Summary
Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.
Abstract
Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate che sono derivati dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo. La loro capacità unica di riassorbire sia le matrici organiche e inorganiche di osso significa che essi svolgono un ruolo chiave nella regolazione del rimodellamento scheletrico. Insieme, osteoblasti ed osteoclasti sono responsabili del processo di accoppiamento dinamico che coinvolge sia il riassorbimento osseo e la formazione ossea agendo insieme per mantenere lo scheletro normale durante salute e di malattia.
Poiché la cella di ossa riassorbimento principale del corpo, cambiamenti nella differenziazione o funzione osteoclasti possono provocare effetti profondi nel corpo. Malattie associate con la funzione degli osteoclasti alterata può variare in gravità da malattia neonatale letale a causa di fallimento per formare uno spazio osseo per emopoiesi, per osservare più comunemente patologie come l'osteoporosi, in cui un eccessivo riassorbimento osseo degli osteoclasti predispone alle fratture formazione.
ent "> La capacità di isolare osteoclasti in quantità elevata in vitro ha permesso significativi progressi nella comprensione del ciclo di rimodellamento osseo e ha aperto la strada per la scoperta di nuove strategie terapeutiche che combattere tali malattie.Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare osteoclasti da midollo osseo di topo che consentiranno di ottenere un gran numero di osteoclasti.
Introduction
Il rimodellamento osseo è dinamico e prevede l'accoppiamento della formazione ossea con riassorbimento osseo 1. Questo processo strettamente regolato è responsabile del mantenimento dello scheletro durante omeostasi normale, e in risposta a lesioni e malattie.
Gli osteoclasti sono cellule multinucleate, unici che sono in grado di riassorbimento sia le matrici organiche e inorganiche di osso. Gli osteoclasti sono derivati dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo 2-5. Anomalie nella funzione o formazione di osteoclasti può provocare una varietà di patologie cliniche, incluse condizioni comuni come l'osteoporosi.
La capacità di generare osteoclasti in vitro ha permesso significativi progressi nella nostra comprensione della biologia dell'osso 6. Di conseguenza, i nuovi agenti terapeutici stanno emergendo per curare le malattie degli osteoclasti correlate che sono responsabili di morbilità e mortalità significative 7 8,9. Osso omeostasi è alterata in un certo numero di malattie, compreso postmenopausale, in cui l'aumento dell'attività degli osteoclasti porta alla perdita patogenicità di massa ossea e densità 10. Con l'aumento della disponibilità di transgenici modelli murini di malattie umane, non vi è più possibilità di decifrare il ruolo degli osteoclasti nelle malattie delle ossa umane 11-13.
Numerosi protocolli per tecniche di coltura degli osteoclasti appaiono in letteratura, con molte varianti descritte 9,12,14. Xing e colleghi descrivono la metodologia simile al protocollo descritto di seguito, nella loro descrizione di saggi osteoclastogenico da cellule del midollo osseo di topo. Tuttavia, per liberare le cellule del midollo osseo seguenti raccolta delle ossa lunghe, Xing et al. Lavare la cavità midollare con α-MEM multimediale completo14. Catalfamo esamina l'effetto dell'iperglicemia sulla funzione degli osteoclasti e descrive un metodo in cui tutte le cellule mobilizzano midollo osseo lavaggio sono coltivate per 24 ore, a questo punto le cellule non aderenti sono scartati 12, una tecnica usata anche da Boyle et al . 9 Questi protocolli precedentemente pubblicati richiedono la pratica di lavaggio del midollo osseo, una pratica noiosa, che introduce anche il rischio di ferirsi e la perdita di preziose midollo osseo, come si deve tagliare entrambe le estremità dell'osso. Il protocollo, che descriveremo, implementa l'utilizzo di un mortaio e pestello per isolare osteoclasti, che è simile al metodo di isolamento macrofagi descritto da Weischenfeldt et al. 15
La nostra esperienza, tuttavia, è che l'isolamento degli osteoclasti e la coltura in vitro utilizzando tecniche precedentemente pubblicati dà risultati variabili in termini di produzione di osteoclasti, che spesso portain una incapacità di coltivare osteoclasti. Pertanto, abbiamo ideato un protocollo che consente l'isolamento uniforme del midollo osseo di topo per produrre un gran numero di osteoclasti multinucleate in vitro, con una resa approssimativa del 70-80% delle cellule inizialmente placcati formando macrofagi e successivamente osteoclasti, in presenza di mezzi di induzione degli osteoclasti.
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Protocol
NOTA: Dichiarazione etica: Tutte le ricerche sugli animali vertebrati è stata eseguita in conformità protocolli approvati dal Pannello di Amministrazione di Stanford in laboratorio Animal Care (APLAC).
1. Preparazione
- Consentire 10 ml di mezzi di separazione gradiente di densità cellulare disponibile in commercio (che contiene polysucrose e sodio diatrizoato, regolate ad una densità di 1.077 g / ml) per venire a RT in una provetta conica da 50 ml.
- Preparare citometria a flusso (FACS) tampone con 1x tampone fosfato salino (PBS) e siero fetale bovino 2% (FCS). Prelevare un'aliquota di 50 ml e mantenere tale aliquota a TA per uso durante il supporto separazione cellulare passaggio gradiente di densità.
- Avere un secchio di ghiaccio pronto a mantenere il tessuto isolati e le cellule durante la procedura di isolamento.
2. Preparare Culture Media
- Preparare i media basale: MEM (mezzo essenziale minimo), senza rosso fenolo (500 ml), glutammato (1x), FCS (10x), 10.000 unità / ml penicillin (1x).
- Filtro dei media basale con un filtro da 0,22 micron.
- Preparare supporti macrofagi induzione di midollo osseo:
- Introdurre 50 ml della media basale preparate al punto 2.1.
- Aggiungi prostaglandina E2 (PGE2, il sig 352,465 g / mol) a 10 -7 M concentrazione finale.
- Aggiungi macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) a 10 ng / ml.
- Non filtrare la soluzione finale di midollo osseo macrofagi stimolante media.
- Preparare supporti induzione degli osteoclasti:
- Introdurre 50 ml della media basale preparate al punto 2.1.
- Aggiungi prostaglandina E2 (PGE2, il sig 352,465 g / mol) a 10 -7 M concentrazione finale
- Aggiungi macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) a 10 ng / ml.
- Aggiungere RANKL a 10 ng / ml.
- Non filtrare la soluzione finale dei media induzione osteoclasti.
3. Isolamento di Midollo Osseo
- Euthanize uno C57BL / 6 del mouseutilizzando il metodo di anidride carbonica inalazione, seguita da dislocazione cervicale.
NOTA: I roditori devono essere sacrificati da personale specializzato con le necessarie tecniche, attrezzature e agenti. - Posizionare e fissare il mouse su una tavola di dissezione e spruzzare con il 70% di alcol.
- Sezionare dei femori, tibie, omeri e della colonna vertebrale.
- Inizia con il mouse in posizione supina. Fare un'incisione verticale lungo l'arto inferiore e iniziare dissezione lungo la lunghezza del femore e della tibia dividendo allegati tessuti molli. Infine, dislocare le ossa del ginocchio e dell'anca liberare ossa completamente dallo scheletro.
- Avanti a fare un'incisione lungo la lunghezza dell'arto superiore per isolare l'omero. Dislocare l'omero alle articolazioni della spalla e del gomito da dissezione dei tessuti molli capsulare.
- Infine, ruotare il mouse, in modo che il mouse giace prona. Eseguire un'incisione cutanea lungo la lunghezza della colonna vertebrale, sulla linea mediana. Osservare il morbido paravertebraletessuto su ciascun lato della colonna vertebrale e incise lungo il bordo ossea della colonna vertebrale, dissezione attraverso la massa di tessuto molle paravertebrale. Usando una forbice, fare un taglio orizzontale attraverso la spina dorsale alla base del collo, e alla fine della spina dorsale, appena prossimale all'inserimento coda, liberando la colonna vertebrale dall'attaccamento tessuti molli.
- Una volta che le ossa sono raccolte, tenerli in tampone FACS sul ghiaccio.
- Utilizzare carta velina per pulire muscolare e dei tessuti molli dalle ossa.
- Posizionare le ossa pulite in un pestello e mortaio con 3 ml di tampone FACS.
- Schiacciare le ossa delicatamente pestello e mortaio.
- Aspirare il fluido macchiato di sangue e il trasferimento in una provetta da 50 ml conica facendo passare la soluzione attraverso un filtro cella 70 micron.
- Aggiungere 5 ml FACS tampone per l'osso schiacciato e schiacciare ulteriormente. Anche in questo caso, rimuovere il liquido con una pipetta e trasferire alla provetta conica da 50 ml attraverso un filtro 70 micron.
- In genere schiacciare ossa TWIce per tre volte in tampone FACS fresco, utilizzando un mortaio e pestello, ogni volta aggiungendo altri 5 ml di tampone FACS fresco, finché il fluido non macchia rossa.
- Centrifugare la soluzione midollo osseo a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per produrre un pellet di cellule.
4. Separazione gradiente di cellule del midollo osseo
- Aspirare il surnatante e risospendere in 10 ml di tampone FACS (mantenuto a temperatura ambiente).
- Prendete il tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di mezzi di separazione gradiente di densità cellulare disponibile in commercio (RT).
- Strato la soluzione midollo osseo sul supporto di separazione cellulare gradiente di densità. Fate questo lentamente utilizzando una pipetta elettrico. Angolo della punta della pipetta contro la superficie interna nella parte superiore della provetta conica e inclinare il tubo conico di circa 30 °. Utilizzando una bassa velocità impostata sulla pipetta, espellere lentamente la soluzione midollo osseo in modo da non disturbare il supporto separazione cellulare gradiente di densità.
NOTA: Alla fine non ci saràuna chiara definizione tra le due soluzioni (soluzioni cellulare e soluzione dei media densità di separazione cellulare gradiente). - Utilizzando una centrifuga RT, centrifugare i mezzi di separazione cellulare gradiente di densità e soluzione di cellule in una centrifuga equilibrata a 200 xg per 15 min. Inoltre, rimuovere accelerazione e decelerazione sul centrifuga per assicurare un'adeguata separazione di fase utilizzando il gradiente di densità mezzi di separazione cellulare gradiente.
- Dopo la centrifugazione, aspirare lo strato centrale nuvoloso che contiene le cellule del midollo osseo di interesse.
- Trasferire queste cellule in un nuovo tubo conico. Aggiungere 20 ml di tampone FACS supplementare (tenuti in ghiaccio) per lavare le cellule.
- Centrifugare a 200 xg per 5 minuti a 4 ° C per produrre un pellet di cellule.
- Risospendere il pellet di cellule finale di 1 ml di macrofagi stimolare supporti per consentire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro.
5. Conteggio delle cellule
- Prendere 10 ml di soluzione di cellule e mescolarecon 10 ml di trypan blu. Carico 10 microlitri della miscela risultante su un emocitometro e ottenere il numero di cellule per ml di soluzione.
6. Coltura cellulare
- Mettere 2 ml di macrofagi stimolare i media in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
- Aggiungere 200.000 cellule in ciascun pozzetto.
NOTA: Nella nostra esperienza, la densità delle cellule-placcatura è uno dei requisiti più importanti per un adeguato coltura in vitro degli osteoclasti. - Agitare delicatamente la piastra e posto in un incubatore regolare a 37 ° C.
- Non cambiare il supporto per 3 giorni.
- Dopo 3 giorni di macrofagi stimolante mezzi, cambiare i media a supporto degli osteoclasti.
- D'ora in avanti, cambiare i media al giorno per 5-7 giorni, a quel punto, di grandi dimensioni, gli osteoclasti multinucleate dovrebbe essere visibile sulla piastra di coltura.
7. La colorazione con tartrato resistente fosfatasi acida (TRAP)
- Dopo 5-7 giorni di in vitro cultura, aspirare il supporto dalla cultura bene.
- Lavare i pozzetti delicatamente con 1x PBS per tre volte.
- Fissare le cellule aggiungendo soluzione di paraformaldeide al 4% e lasciare per 1 ora a 4 ° C.
- Durante questo tempo, preparare la macchia TRAP (disponibile in commercio) pre-riscaldamento a 37 ° C.
- Dopo 1 ora in paraformaldeide, aspirare via paraformaldeide e lavare delicatamente 3 volte con PBS 1x.
- Aggiungere 1 ml di colorazione TRAP preriscaldata in ciascun pozzetto della piastra da colorare.
- Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 ora, al riparo dalla luce.
- Dopo 1 ora, aspirare la macchia TRAP.
- Lavare i pozzetti per 3 volte con acqua deionizzata pre-riscaldato.
- Contrasto del bene con ematossilina di Gill (ATTENZIONE) per 1-2 min.
- Osteoclasti immagine utilizzando la microscopia in campo chiaro.
- Lavare i pozzetti con acqua deionizzata fino ad un adeguato intensità del colore della macchia si ottiene, in genere quando i nuclei appaiono blue.
8. osteoclasti riassorbimento Assay
- Utilizzare un polistirene a 24 pozzetti piatto cultura commercialmente disponibile che è pre-rivestita con uno substrato osso o un rivestimento di fosfato di calcio cristallino inorganico.
- Mettere 2 ml di macrofagi stimolare i media in tutti i pozzetti.
- Aggiungere 200.000 appena isolate cellule di midollo osseo ottenuti alla fine del passaggio 2 in ciascun pozzetto.
- Agitare delicatamente la piastra prima della collocazione in un incubatore a 37 ° C per 3 giorni.
- Il giorno 3, cambiare i mezzi di comunicazione ai media la differenziazione degli osteoclasti.
- Eseguire le modifiche dei media ogni giorno con i media differenziazione degli osteoclasti per 5-7 giorni.
9. Quantificazione delle attività degli osteoclasti riassorbimento
- Dopo 5-7 giorni di coltura in vitro in mezzi differenziazione degli osteoclasti su un substrato mineralizzata, analizzare la superficie mineralizzata, come descritto di seguito, per valutare la capacità di osteoclasti a formare resorptisu pozzi, un indicatore dell'attività osteoclastica.
- Aspirare i media dalla piastra test riassorbimento e aggiungere 100 ml di soluzione di candeggina al 10% in ogni pozzetto.
- Incubare le cellule con la soluzione di candeggina al 10% per 15 minuti a RT.
- Lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata.
- Aspirare l'eventuale acqua residua e scrollarsi di dosso l'acqua in eccesso dalla piastra e lasciare asciugare all'aria per 3-5 ore.
- Controcolorare la piastra con un kit di colorazione di Von Kossa disponibile in commercio per consentire la più agevole la visualizzazione del substrato non-riassorbito.
- Utilizzare la microscopia in campo chiaro a prendere le immagini di parti rappresentative della superficie riassorbito.
- Utilizzando immagine software di analisi, calcolare la percentuale di superficie riassorbita per consentire la quantificazione dell'attività osteoclastica riassorbimento.
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Representative Results
Lo scopo di questo metodo era di isolare facilmente un gran numero di osteoclasti in vitro, tipicamente in una settimana. Isolamento di successo di un gran numero di osteoclasti è stata confermata usando tartrato-resistente all'acido fosfatasi colorazione (Figura 1A). Grandi osteoclasti sono visualizzati come grandi cellule viola con più nuclei (tipicamente ≥ 3 nuclei). Usando questo protocollo, è comune per isolare osteoclasti con ben 30 nuclei per osteoclasti (Figura 1B).
Utilizzando una superficie mineralizzata è considerato il metodo gold standard di valutazione dell'attività degli osteoclasti riassorbimento in vitro. Usando questo metodo, la percentuale di superficie mineralizzata, o "fosse di riassorbimento" che hanno formato permette di determinazione della capacità di riassorbimento degli osteoclasti (Figura 2).
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Figura 1. (A) tartrato resistente agli acidi fosfatasi colorazione di coltura di midollo osseo dopo 10 giorni in coltura in condizioni osteoclasti induttivi. Al microscopio in campo chiaro a 10X di ingrandimento dimostra più grandi, osteoclasti multinucleate che sono TRAP positivo (colorazione viola). Un esempio di una grande, osteoclasti multinucleate è delimitata da una linea tratteggiata rossa. (B) campo micrografia luminoso a ingrandimento 10X dimostrare una grande, multinucleate, TRAP osteoclasti positiva. Un esempio di un nucleo all'interno di un osteoclasti multinucleate è indicata dalla freccia rossa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. luminoso al microscopio a campo 10X di ingrandimento dimostra pozzi riassorbimento formate da attività di riassorbimento degli osteoclasti. Matrice mineralizzata è macchiato con macchie Von Kossa per consentire la visualizzazione. Il nero linee tratteggiate delineare un esempio di aree di riassorbimento della matrice. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La capacità di isolare facilmente e coltivare un gran numero di osteoclasti in vitro è stato responsabile per aver contribuito a promuovere la comprensione della biologia dell'osso e delle malattie degli osteoclasti-mediata. Era l'identificazione di RANKL che portano a questo, quando è stato recentemente identificato come il principale regolatore della formazione degli osteoclasti, differenziamento e la sopravvivenza 16-18.
E 'stata la nostra esperienza che la coltivazione in vitro degli osteoclasti dal midollo osseo è in gran parte dipendente dalla densità di semina. Abbiamo osservato che il fallimento di questo protocollo per produrre osteoclasti è in genere dovuta ad una densità di semina ottimale quando placcatura cellule derivate dal midollo osseo. Così, in questo protocollo, si consiglia di seminare 200.000 cellule per piastra da 24 pozzetti bene. Inoltre, al fine di conseguire il massimo successo con questa tecnica, si consiglia di preparare il supporto induzione osteoclasti proprio come descritto sopra e cambiare il supporto alla stempo ame ogni giorno, dopo i primi 3 giorni in cui uno non ha bisogno di disturbare le piastre di coltura. Questo potrebbe consentire una concentrazione costante dei fattori di induzione di media degli osteoclasti. Inoltre, abbiamo trovato che l'uso di reagenti specifici consente inoltre una maggiore potenzialità per la coltura di un gran numero di osteoclasti multinucleate.
Questa tecnica è limitata dalla disponibilità di una centrifuga RT, in cui si possono modificare i parametri e approvvigionamento di reagenti specifici di accelerazione e decelerazione. Altrimenti è un protocollo molto semplice, con la quale abbiamo avuto molto successo, in una serie di topi di diversa età e background genetico (ad esempio, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, Lep db - / -).
Questa tecnica offre un metodo affidabile per generare osteoclasti in vitro e per determinare la loro capacità di riassorbire matrice mineralizzata. Usando questo protocollo, è possibile isolare un gran numero di osteoclasti multinucleate in vitro tipicamente in una settimana. La nostra esperienza è che l'isolamento degli osteoclasti e la coltura in vitro utilizzando tecniche precedentemente pubblicati dà risultati molto variabili in termini di produzione di osteoclasti, spesso con conseguente impossibilità di coltivare osteoclasti 9,12,14.
Funzione osteoclasti è complesso e riassorbimento osseo è un processo altamente orchestrato che è mediato a livello locale da cross-talk tra osteoblasti e osteoclasti 19. In aggiunta al controllo locale di equilibrio ossa, prove emergenti suggeriscono che l'attività degli osteoclasti è disciplinata a livello sistemico da fattori legati al sistema immunitario, neuronale, e di altri fattori sistematici 20-24.
Come la comprensione della biologia degli osteoclasti continua ad avanzare rapidamente, incluso il loro ruolo in diversi processi che vanno dal rimodellamento osseo al loro ruolo nella regolazione metastasi del cancro alle ossa 25-27, questo protocollo permetterà ai ricercatori di consistonotemente isolare grandi quantità di osteoclasti in vitro.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha divulgazione o conflitto di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Riconosciamo il sostegno di borse di studio NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, della Fondazione Oak e il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
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