مخروطي الى نحو 30 درجة. باستخدام إعداد سرعة بطيئة على ماصة، وطرد بلطف الحل نخاع العظم حتى لا تعكر صفو كثافة التدرج وسائل الاعلام فصل الخلايا.
ملاحظة: في نهاية المطاف سوف هناكيكون تعريفا واضحا بين الحلين (حل الخلوية وكثافة وسائل الاعلام حل فصل الخلايا التدرج). - باستخدام جهاز للطرد المركزي RT، الطرد المركزي كثافة التدرج وسائل الاعلام فصل الخلايا والحل خلية في جهاز للطرد المركزي متوازن في 200 x ج لمدة 15 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، إزالة التسارع والتباطؤ في أجهزة الطرد المركزي لضمان فصل مرحلة كافية باستخدام التدرج الكثافة وسائل الاعلام فصل الخلايا التدرج.
- بعد الطرد المركزي، ونضح قبالة الطبقة الوسطى غائم التي تحتوي على خلايا نخاع العظم من الفائدة.
- نقل هذه الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل الجديد. إضافة 20 مل من العازلة FACS إضافية (حافظ على الجليد) لغسل الخلايا.
- الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لانتاج بيليه الخلية.
- resuspend الكرية خلية النهائي في 1ml من البلاعم تحفيز وسائل الإعلام للسماح عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
5. خلية العد
- يستغرق 10 ميكرولتر من الحل خلية ومزيجمع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. تحميل 10 ميكرولتر من المزيج الناتج على عدادة الكريات والحصول على عدد خلايا لكل مل من محلول.
التثقيف 6. خلية
- ضع 2 مل من البلاعم تحفيز وسائل الإعلام في كل بئر من 24 لوحة جيدا.
- إضافة 200،000 الخلايا لكل بئر.
ملاحظة: في تجربتنا، وكثافة الخلايا والطلاء هي واحدة من أهم المتطلبات الحاسمة لزراعة كافية في المختبر من الخلايا الآكلة. - تستنهض الهمم بلطف لوحة ومكان في حاضنة العادية عند 37 درجة مئوية.
- لا تغيير في وسائل الاعلام لمدة 3 أيام.
- بعد 3 أيام في البلاعم تحفيز وسائل الإعلام، وتغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام ناقضة العظم.
- الآخرة، وتغيير وسائل الإعلام يوميا لمدة 5-7 أيام، وعند هذه النقطة، يجب أن تكون كبيرة، الآكلة مرئية متعددة النوى على لوحة الثقافة.
7. تلطيخ مع طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP)
- بعد 5-7 أيام في المختبر طريق مسدودالبنية، ونضح وسائل الإعلام من الثقافة أيضا.
- غسل الآبار بلطف مع 1X PBS ثلاث مرات.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 4٪ محلول امتصاص العرق ويترك لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- خلال هذا الوقت، وإعداد وصمة عار TRAP (وهي متاحة تجاريا) من خلال ما قبل ارتفاع درجات الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
- بعد 1 ساعة في امتصاص العرق، ونضح من امتصاص العرق وغسل بلطف 3 مرات مع 1X PBS.
- إضافة 1 مل من قبل تحسنت TRAP وصمة عار في كل بئر من لوحة لتكون ملطخة.
- وضع لوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، محمية من الضوء.
- بعد 1 ساعة، نضح من وصمة عار TRAP.
- غسل الآبار 3 مرات مع الماء منزوع الأيونات قبل تحسنت.
- مباين البئر مع الهيماتوكسيلين جيل ل(تنبيه) لمدة 1-2 دقيقة.
- الخلايا الآكلة الصورة باستخدام مشرق المجهري المجال.
- غسل الآبار بالماء منزوع الأيونات حتى كثافة اللون كافية من وصمة عار ويتحقق، وعادة عندما تظهر نوى بلوه.
8. تآكل العظام Osteoclast إعادة امتصاص الفحص
- استخدام المتاحة تجاريا طبق ثقافة 24-جيدا البوليسترين التي هي المغلفة مسبقا مع الركيزة إما العظام أو الكالسيوم البلورية طلاء الفوسفات غير العضوي.
- ضع 2 مل من البلاعم تحفيز وسائل الإعلام في كل بئر.
- إضافة 200،000 خلايا نخاع العظام المعزولة حديثا حصلت في نهاية الخطوة 2 إلى كل بئر.
- تستنهض الهمم بلطف لوحة قبل وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
- في يوم 3، وتغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام ناقضة العظم التمايز.
- إجراء تغييرات وسائل الإعلام اليومية مع وسائل الإعلام ناقضة العظم التمايز لمدة 5-7 أيام.
9. الكمي للتآكل العظام Osteoclast إعادة امتصاص آخر
- بعد 5-7 أيام للثقافة في المختبر في وسائل الإعلام ناقضة العظم التمايز على ركيزة المعدنية وتحليل سطح المعادن، كما هو موضح أدناه، لتقييم قدرة الخلايا الآكلة لتشكيل resorptiعلى الحفر، وهو مؤشر للنشاط ناقضة العظم.
- وسائل الإعلام نضح من لوحة فحص ارتشاف وإضافة 100 ميكرولتر من 10٪ محلول التبييض على كل بئر.
- احتضان الخلايا مع محلول التبييض 10٪ لمدة 15 دقيقة في RT.
- غسل الآبار 3 مرات مع الماء المقطر.
- نضح إيقاف أي المياه المتبقية والتخلص من الماء الزائد من لوحة والسماح للهواء الجاف لمدة 3-5 ساعة.
- مباين لوحة مع المتاحة تجاريا فون كوسا عدة تلطيخ للسماح التصور أسهل للامم المتحدة resorbed الركيزة.
- استخدام المجهر مشرق الميدان لالتقاط صور من أجزاء تمثيلية من سطح resorbed.
- الصورة باستخدام برامج التحليل، وحساب النسبة المئوية للسطح resorbed للسماح لتقدير حجم النشاط resorptive ناقضة العظم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكان الهدف من هذا الأسلوب لعزل بسهولة أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة في المختبر، وعادة في أسبوع واحد. وقد أكد العزلة الناجحة لأعداد كبيرة من الخلايا الآكلة باستخدام المقاومة للحمض الفوسفاتيز طرطرات تلطيخ (الشكل 1A). وتصور الخلايا الآكلة الكبيرة وخلايا الأرجواني كبيرة مع نوى متعددة (عادة ≥ 3 نوى). باستخدام هذا البروتوكول، ومن الشائع لعزل الخلايا الآكلة مع ما يصل إلى 30 نواة في ناقضة العظم (الشكل 1B).
استخدام سطح المعادن تعتبر طريقة الذهب القياسية لتقييم ناقضة العظم النشاط resorptive في المختبر. وباستخدام هذه الطريقة، فإن نسبة سطح المعادن، أو "حفر ارتشاف" التي شكلت تسمح لتحديد قدرة resorptive ناقضة العظم (الشكل 2).
_upload / 52056 / 52056fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 1. (A) طرطرات حمض الفوسفاتيز مقاومة تلطيخ نخاع العظم مثقف بعد 10 يوما في الثقافة في ظل ظروف ناقضة العظم الاستقرائي. صورة مجهرية الحقل مشرقة في 10X التكبير يدل متعددة، متعددة النوى الخلايا الآكلة الكبيرة التي هي TRAP الإيجابي (تلطيخ الأرجواني). ويرد مثال كبير، ناقضة العظم متعددة النوى بخط أحمر متقطع. (ب) صورة مجهرية مشرق الحقل في 10X التكبير يدل لذلك، متعددة النوى، TRAP ناقضة العظم إيجابي كبير. ويظهر مثال على نواة داخل ناقضة العظم متعددة النوى بواسطة السهم الأحمر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. برايت صورة مجهرية الحقل في 10X التكبير يدل حفر ارتشاف يشكلها النشاط ارتشاف ناقضة العظم. اتسخت مصفوفة المتمعدنة مع فون كوسا وصمة عار للسماح التصور. أسود متقطع خطوط الخطوط العريضة مثال على المناطق resorbed من المصفوفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكانت القدرة على عزل بسهولة وزراعة أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة في المختبر مسؤولا عن المساعدة على تعزيز فهم البيولوجيا العظام والأمراض بوساطة ناقضة العظم. كان تحديد RANKL التي تؤدي إلى هذا، عندما تم التعرف عليه مؤخرا كمنظم رئيسي لتشكيل ناقضة العظم، والتمايز والبقاء 16-18.
فقد كان من تجربتنا أن زراعة في المختبر من الخلايا الآكلة من نخاع العظام تعتمد إلى حد كبير على كثافة البذر. لاحظنا أن فشل هذا البروتوكول لانتاج الخلايا الآكلة هو عادة بسبب كثافة البذر الأمثل عندما تصفيح الخلايا المشتقة من نخاع العظام. وهكذا، في هذا البروتوكول، فمن المستحسن أن البذور 200000 خلية لكل 24 لوحة جيدا أيضا. وعلاوة على ذلك، من أجل تحقيق أقصى قدر من النجاح مع هذه التقنية، فمن المستحسن لإعداد وسائل الاعلام ناقضة العظم تحريض بالضبط كما هو موضح أعلاه، وإلى تغيير وسائل الإعلام في لياليالوقت AME كل يوم، وبعد 3 أيام الأولية عند واحد لا يحتاج إلى تعكير صفو وحات الثقافة. هذا قد تسمح للتركيز المستمر للعوامل تحريض وسائل الإعلام ناقضة العظم. بالإضافة إلى ذلك، فقد وجدنا أن استخدام الكواشف محددة كما يتيح إمكانية أكبر للزراعة أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة متعددة النوى.
وهذه التقنية محدودة بسبب توافر جهاز للطرد المركزي RT، حيث يمكن للمرء أن يغير التسارع والتباطؤ المعلمات وشراء الكواشف محددة. وهو خلاف بروتوكول اضحة جدا، والتي كان لدينا الكثير من النجاح، في مجموعة من الفئران من العمر والخلفية الوراثية المختلفة (على سبيل المثال، C57BL / 6، CD1، NOD SCID، لاب ديسيبل - / -).
هذه التقنية توفر طريقة موثوق بها لتوليد الخلايا الآكلة في المختبر وتحديد قدرتها على يرتشف المصفوفة المعدنية. باستخدام هذا البروتوكول، فمن الممكن لعزل أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة متعددة النوى في vitrس عادة في أسبوع واحد. تجربتنا هو أن العزلة ناقضة العظم والثقافة في المختبر باستخدام تقنيات النتائج المنشورة سابقا في النتائج اختلافا كبيرا من حيث الإنتاج ناقضة العظم، مما يؤدي إلى عدم القدرة على زراعة الخلايا الآكلة 9،12،14 كثير من الأحيان.
ناقضة العظم وظيفة معقدة وارتشاف العظام هو عملية مدبرة للغاية التي توسطت على المستوى المحلي من خلال الحديث المتبادل بين الخلايا بانية العظم والخلايا الآكلة 19. بالإضافة إلى السيطرة المحلية على التوازن العظام، وشواهد تشير إلى أن النشاط ناقضة العظم يخضع بشكل منتظم من خلال عوامل تتعلق المناعة، والعصبية، والعوامل منهجية أخرى 20-24.
مع استمرار فهم البيولوجيا ناقضة العظم للمضي قدما بسرعة، بما في ذلك دور متنوع في العمليات تتراوح بين إعادة العظام إلى دورها في تنظيم الانبثاث السرطان إلى العظام 25-27، وهذا البروتوكول يسمح للباحثين تتكونعزل مستديم كميات كبيرة من الخلايا الآكلة في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا أحد المؤلفين لديه الإفصاح أو تضارب في المصالح ليعلن.
Acknowledgments
نعترف بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01 DE021683، R01 DE019434، U01 HL099776، مؤسسة ومختبر أوك Hagey للأطفال الطب التجديدي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
