Summary
Остеокласты основной клеток костного резорбции в организме. Возможность изолировать остеокластов в больших количествах привело к значительному прогрессу в понимании остеокластов биологии. В этом протоколе, мы опишем метод для изоляции, культивирования и количественного активность остеокластов в пробирке.
Abstract
Остеокласты высоко специализированные клетки, которые являются производными от моноцитов / макрофагов костного мозга. Их уникальная способность поглощать как органические, так и неорганические матрицы кости означает, что они играют ключевую роль в регуляции скелетных ремоделирования. Вместе остеобласты и остеокласты отвечают за динамического процесса связи в который вовлечены и резорбции кости и образование костной ткани, действующее вместе для поддержания нормального скелета во время здоровья и болезни.
В качестве основного клетки костной резорбции в организме, изменение остеокластов дифференциации или функции может привести к глубоким эффектов в организме. Заболевания, связанные с измененной функции остеокластов может изменяться в тяжести от смертельной заболевания у новорожденных из-за отказа сформировать пространство мозга для кроветворения, чтобы чаще наблюдается патологий, таких как остеопороз, в котором чрезмерное остеокластов резорбции кости предрасполагает к разрушению образования.
ЛОР "> Возможность изолировать остеокластов в больших количествах в лабораторных позволило добиться значительных успехов в понимании цикла костного ремоделирования и проложил путь для открытия новых терапевтических стратегий, борьбе с этими заболеваниями.Здесь мы опишем протокол для изоляции и культивировать остеокластов из костного мозга мыши, который будет давать большое число остеокластов.
Introduction
Костного ремоделирования является динамичным и включает муфту формирования костей с костной резорбции 1. Это жестко регулируется процесс отвечает за поддержание скелет в нормальном гомеостаза, и в ответ на повреждение и болезни.
Остеокласты уникальны, многоядерные клетки, которые способны к резорбции как органические, так и неорганические матрицы кости. Остеокласты выводятся из моноцитов / макрофагов костного мозга 2-5. Отклонения в функции или образованием остеокластов может привести в различных клинических патологий, в том числе общих заболеваний, как остеопороз.
Способность генерировать остеокластов в пробирке позволило значительному прогрессу в нашем понимании кости биологии 6. В результате, новые терапевтические агенты для лечения возникающих остеокластов, связанные с заболеваниями, которые ответственны за значительных заболеваний и смертности 7 8,9. Гомеостаза кости изменяется в ряде заболеваний, в том числе постклимактерического остеопороза, в которой увеличена активность остеокластов приводит к патогенным потери костной массы и плотности 10. С увеличением доступности трансгенных мышиных моделях заболеваний человека, есть еще возможность расшифровать роль остеокластов в человеческой болезни костей 11-13.
Многочисленные протоколы методов остеокластов культивирования появляются в литературе, с много вариантов описано 9,12,14. Син и его коллеги описывают аналогичную методику с протоколом, описанным ниже, в их описании osteoclastogenic анализов из мышиных клеток костного мозга. Тем не менее, чтобы освободить клетки костного мозга следующие урожая длинных костей, Син и др. Промывать полость костного мозга с α-MEM полной среде14. Catalfamo исследован эффект гипергликемии на функцию остеокластов и описывает способ, в котором все клетки мобилизовали путем промывки костного мозга культивировали в течение 24 ч, после чего неадгезивные клетки отбрасывали 12, техника также используется Бойл и др . 9 Эти ранее опубликованные протоколы требуют практику промывки костный мозг, утомительной практики, которая также вводит риск травмы иглой и потере ценного костного мозга, как надо отрезать оба конца кости. Протокол, который мы описываем, реализует использование в ступке с пестиком, чтобы изолировать остеокласты, который подобен способу, описанному макрофагов изоляции по Weischenfeldt и др. 15
Наш опыт, однако, является то, что изоляция остеокластов и в культуре пробирке, используя ранее опубликованные методы результаты в переменных результатов с точки зрения производства остеокластов, что часто приводитв неспособности развивать остеокластов. Таким образом, мы разработали протокол, который позволяет для последовательного выделения из костного мозга мыши, чтобы получить большое количество многоядерных остеокластов в пробирке, с приблизительной выходом 70-80% клеток, первоначально плакированных формирования макрофаги и впоследствии остеокласты, в присутствии индукционные остеокластов СМИ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этические заявление: Все исследования с участием позвоночных животных проводили в протоколах соответствии утвержденным Административным панели Стэнфордского на лабораторных животных (APLAC).
1. Подготовка
- Разрешить 10 мл коммерчески доступного разделения градиент плотности клеток средах (который содержит polysucrose и натрия диатризоат, доводили до плотности 1,077 г / мл), чтобы прийти к комнатной температуре в 50 мл коническую пробирку.
- Подготовьте проточной цитометрии (FACS) буфер с 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и 2% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Берут 50 мл аликвоты и поддерживать эту аликвоту при КТ в течение использования во время разделения клеток медиа-ступенчатым градиентом плотности.
- Есть ведро льда, готового поддерживать изолированную ткань и клетки в ходе процедуры изоляции.
2. Подготовка питательных сред
- Подготовьте базальную носитель: MEM (минимальной поддерживающей среде), без фенолового красного (500 мл), глутамат (1x), FCS (10x), 10000 ед / мл penicilliн (1x).
- Фильтр базальной среды с 0,22 мкм фильтр.
- Подготовка кости индукции макрофагов мозга СМИ:
- Возьмем 50 мл базальных средах, полученного на стадии 2.1.
- Добавить простагландина Е2 (ПГЕ2, н 352,465 г / моль) при 10 -7 М конечной концентрации.
- Добавить макрофагов колониестимулирующий фактор (M-CSF) в 10 нг / мл.
- Не фильтровать окончательное решение макрофагов костного мозга стимулирующее СМИ.
- Подготовка остеокластов индукции СМИ:
- Возьмем 50 мл базальных средах, полученного на стадии 2.1.
- Добавить простагландина Е2 (ПГЕ2, н 352,465 г / моль) при 10 -7 М конечной концентрации
- Добавить макрофагов колониестимулирующий фактор (M-CSF) в 10 нг / мл.
- Добавить RANKL в концентрации 10 нг / мл.
- Не фильтровать окончательное решение индукции остеокластов СМИ.
3. костного мозга Изоляция
- Усыпить один C57BL / 6 мышьс помощью метода ингаляции углерода диоксид, а затем смещением шейных позвонков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Грызуны должны быть умерщвлены обученным персоналом с использованием соответствующего техника, оборудование и средства. - Положение и обеспечить мышью на рассечение борту и спрей с 70% спиртом.
- Рассеките из бедренных костей, голени, плечевые кости и позвоночник.
- Начните с мышью в положении лежа на спине. Сделать надрез вертикально вдоль нижней конечности и начинают путем рассечения вдоль длины бедра и голени путем деления вложения мягких тканей. Наконец, вывихнуть кости от колена и тазобедренного сустава, чтобы освободить кости полностью из скелета.
- Продолжить, чтобы сделать разрез по длине верхней конечности, чтобы изолировать плечевую кость. Вывихнуть плечевой кости в плече и локтевых суставов рассечением мягких привязанность ткани капсульный.
- Наконец, поверните курсор, так что мышь лежит склонны. Делают разрез кожи по всей длине позвоночника, по средней линии. Соблюдайте паравертебральная мягкаяткани на каждой стороне позвоночника и надрезать вдоль костной краю позвоночника, рассечения через паравертебрального массы мягких тканей. С использованием ножниц, сделать горизонтальный разрез через позвоночника у основания шеи, и в конце позвоночника, всего проксимальнее вставки хвоста, освобождая позвоночник от прикрепления мягких тканей.
- После того, как кости собирают, держать их в FACS буфера на льду.
- Используйте тонкую бумагу, чтобы очистить мышцы и мягкие ткани от костей.
- Поместите очищенные кости в ступке с помощью пестика с 3 мл FACS буфера.
- Измельчите косточки мягко в ступке с помощью пестика.
- Отберите у окровавленной жидкости и передачи в 50 мл коническую трубку с помощью пропускания раствора через ячейки фильтра 70 мкм.
- Добавить 5 мл FACS буфера для измельченного кости и сокрушить дальше. Опять же, удалить жидкость с помощью пипетки и передать в 50 мл коническую пробирку через 70 мкм сито.
- Обычно раздавить TWI костиCE-три раза в свежем буфере FACS, используя ступку и пестик, каждый раз, добавив еще 5 мл свежего буфера FACS, пока жидкость не не окрашивает в красный цвет.
- Центрифуга решение костного мозга при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С с получением осадок клеток.
4. Градиент Разделение клеток костного мозга
- Аспирата супернатант и ресуспендируют в 10 мл FACS буфера (выдерживают при комнатной температуре).
- Возьмем 50 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл коммерчески доступного разделения градиент плотности клеток средах (RT).
- Слой раствора костного мозга на разделительной ячейки СМИ градиента плотности. Делайте это медленно с помощью электрического пипетки. Угол наконечник пипетки к внутренней поверхности в верхней части конической трубе и наклона конической трубе до приблизительно 30 °. Использование медленный скоростной режим на пипетки, аккуратно изгнать решение костного мозга, чтобы не нарушить разделения клеток СМИ градиента плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ: В конечном итоге там будетбыть четкое определение между двумя решениями (сотовых решений и плотность разделения градиент клеток решений СМИ). - С помощью центрифуги RT, центрифугировать носитель разделения клеток в градиенте плотности и раствор клеток в сбалансированном центрифуге при 200 х г в течение 15 мин. Кроме того, удалить ускорение и замедление на центрифуге, чтобы обеспечить адекватное разделение фаз с помощью разделения клеток медиа градиент в градиенте плотности.
- После центрифугирования аспирации от мутного средний слой, который содержит клетки костного мозга, представляющих интерес.
- Передача этих клеток в новую коническую трубку. Добавить 20 мл дополнительного буфера FACS (держали на льду), чтобы промыть клетки.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С с получением осадок клеток.
- Ресуспендируют осадок клеток окончательное в 1 мл макрофагов стимулирующего средства массовой информации, чтобы позволить для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
5. Сотовый Подсчет
- Принимать по 10 мкл раствора и смешать клеткис 10 мкл трипанового синего. Нагрузка 10 мкл полученной смеси на гемоцитометре и получить число клеток на мл раствора.
6. культивирования клеток
- Поместите 2 мл макрофагов стимулирования среды в каждую лунку 24-луночного планшета.
- Добавить 200000 клеток в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, плотность клеток-покрытие является одним из наиболее важных требований, предъявляемых к адекватным в пробирке культивирования остеокластов. - Аккуратно агитировать тарелку и поставить в регулярной инкубаторе при температуре 37 ° С.
- Не изменяйте СМИ в течение 3 дней.
- После 3-х дней в макрофагов стимулирования СМИ, изменения носителя остеокластов СМИ.
- Далее измените носитель в день в течение 5-7 дней, после чего, большие, многоядерные остеокласты должны быть видны на планшет для культивирования.
7. Окрашивание тартрат Устойчив кислота фосфатазы (TRAP)
- Через 5-7 дней в пробирке кульры, аспирация СМИ от культуры хорошо.
- Вымойте скважин осторожно 1X PBS три раза.
- Зафиксировать клетки путем добавления 4% -ного раствора параформальдегида и оставить на 1 ч при 4 ° С.
- В течение этого времени, подготовить ловушки пятно (который коммерчески доступен) путем предварительного нагрева до 37 ° С.
- После 1 часа в параформальдегиде, аспирация от количества формальдегида и мыть осторожно 3 раза 1x PBS.
- Добавить 1 мл подогретого TRAP пятно в каждую лунку пластины для окрашенных.
- Место пластины в термостате при температуре 37 ° С в течение 1 часа, экранированной от света.
- После 1 часа, аспирация от ловушки пятно.
- Вымойте лунки 3 раза с подогретым деионизированной воды.
- Контрастное колодца гематоксилином Гилла (ВНИМАНИЕ) в течение 1-2 мин.
- Остеокластов изображение, используя яркий микроскопии.
- Промыть лунки с деионизированной водой до тех пор, адекватной интенсивности цвета пятно достигается, как правило, когда ядра появляются BLUе.
8. остеокластов Резорбция Пробирной
- Используйте имеющийся в продаже 24-а полистирол культуры блюдо, которое предварительно наносят либо костной основы или неорганического кристаллического фосфата кальция покрытием.
- Поместите 2 мл макрофагов стимулирования сред в каждую лунку.
- Добавить 200000 свежеизолированных клетки костного мозга, полученные в конце стадии 2, в каждую лунку.
- Аккуратно перемешивать пластину перед помещением его в термостате при 37 ° С в течение 3-х дней.
- На 3-й день, изменения носителя остеокластов дифференцировки.
- Выполните ежедневные изменения медиа с остеокластов дифференцировки в течение 5-7 дней.
9. Количественная оценка остеокластов резорбции деятельности
- Через 5-7 дней культуры в остеокластов дифференцировки на минерализованной подложки в пробирке, анализировать минерализованной поверхности, как описано ниже, для оценки способности остеокластов с образованием resorptiна ямах, индикатор активности остеокластов.
- Аспирируйте СМИ от резорбции планшета для анализа и добавить 100 мкл 10% раствора хлорной извести в каждую лунку.
- Инкубируйте клетки с 10% -ным раствором хлорной извести в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Промыть лунки 3 раза дистиллированной водой.
- Аспирируйте от оставшуюся воду и стряхните воду с плиты и дайте высохнуть на воздухе в течение 3-5 часов.
- Контрастное пластины с коммерчески доступной Von Kossa окрашивания комплекта для обеспечения более легкого визуализации оон-рассасывается подложки.
- Используйте яркий микроскопии для получения изображений представительных частей резорбированной поверхности.
- Использование программного обеспечения для анализа изображений, вычислить процент резорбированной поверхности, чтобы позволить для количественного определения активности остеокластов резорбтивного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель этого метода было легко изолировать большое число остеокластов в пробирке, как правило, в течение одной недели. Успешное выделение большого количества остеокластов была подтверждена с помощью тартрат устойчивостью кислую фосфатазу окрашивание (фиг.1А). Большие остеокластов визуализируются как больших фиолетовых клеток с несколькими ядрами (как правило, ≥ 3 ядер). Используя этот протокол, он является общим для изоляции остеокластов с целых 30 ядер в остеокластов (рис 1b).
Использование минерализованной поверхности считается стандартным методом оценки золото остеокластов резорбтивного активность в пробирке. При использовании этого метода, процент минерализованной поверхности, или "резорбции косточки", которые сформировали позволяет определять остеокластов резорбтивного емкости (рисунок 2).
_upload / 52056 / 52056fig1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1. (А) тартрат устойчивы кислой фосфатазы окрашивание культурного костном мозге после 10 дней в культуре в условиях остеокластов индуктивных. Яркий поле микрофотография с 10-кратным увеличением демонстрирует несколько большие, многоядерные остеокласты, которые TRAP положительным (фиолетовый окрашивание). Пример большим, многоядерных остеокластов очерчен красной пунктирной линией. (B) светлом поле микрофотография в 10-кратным увеличением, демонстрирующего большую, многоядерные, TRAP положительный остеокластов. Примером ядра внутри многоядерных остеокластов показано красной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Яркий поле микрофотография с 10-кратным увеличением демонстрирует резорбции ямы, образованные остеокластической резорбции деятельности. Минерализованная матрица окрашивали фон Kossa пятно для обеспечения визуализации. Черная пунктирными линиями наметить пример резорбируется областях матрицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возможность легко изолировать и вырастить большое количество остеокластов в пробирке был ответственен за помощь для углубления понимания биологии кости и остеокластов-опосредованных заболеваний. Это было определение RANKL, что приведет к этому, когда он был недавно идентифицирован в качестве основного регулятора образование остеокластов, дифференцировки и выживания 16-18.
Это был наш опыт, что выращивание в пробирке остеокластов из костного мозга в значительной степени зависит от плотности посева. Мы заметили, что неудача этого протокола, получая остеокластов, как правило, из-за неоптимального плотности посева, когда покрытие мозга, полученных клеток костного. Таким образом, в данном протоколе, рекомендуется, чтобы отобрать 200000 клеток на 24-луночный планшет хорошо. Кроме того, для достижения максимального успеха с этой техникой, рекомендуется, чтобы подготовить индукции остеокластов носитель точно, как описано выше, и, чтобы изменить носитель в секАм время каждый день, после первых 3-х дней, когда не нужно тревожить культуры пластины. Это может позволить постоянной концентрации факторов индукции остеокластов медиа. Кроме того, мы обнаружили, что использование конкретных реагентов также позволяет больший потенциал для культивирования большого числа многоядерных остеокластов.
Эта методика ограничивается наличием центрифуги РТ, в котором можно изменить параметры ускорения и торможения и закупки специфических реагентов. Это иначе очень простой протокол, с помощью которого мы имели особого успеха, в диапазоне мышей различного возраста и генетические предпосылки (например, C57BL / 6, CD1, NOD SCID, Лепа дБ - / -).
Эта методика предлагает надежный способ генерировать остеокластов в пробирке и определять их способность поглощать минерализованной матрицы. Используя этот протокол, можно выделить большое количество многоядерных остеокластов в ВИТРо, как правило, в течение одной недели. Наш опыт показывает, что изоляция остеокластов и в пробирке культуру, используя ранее опубликованные методы результаты в сильно изменяющихся результатов с точки зрения производства остеокластов, что часто приводит к неспособности вырастить остеокластов 9,12,14.
Функция остеокластов является сложным и резорбции кости представляет собой высоко организованы процесс, который опосредован на местном уровне перекрестных помех между остеобластов и остеокластов 19. В дополнение к местным управлением баланса костной ткани, возникающие данные свидетельствуют о том, что активность остеокластов регулируется системно факторами, связанными с иммунной, нейронов и других систематических факторов 20-24.
Как понимание остеокластов биологии продолжает быстро продвигаться, в том числе их разнообразную роль в процессах, начиная от костной ткани, чтобы их роль в регулировании метастазы рака в кости 25-27, этот протокол позволит исследователям состоятвидимому изолировать большое количество остеокластов в пробирке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов не имеет раскрытие или конфликт интересов объявлять.
Acknowledgments
Мы признаем поддержку грантов НИЗ R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, Фонда Дуб и Hagey лаборатории детской регенеративной медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
