Summary
파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.
Abstract
파골 세포는 골수 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생 된 고도로 전문화 된 세포이다. 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수하는 이들의 독특한 능력은 골 리모델링을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것을 의미한다. 함께, 조골 세포 및 파골 세포는 골 흡수 및 건강과 질병 중에 정상 골격을 유지하기 위해 함께 작용하는 골 형성을 모두 포함 동적 커플 링 프로세스에 대한 책임이있다.
신체의 주요 뼈 재 흡수 세포로, 파골 세포의 분화 또는 기능의 변화는 몸에 심각한 영향을 초래할 수 있습니다. 변경된 파골 세포의 기능과 관련된 질환은 더 일반적으로 과도한 파골 세포의 골 흡수가 형성 골절에 걸리기 쉽게하는 골다공증 등의 병변을 관찰하기 때문에 조혈위한 골수 공간을 형성하기 위해 실패에 치명적인 신생아 질병 심각도에 다양합니다.
ENT "> 체외에서 높은 숫자 파골 세포를 분리하는 능력은 뼈의 리모델링주기의 이해에 상당한 발전을 허용하고이 질병에 대처 새로운 치료 전략의 발견을위한 도로를 포장하고있다.여기, 우리는 분리와 파골 세포의 큰 숫자를 얻을 것입니다 마우스 골수에서 파골 세포를 배양 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
뼈의 리모델링은 동적이며 골 흡수 1 골 형성의 커플 링을 수반한다. 이 엄격하게 규제 과정은 정상적인 항상성 동안 골격을 유지할 책임이 있으며, 부상 및 질병에 대응.
파골 세포는 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수 할 수있는 고유 한 다핵 세포이다. 파골 세포는 골수 2-5의 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생됩니다. 파골 세포의 기능 또는 형성에 이상이 골다공증과 같은 일반적인 조건을 포함 임상 병리의 다양한 발생할 수 있습니다.
체외에서 파골 세포를 생성하는 기능은 뼈 생물학 (6)에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 결과적으로, 새로운 치료제 7 상당한 이환율 및 사망률을 담당 파골 세포 관련 질환을 치료하기 위해 대두되고 8,9의 공동 행동이 필요합니다. 골 항상성이되는 파골 세포 활성은 골 질량 및 밀도 10 병원성 손실에 이르게 증가, 폐경 후 골다공증을 포함한 질병의 숫자로 변경된다. 인간 질병의 형질 전환 생쥐 모델의 유용성을 증가함에 따라, 인간의 골 질환 11-13에서 파골 세포의 역할을 해독 할 기회가 더있다.
많은 변화가 9,12,14 설명과 파골 세포 배양 기술에 대한 다수의 프로토콜은 문학에 나타납니다. 싱 연구팀은 쥐의 골수 세포에서 osteoclastogenic 분석의 자신의 설명에, 아래에 설명 된 프로토콜과 유사한 방법을 설명합니다. 그러나 긴 뼈 수확 다음의 골수 세포를 분리, 싱 등. α-MEM 전체 미디어와 골수 캐비티를 플러시14. Catalfamo은 파골 세포 기능에 고혈당증의 효과를 검사하고있는 모든 세포가 골수 플러싱 동원하는 방법이되는 비 - 부착 세포는 12 폐기된다 가리, 24 시간 동안 배양 설명도 보일 등에 의해 사용되는 기술 . (9)이 사전에 발행 프로토콜은 하나의 뼈의 양 단부를 절단해야으로서도, 바늘 스틱 부상 귀중한 골수의 손실 위험을 도입 골수, 지루한 연습, 플러싱의 연습을 필요로한다. 우리가 설명 프로토콜은 Weischenfeldt 등에 의해 기술 된 대 식세포의 분리 방법과 유사한 파골 세포를 분리하기 박격포와 유의 사용을 구현한다. 15
우리의 경험은, 그러나, 종종 그 결과, 파골 세포 생산의 관점에서 가변 결과 이전에 출판 된 기법을 사용하여 그 결과 파골 분리 및 체외 배양이며무능력에서 파골 세포를 배양합니다. 따라서, 우리의 존재, 초기 식세포이어서 파골 세포 형성 도금 셀 70-80 %로 약 수율로 시험관 내에서 다핵 파골 세포의 다수 생산하는 마우스 골수의 일관된 분리를 허용하는 프로토콜을 고안 파골 세포 유도 매체.
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Protocol
참고 : 윤리 문 : 척추 동물을 포함한 모든 연구가 실험 동물 관리에 스탠포드 행정 패널 (APLAC)의 승인에 따라 프로토콜을 수행 하였다.
1. 준비
- 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 10 ㎖ 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 RT에 와서 (polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 포함 1.077 g / ㎖의 밀도로 조정) 허용.
- 유동 세포 계측법 준비 (FACS)는 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 버퍼. 50 mL를을 가지고 밀도 구배 세포 분리 매체 단계에서 사용하기 위해 RT에서이 나누어지는을 유지한다.
- 분리 절차를 수행하는 동안 격리 된 조직과 세포를 유지 할 준비가 얼음 양동이를 가지고있다.
2. 문화 매체 준비
- 기저 미디어를 준비합니다 MEM (최소 필수 중간), 페놀 레드 (500 ㎖), 글루타민산 (1X)하지 않고, FCS를 (10 배), 10,000 단위 / ㎖ penicilliN (1X).
- 0.22 μm의 필터를 기저 미디어를 필터링합니다.
- 골수 대 식세포 유도 매체를 준비합니다
- 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여.
- 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / 몰)를 추가합니다.
- 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다.
- 미디어를 자극 골수 대 식세포의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오.
- 파골 세포 유도 매체를 준비합니다
- 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여.
- 추가 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / mol)의
- 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다.
- 10 ng를 / ㎖에서 RANKL을 추가합니다.
- 파골 세포 유도 매체의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오.
3. 골수 격리
- 한 C57BL / 6 마우스를 안락사경추 탈구이어서 이산화탄소 흡입 방법을 사용.
참고 : 설치류가 적절한 기술, 장비 및 에이전트를 사용하여 훈련받은 사람이 안락사해야합니다. - 위치 해부 보드에 마우스를 확보하고 70 % 알코올을 스프레이.
- 대퇴골, 경골, 상완골 (humeri)과 척추를 해부하다.
- 앙와위에서 마우스로 시작합니다. 수직으로 하체를 따라 절개를하고 연부 조직 첨부 파일을 분할하여 대퇴골과 경골의 길이를 따라 절개로 시작합니다. 마지막으로, 골격에서 완전히 뼈를 확보하기 위해 무릎과 엉덩이 관절에서 뼈가 탈구.
- 상완골을 분리하는 상지의 길이를 따라 절개를 진행합니다. 연부 조직 피막 첨부 파일을 해부하여 어깨와 팔꿈치 관절에서 상완골 탈구.
- 마우스는 경향이있다 그래서 마지막으로, 위에 마우스를 켭니다. 정중선에서, 척추의 길이 방향을 따라 피부를 절개를. paravertebral 소프트를 관찰paravertebral 부드러운 조직 덩어리를 해부 척추의 뼈 가장자리를 따라 척추와 째다의 각면에 조직. 가위 사용하여 목의 기지에서 척추에 걸쳐 수평 절단을하고, 연부 조직의 첨부 파일에서 척추를 자유롭게 척추, 꼬리 삽입에 바로 인접의 끝에서.
- 뼈가 수확되면, 얼음에 FACS 버퍼에 보관하십시오.
- 뼈에서 근육과 연부 조직을 청소하는 조직의 용지를 사용하십시오.
- FACS 버퍼의 3 ㎖와 봉과 박격포로 청소 뼈를 놓습니다.
- 봉과 박격포 부드럽게 뼈를 분쇄.
- 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 전달하여 50 ML 원뿔 튜브에 피 묻은 액체 및 전송 대기음.
- 5 ml의 FACS가 짓 눌린 뼈에 버퍼와 더 호감을 추가합니다. 다시 말하지만, 피펫을 사용하여 유체를 제거하고 70 μm의 스트레이너를 통해 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 일반적으로 뼈 트위어 호감신선한 FACS 완충액에서 세 번, 유체가 적색 착색되지 않을 때까지, 박격포와 유, 신선한 FACS 완충액 5 mL를 추가로 첨가 할 때마다 사용하는 가전.
- 세포 펠렛을 수득 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에 골수 용액을 원심 분리기.
골수 세포의 분리 4. 그라디언트
- FACS 완충액 10ml에 상청에 resuspend 대기음 (RT로 유지).
- 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 (RT) 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 타고.
- 밀도 구배 세포 분리 매체로 골수 용액을 층을 포함한다. 천천히 전기 피펫을 사용하여이 작업을 수행합니다. 각 피펫 원뿔 튜브의 상단에있는 내부 표면에 대한 팁과 약 30 °의 원뿔형 튜브를 기울이십시오. 밀도 구배 세포 분리 매체를 방해하지 않도록 피펫에 느린 속도 설정을 사용하여 부드럽게 골수 용액 추방.
참고 : 궁극적으로있을 것이다두 솔루션 (휴대폰 솔루션 및 밀도 구배 세포 분리 미디어 솔루션) 사이의 명확한 정의합니다. - RT 원심 분리기를 사용하여, 15 분 동안 200 XG에서 평형 원심 밀도 구배 세포 분리 매체 및 세포 용액을 원심 분리기. 또한, 밀도 구배 세포 분리 미디어 구배를 사용하여 적절한 상분리되도록 원심 분리기에 가속 및 감속을 제거한다.
- 원심 분리 후, 관심있는 골수 세포를 포함 흐린 중간층을 대기음.
- 새로운 원뿔 튜브에이 세포를 전송합니다. 세포를 씻어 (얼음에 보관) 추가 FACS 버퍼의 20 ML을 추가합니다.
- 4 ° C에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 세포 펠렛을 얻었다.
- 혈구 세포를 사용하여 계산을 허용하기 위해 미디어를 자극 식세포의 1 ㎖의 최종 세포 펠렛을 재현 탁.
5. 셀 카운팅
- 세포 용액 10 μl를 타고 혼합트리 판 블루 10 μL와. 로드 결과 믹스의 10 μL 혈구 상 및 솔루션 1 ㎖ 당 세포 수를 얻을 수 있습니다.
6. 세포 배양
- 24 웰 플레이트의 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다.
- 각 웰에 20 만 셀을 추가합니다.
참고 : 우리의 경험에 의하면, 세포 도금 밀도는 파골 세포의 체외 배양에 적절한의 가장 중요한 요구 사항 중 하나입니다. - 조심스럽게 37 ° C에서 일반 인큐베이터에서 플레이트와 장소를 선동.
- 3 일 동안 미디어를 변경하지 마십시오.
- 대 식세포 자극 미디어 3 일 후, 파골 세포의 미디어에 미디어를 변경합니다.
- 이하, 지점, 큰, 다핵 파골 세포가 배양 용기에 표시해야하는 5~7일, 매일 미디어를 변경합니다.
7. 염색 주석 산염 내성 산성 인산 가수 분해 효소 (TRAP)
- 체외 막 다른 5-7 일 후스트럭처는 물론 문화 미디어를 대기음.
- 1X PBS로 3 회 부드럽게 우물을 씻으십시오.
- 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 첨가하여 세포를 고정시키고 39 ° C에서 1 시간 방치.
- 이 시간 동안, 37 ° C로 사전 온난화로 (시판) TRAP 염색을 준비합니다.
- 파라 포름 알데히드에서 1 시간 후, 파라 포름 알데히드를 대기음 및 1X PBS로 부드럽게하는 과정을 3 회 반복한다.
- 플레이트의 각 웰에 미리 예열 TRAP 염색의 1 ML을 추가하는 것은 스테인드합니다.
- 차광 1 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 1 시간 후, TRAP 염색을 대기음.
- 예열 탈 이온수로 우물 3 회 반복한다.
- 1-2 분 길의 헤 마톡 실린 (주)와 잘 Counterstain과.
- 명 시야 현미경을 사용하여 이미지 파골.
- 얼룩의 적절한 색상 강도까지 탈 이온수로 우물을 씻어 핵 블루 나타나는 일반적으로 할 때, 달성전자.
8. 파골 세포의 흡수 분석
- 뼈 기판 또는 무기 성 칼슘 포스페이트 코팅 중 미리 코팅 인 시판의 24 웰 폴리스티렌 배양 접시를 사용한다.
- 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다.
- 각 웰에 2 단계의 단부에서 얻어진 200,000 갓 절연 골수 세포를 추가한다.
- 부드럽게 3 일 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 전에 플레이트를 교반.
- 3 일에서 파골 세포의 분화 미디어에 미디어를 변경합니다.
- 5-7일에 대한 파골 세포의 분화 미디어와 매일 미디어 변경을 수행합니다.
파골 세포의 흡수 활동 9. 정량화
- 후술하는 바와 같이 광물 기판 파골 세포 분화 배지에서 체외 배양 5-7 일 후, resorpti 형성 파골 세포의 능력을 평가하기 위해, 광물 표면을 분석구덩이, 파골 세포의 활동의 지표에.
- 재 흡수 분석 플레이트에서 대기음 미디어와 각 웰에 10 % 표백제 용액 100 μl를 추가합니다.
- RT에서 15 분 동안 10 % 표백제 용액으로 세포를 인큐베이션.
- 증류수로 우물 3 회 반복한다.
- 남아있는 물을 대기음 판에서 여분의 물을 흔들어 3-5 시간 동안 자연 건조 할 수 있습니다.
- 시중에서 판매하는 폰 코사 염색 키트와 함께 접시 Counterstain과 해제 흡수 된 기판을 쉽게 시각화 할 수 있습니다.
- 흡수 된 표면의 대표 부품의 이미지를 취할 밝은 필드 현미경을 사용합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 파골 세포의 재 흡수 활성의 정량화를 허용하도록 흡수 된 표면의 백분율을 계산한다.
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Representative Results
이 방법의 목적은 쉽게 일주 전형적, 시험관 내에서 파골 세포의 다수를 분리 하였다. 파골 세포의 다수의 성공적인 분리가 타르트 레이트 저항성 산성 포스파타제 염색 (도 1A)를 사용하여 확인 하였다. 큰 파골 세포는 여러 개의 핵 (일반적으로 ≥ 3 핵)와 큰 보라색의 세포로 시각입니다. 이 프로토콜을 이용하여, 파골 세포 당 30 개의 핵 (도 1b)와 파골 세포를 분리하는 것이 일반적이다.
광물 표면을 사용하여 in vitro에서 파골 세포의 재 흡수 활동을 평가하는 황금 표준 방법으로 간주됩니다.이 방법을 사용하여 형성 한 광물 표면의 비율, 또는 "재 흡수 구덩이는"파골 세포의 재 흡수 용량의 결정 (그림 2) 수 있습니다.
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파골 세포 유도 조건에서 문화 십일 다음 배양 골수 그림 1. (A) 주석 산염 내성 산성 포스 파타 아제 염색. 10 배 배율에서 밝은 필드 현미경 양 (보라색 염색) TRAP있는 여러 큰, 다핵 파골 세포를 보여줍니다. 큰, 다핵 파골 세포의 예는 적색 점선으로 개략되어있다. (B) 명 시야 현미경을 크고, 다핵, TRAP 양성 파골 세포를 보여주는 10X 배율. 다핵 파골 세포 내 핵의 예는 빨간색 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
10 배 배율에서 그림 2. 밝은 필드 현미경은 파골 세포의 골 흡수 활동에 의해 형성된 흡수 구덩이를 보여줍니다. 광물 행렬 시각화 수 있도록 폰 코사 염색을한다. 블랙 라인 매트릭스의 재 흡수 영역의 예를 간략하게 설명 점선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
쉽게 체외에서 파골 세포의 큰 숫자를 분리하고 배양 할 수있는 능력은 뼈 생물학 및 파골 세포 - 매개 질환의 이해를 전진하는 데 도움에 대한 책임이있다. 이는 최근 파골 세포 분화, 분화 및 생존 16-18의 주요 조절로 확인되었다 때,이 이어질 RANKL의 식별이었다.
그것은 골수에서 파골 세포의 체외 배양은 파종 밀도에 크게 의존하는 우리의 경험이었다. 우리는 골수 유래 세포를 도금시 파골 세포를 수득하고이 프로토콜 실패 차선 시딩 밀도로 인해 일반적으로 관찰. 따라서,이 프로토콜에, 이곳은 24 웰 플레이트 당 20 만 셀을 배정하는 것이 좋습니다. 또한,이 기술에 최대 성공을 달성하기 위해서는, 정확하게 파골 유도 매체를 제조 권장 위와 s로 미디어를 변경하는 바와 같은AME 시간은 매일, 초기 삼일 후에 하나는 문화 판을 방해 할 필요가없는 경우. 이는 파골 세포 유도 인자 매체의 농도를 일정하게 할 수있다. 또한, 우리는 특정 시약의 사용은 또한 다핵 파골 다수의 배양에 대한 큰 가능성을 허용 것을 발견 하였다.
이 기술은 하나의 가속 및 감속 파라미터 및 특정 시약의 조달을 변경할 수있는 RT 원심 분리기의 가용성에 의해 제한된다. 그것은 그렇지 않으면 우리는 나이와 유전 적 배경이 서로 다른 쥐의 범위에서, 많은 성공을 거두었습니다있는 매우 간단한 프로토콜 (예, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, LEP의 DB - / -).
이 기술은 시험관 내에서 파골 세포를 생성하고 광물 행렬을 재 흡수하는 능력을 결정하기 위해 신뢰할 수있는 방법을 제공한다. 이 프로토콜을 사용하면, vitr의 다핵 파골 세포의 다수를 분리 할 수있다O 일반적으로 한 주에. 우리의 경험은 파골 세포의 분리 및 체외 배양은 종종 파골 세포 9,12,14을 배양하는 무능력의 결과로, 파골 세포 생산의 측면에서 매우 다양 결과에서 이전에 발행 된 기술 결과를 사용하는 것입니다.
파골 세포의 기능은 복잡하고 골 흡수는 조골 세포와 파골 세포 (19) 사이의 크로스 토크 (cross-talk)에 의해 지역 수준에서 매개 고도의 조율 과정입니다. 뼈의 균형의 로컬 제어뿐만 아니라, 증거를 신흥 파골 세포의 활동이 면역, 신경, 그리고 다른 체계적인 요인 20-24 관련 요인에 의해 체계적으로 관리됩니다 것이 좋습니다.
파골 세포 생물학의 이해가 뼈 25-27로 암의 전이를 조절하는 역할에 뼈 리모델링에 이르기까지 과정에서의 다양한 역할을 포함, 빠른 속도로 발전을 계속,이 프로토콜은 연구자들로 구성 할 수리언 in vitro에서 파골 세포의 대량을 격리 할 것.
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Disclosures
저자 중에 선언하는 공개 또는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 NIH 보조금 R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, 오크 재단과 소아 재생 의학 Hagey 연구소의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
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