Summary
Osteoklaster er den viktigste ben-resorberende celle i kroppen. En evne til å isolere osteoklaster i store antall har resultert i betydelige fremskritt i forståelsen av osteoclast biologi. I denne protokollen, beskriver vi en metode for isolering, dyrking og kvantifisere osteoklastaktivitet in vitro.
Abstract
Osteoklaster er høyt spesialiserte celler som stammer fra monocytter / makrofagen avstamning av benmargen. Deres unike evne til å resorbere både organiske og uorganiske matriser av bein betyr at de spiller en viktig rolle i regulering av skjelett ombygging. Sammen, osteoblaster og osteoklaster er ansvarlig for den dynamiske sammenkoplingsprosess som involverer både benresorpsjon og bendannelse som virker sammen for å opprettholde normal skjelettet under helse og sykdom.
Som hoved ben-resorberende celle i kroppen, kan endringer i osteoklast differensiering eller funksjon resultere i dyptgripende virkninger i kroppen. Sykdommer assosiert med endret osteoklast-funksjon kan variere i alvorsgrad fra neonatal dødelig sykdom på grunn av manglende evne til å danne et marg plass for hematopoiese, mer vanlig observert patologier så som osteoporose, hvori overdreven osteoklastisk benresorpsjon predisponerer for å frakturere formasjonen.
ent "> En evne til å isolere osteoklaster i høye tall in vitro har åpnet for betydelige fremskritt i forståelsen av remodellesyklusen og har banet vei for oppdagelsen av nye terapeutiske strategier som bekjempe disse sykdommene.Her beskriver vi en protokoll for å isolere og dyrke osteoklaster fra mus benmarg som vil gi et stort antall osteoklaster.
Introduction
Benremodelleringen er dynamisk og innebærer kobling av beindannelse med benresorpsjon en. Dette tett regulert prosessen er ansvarlig for å holde skjelettet under normal homeostase, og som respons på skade og sykdom.
Osteoklaster er unike, flerkjernede celler som er i stand til å resorberende både de organiske og uorganiske matriser av benet. Osteoklaster er utledet fra monocytt- / makrofag avstamning av benmargen 2-5. Abnormaliteter i funksjon eller dannelse av osteoklaster kan resultere i en rekke kliniske patologi, herunder vanlige tilstander som osteoporose.
Evnen til å generere osteoklaster in vitro har åpnet for betydelige fremskritt i vår forståelse av bein biologi 6. Som et resultat, er nye terapeutiske agenter dukker opp for å behandle osteoklast relaterte sykdommer som er ansvarlig for betydelige tilleggslidelser og dødelighet 7 8,9. Bone homeostase endres på en rekke sykdommer, inkludert post-menopausal osteoporose, hvor øket osteoklast-aktivitet som fører til sykdomsfremkallende tap av benmasse og tetthet 10. Med økende tilgjengelighet av transgene mus modeller av menneskelig sykdom, er det flere muligheter til å dechiffrere rolle osteoklaster i menneskelig skjelettsykdommer 11-13.
Tallrike protokoller for osteoklast dyrkningsteknikker vises i litteraturen, med mange variasjoner er beskrevet 9,12,14. Xing og medarbeidere beskriver metoden som er tilsvarende til den protokoll som er beskrevet nedenfor, i sin beskrivelse av osteoclastogenic assays fra murine benmargceller. Men å frigjøre benmargceller etter lang bein innhøsting, Xing et al. Skylle margen hulrom med α-MEM komplett media14. Catalfamo undersøker effekten av hyperglycemi på osteoclast funksjon og beskriver en fremgangsmåte hvor alle celler mobilisert av benmargs spyling blir dyrket i 24 timer, ved hvilket punkt de ikke-adherente celler blir forkastet 12, en teknikk som også brukes av Boyle et al . 9. Disse tidligere publiserte protokoller nødvendiggjøre praktiseringen av spyle benmargen, en langtekkelig praksis, som også introduserer risikoen for en nålestikkskader og tap av verdifull benmarg, som man må kutte begge ender av benet. Protokollen, som vi beskrive, implementerer bruk av en morter og støter for å isolere osteoklaster, som er lik den fremgangsmåte som er beskrevet av makrofager isolert fra Weischenfeldt et al. 15
Vår erfaring er imidlertid at osteoclast isolasjon og in vitro kultur ved hjelp av tidligere publiserte teknikker resultater i variable resultater i form av osteoclast produksjon, som ofte resultereri en manglende evne til å dyrke osteoklaster. Vi har derfor utviklet en protokoll som muliggjør den konsekvente isolering av muse-benmarg til å produsere store antall osteoklaster multinucleated in vitro, med en omtrentlig utbytte på 70-80% av cellene i utgangspunktet belagt dannende makrofager og osteoklaster hvorpå, i nærvær av osteoclast induksjons medier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Etisk uttalelse: All forskning som involverer virveldyr ble utført i henhold protokoller godkjent av Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC).
1. Forberedelse
- Tillat 10 ml kommersielt tilgjengelig densitetsgradient celleseparasjonsmateriale (som inneholder polysucrose og natrium- diatrizoat, justert til en densitet på 1,077 g / ml) for å komme til romtemperatur i et 50 ml konisk rør.
- Forbered strømningscytometri (FACS) buffer med 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS) og 2% kalvefosterserum (FCS). Ta en porsjon på 50 ml, og opprettholde denne aliquot ved RT i bruk i løpet av densitetsgradient celleseparasjonsmateriale trinn.
- Ha en bøtte med is klar til å opprettholde isolert vev og celler i løpet av isoleringsprosedyren.
2. Forbered Culture Media
- Forbered basal media: MEM (Minimal Essential Medium), uten fenol rød (500 ml), glutamat (1x), FCS (10x), 10 000 enheter / ml penicillin (1x).
- Filter basal media med en 0,22 mikrometer filter.
- Forbered benmarg makrofag induksjon media:
- Ta 50 ml basal media utarbeidet i trinn 2.1.
- Legg Prostaglandin E2 (PGE2, Mr 352,465 g / mol) ved 10 -7 M endelig konsentrasjon.
- Legg Makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF) ved 10 ng / ml.
- Ikke filtrere den endelige løsning av benmarg makrofag stimulerende medier.
- Forbered osteoclast induksjon media:
- Ta 50 ml basal media utarbeidet i trinn 2.1.
- Legg Prostaglandin E2 (PGE2, Mr 352,465 g / mol) ved 10 -7 M endelig konsentrasjon
- Legg Makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF) ved 10 ng / ml.
- Legg RANKL på 10 ng / ml.
- Ikke filtrere den endelige løsning av osteoclast induksjon media.
3. Bone Marrow Isolation
- Avlive en C57BL / 6 musved hjelp av karbondioksyd inhalering metoden, etterfulgt av cervikal dislokasjon.
MERK: Gnagere må avlives av fagfolk med riktig teknikk, utstyr og agenter. - Posisjon og sikre muspekeren over en disseksjon brett og spray med 70% alkohol.
- Dissekere ut lårben, skinneben, humeri og ryggrad.
- Begynn med musen i liggende stilling. Gjør et vertikalt snitt langs den nedre ekstremitet, og begynner med å dissekere langs lengden av femur og tibia ved å dividere bløtvev vedlegg. Endelig forrykke bein fra kneet og hofteleddet for å frigjøre bein helt fra skjelettet.
- Fortsett å gjøre et snitt langs lengden av den øvre lemmer for å isolere humerus. Forrykke humerus på skulder- og albueledd ved å dissekere bløtvev kapsel vedlegg.
- Til slutt, slår musen over, slik at musen ligger utsatt. Foreta en hud snitt langs lengden av ryggraden, i midtlinjen. Observer paravertebral mykvev på hver side av ryggraden og incise langs bony kant av ryggraden, dissekere gjennom paravertebral mykt vev masse. Ved hjelp av en saks, foreta en horisontal snitt på tvers av ryggraden ved bunnen av halsen, og ved slutten av ryggraden, proksimalt til halen innsetting, frigjør ryggraden fra bløtvev vedlegg.
- Når knoklene blir høstet, holde dem i FACS buffer på is.
- Bruk silkepapir å rengjøre muskler og bløtvev fra skjelettet.
- Plasser de rensede benene inn i en pistill og morter med 3 ml FACS-buffer.
- Knuse bein forsiktig i morter.
- Aspirer av blod-farget væske og overføring til et 50 ml konisk rør ved å føre løsningen gjennom et 70 um cellefilter.
- Tilsett 5 ml FACS buffer til den knuste bein og knuse videre. Igjen, fjerne væsken ved hjelp av en pipette og overføre til 50 ml konisk rør gjennom en 70 mikrometer sil.
- Vanligvis knuse bein twice til tre ganger i FACS-buffer frisk, ved hjelp av en morter og pistill, hver gang tilsetning av ytterligere 5 ml av frisk FACS-buffer, inntil fluidet ikke flekker rødt.
- Sentrifuger benmargen oppløsning ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C for å gi en cellepellet.
4. Gradient Separering av benmargceller
- Aspirere supernatanten og resuspender i 10 ml FACS-buffer (opprettholdt ved RT).
- Ta 50 ml konisk rør inneholdende 10 ml av kommersielt tilgjengelig densitetsgradient celleseparasjonsmateriale (RT).
- Layer benmargen løsning på densitetsgradient celleseparasjonsmateriale. Gjør dette sakte ved hjelp av en elektrisk pipette. Vinkel pipettespissen mot den indre flate nær toppen av det koniske rør og vippe det koniske røret til omtrent 30 °. Ved hjelp av en langsom hastighet på pipetten, forsiktig utvise benmargen løsning for ikke å forstyrre densitetsgradienten cellen separasjon media.
MERK: Til syvende og sist det vilvære en klar definisjon mellom de to løsningene (mobil løsning og tettshetsgradient celle separasjon medieløsning). - Ved hjelp av en sentrifuge RT, sentrifuger densitetsgradient celleseparasjonsmateriale og celle oppløsning i en balansert sentrifuge ved 200 x g i 15 min. I tillegg, fjerner akselerasjon og retardasjon på sentrifugen for å sikre tilfredsstillende faseseparasjon ved hjelp av densitetsgradienten celleseparasjonsmateriale gradient.
- Etter sentrifugering, aspirer utenfor skyet midterste laget som inneholder benmargceller av interesse.
- Overføre disse celler inn i en ny konisk rør. Tilsett 20 ml ytterligere FACS-buffer (holdes på is) for å vaske cellene.
- Sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter ved 4 ° C for å gi en cellepellet.
- Resuspender den endelige cellepelleten i 1 ml av makrofag stimulerende medier for å tillate celletelling ved hjelp av et hemocytometer.
5. Celletelling
- Ta 10 ul av celleløsningen og blandemed 10 ul av trypanblått. Lasten 10 ul av den resulterende blanding over på et hemocytometer og få celletall per ml oppløsning.
6. celledyrking
- Plassere 2 ml av makrofag stimulerende mediet i hver brønn av en 24-brønns plate.
- Legg 200.000 celler til hver brønn.
MERK: I vår erfaring, er celle-plating tettheten en av de mest avgjørende krav til tilstrekkelig in vitro dyrkning av osteoklaster. - Forsiktig omrøre platen og legges i en vanlig inkubator ved 37 ° C.
- Endrer ikke media i 3 dager.
- Etter 3 dager i makro stimulerende media, endre media til osteoclast media.
- Heretter endre medie daglig i 5-7 dager, på hvilket tidspunkt, bør store, multinucleated osteoklaster være synlig på kultur plate.
7. Farging med tartrate Resistent Acid fosfatase (TRAP)
- Etter 5-7 dager in vitro CulTure, aspirer media fra kulturen godt.
- Vask brønnene forsiktig med 1 x PBS tre ganger.
- Fikser cellene ved tilsetning av 4% paraformaldehyd-oppløsning og la stå i 1 time ved 4 ° C.
- I løpet av denne tiden, forberede TRAP flekk (som er kommersielt tilgjengelig) ved pre-oppvarming til 37 ° C.
- Etter 1 time i paraformaldehyde, aspirer off paraformaldehyde og vask forsiktig tre ganger med 1x PBS.
- Tilsett 1 ml forvarmet TRAP flekk i hver brønn av platen for å bli farget.
- Plassere platen i en inkubator ved 37 ° C i 1 time, skjermet fra lys.
- Etter 1 time, aspirer av TRAP flekken.
- Vask brønnene 3 ganger med forvarmet avionisert vann.
- Counterstain brønnen med Gills Hematoxylin (OBS) i 1-2 min.
- Bilde osteoklaster bruker lyse felt mikroskopi.
- Vask brønner med avionisert vann til en tilstrekkelig fargeintensitet av flekken er oppnådd, vanligvis når atomkjerner vises blue.
8. osteoklastresorpsjonstest analysen
- Bruk en kommersielt tilgjengelig 24-brønnen polystyren kultur rett som er pre-belagt med enten bein substrat eller et uorganisk krystallinsk kalsiumfosfat belegg.
- Plasser 2 ml av makro stimulerende media i hver brønn.
- Legg 200000 nylig isolerte benmargsceller erholdt ved slutten av trinn 2 til hver brønn.
- Forsiktig omrøre platen før plassere den i en inkubator ved 37 ° C i 3 dager.
- På dag tre, endre media til osteoclast differensiering media.
- Utføre daglige medie endringer med osteoclast differensiering media i 5-7 dager.
9. Kvantifisering av osteoklastresorpsjonstest aktivitet
- Etter 5-7 dagers in vitro kultur i osteoklast differensiering medier på en mineralisert substrat, å analysere den mineraliserte overflate, som beskrevet nedenfor, for å vurdere evnen av osteoklaster til å danne resorptipå groper, en indikator på osteoklastaktiviteten.
- Aspirer media fra resorpsjon analyseplaten og tilsett 100 pl 10% blekemiddel til hver brønn.
- Inkuber cellene ved 10% blekemiddel i 15 min ved RT.
- Vask brønnene 3 ganger med destillert vann.
- Aspirer av eventuelle gjenværende vann og rist av overflødig vann fra platen og la det lufttørke i 3-5 timer.
- Counterstain plate med en kommersielt tilgjengelig Von Kossa flekker kit for å tillate enklere visualisering av un-resorbert underlaget.
- Bruk lyse felt mikroskopi for å ta bilder av representative deler av resorbert overflaten.
- Ved hjelp av bildeanalyse programvare, beregne hvor stor andel av resorbed flater, for kvantifisering av osteoklastisk resorptive aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne fremgangsmåten var lett å isolere et stort antall osteoklaster in vitro, typisk i en uke. Vellykkede isolering av store antall osteoklaster ble bekreftet ved hjelp av tartrat-resistent sur-fosfatase-farging (figur 1A). Store osteoklaster er visualisert som store lilla celler med flere kjerner (typisk ≥ 3 kjerner). Ved hjelp av denne protokollen, er det vanlig å isolere osteoklaster med så mange som 30 kjerner per osteoclast (Figur 1b).
Ved hjelp av en mineralisert overflate anses gullstandarden metode for å vurdere osteoklast-resorptive aktivitet in vitro. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, gjør det mulig for prosentandelen av mineralisert overflate, eller resorpsjon "groper" som er utformet for bestemmelse av osteoklast-resorptive kapasitet (figur 2).
_upload / 52056 / 52056fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. (A) tartrate bestandig sur-fosfatase-farging av dyrkede benmarg etter 10 dager i kultur i henhold til osteoklast induktive forhold. Bright feltet mikrograf på 10X forstørrelse demonstrerer flere store, multinucleated osteoklaster som er TRAP positive (lilla flekker). Et eksempel på en stor, multinucleated osteoklast er skissert av en rød stiplet linje. (B) Lys-feltet fotomikrografi ved 10X forstørrelse som viser en stor, flerkjernede, TRAP-positive osteoklast. Et eksempel på en kjerne innenfor en multinucleated osteoclast er vist ved den røde pilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bright feltet mikrograf på 10X forstørrelse demonstrerer resorpsjon groper dannet av osteoklastisk resorpsjonsaktiviteten. Mineralisert matrise er farget med Von Kossa flekken for å gi rom for visualisering. Den svarte stiplede linjer skissere et eksempel på resorberte områder av matrisen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En evne til å enkelt isolere og dyrke et stort antall osteoklaster in vitro har vært ansvarlig for å bidra til å fremme forståelse av bein biologi og osteoklastmediert sykdommer. Det var identifikasjonen av RANKL som fører til dette, når det ble nylig identifisert som hovedregulator for osteoklastdannelse, differensiering og overlevelse 16-18.
Det har vært vår erfaring at in vitro dyrking av osteoklaster fra benmarg er i stor grad avhengig av seeding tetthet. Vi observerte at svikt i denne protokollen for å gi osteoklaster er vanligvis på grunn av en suboptimal seeding tetthet når plating benmargavledede celler. Derfor, i denne protokollen, er det anbefalt å frø 200.000 celler per 24-brønns plate også. Videre, for å oppnå maksimal suksess med denne teknikken, er det anbefalt å fremstille de osteoklast induksjons medier nøyaktig som beskrevet ovenfor, og for å endre mediet ved same tid hver dag, etter at de første tre dagene da man ikke trenger ikke å forstyrre kulturplater. Dette kan tillate at en konstant konsentrasjon av osteoklast induksjonsmedie faktorer. I tillegg har vi funnet at anvendelse av spesifikke reagenser gir også større muligheter for dyrkning av et stort antall multinucleated osteoklaster.
Denne teknikken er begrenset av tilgjengeligheten av en RT sentrifuge, der man kan endre akselerasjon og retardasjonsparametrene og anskaffelse av spesifikke reagenser. Det er ellers en meget enkel protokoll, som vi har hatt stor suksess, i et område på mus av forskjellig alder og genetisk bakgrunn (for eksempel, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, Lep db - / -).
Denne teknikken gir en pålitelig metode for å generere osteoclaster in vitro og for å bestemme deres evne til å resorbere mineralisert matrise. Ved hjelp av denne protokollen, er det mulig å isolere et stort antall multinucleated osteoklaster i vitro typisk i en uke. Vår erfaring er at osteoclast isolasjon og in vitro kultur ved hjelp av tidligere publiserte teknikker resulterer i svært varierende resultater i form av osteoclast produksjon, ofte resulterer i en manglende evne til å dyrke osteoklaster 9,12,14.
Osteoklastfunksjonen er kompleks og benresorpsjon er en svært orkestrert prosess som er formidlet på lokalt nivå ved krysstale mellom osteoblaster og osteoklaster 19. I tillegg til lokal kontroll av bein balanse, nye bevis tyder på at osteoclastaktivitet styres systemisk av forhold knyttet til immun, neuronal og andre systematiske faktorer 20-24.
Som forståelsen av osteoclast biologi fortsetter å fremme hurtig, inkludert deres rolle i forskjellige prosesser som strekker seg fra benremodellering til deres rolle i regulering av kreftmetastaser i ben 25-27, vil denne protokollen tillater forskere å beståently isolere store mengder av osteoclaster in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har avsløring eller interessekonflikt å erklære.
Acknowledgments
Vi erkjenner støtte fra NIH tilskudd R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation og The Hagey Laboratorium for Pediatric Regenerative Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
