Summary
Osteoklaster är den huvudsakliga benresorberande cell i kroppen. En förmåga att isolera osteoklaster i stort antal har lett till betydande framsteg i förståelsen av osteoklaster biologi. I detta protokoll, beskriver vi en metod för isolering, odling och kvantifiera osteoklastaktivitet in vitro.
Abstract
Osteoklaster är specialiserade celler som härrör från monocyter / makrofager härstamning av benmärgen. Deras unika förmåga att resorberas både organiska och oorganiska matriser av ben gör att de spelar en viktig roll i regleringen av skelett ombyggnad. Tillsammans, osteoblaster och osteoklaster är ansvariga för den dynamiska kopplingen process som involverar både benresorption och benbildning agerar tillsammans för att upprätthålla den normala skelettet under hälsa och sjukdom.
Som den huvudsakliga benresorberande cell i kroppen, kan förändringar i osteoklastdifferentiering eller funktion resultera i djupgående effekter i kroppen. Sjukdomar associerade med förändrad osteoklaster funktionen kan variera i svårighetsgrad från dödlig neonatal sjukdom på grund av underlåtenhet att bilda en märgutrymme för blodbildningen, mer vanligt förekommande sjukdomar som benskörhet, där överdriven osteoklastisk benresorption ökar risken för sprickbildning.
ent "> En förmåga att isolera osteoklaster i stora mängder in vitro har gjort betydande framsteg i förståelsen av benremodellering cykeln och har banat väg för upptäckten av nya terapeutiska strategier som bekämpa dessa sjukdomar.Här beskriver vi ett protokoll för att isolera och odla osteoklaster från musbenmärg som kommer att ge ett stort antal osteoklaster.
Introduction
Benremodellering är dynamisk och involverar kopplingen av benbildning med benresorption 1. Denna hårt reglerad process ansvarar för att upprätthålla skelettet under normal homeostas, och som svar på skada och sjukdom.
Osteoklaster är unika, multinukleära celler som har förmåga att resorberande både de organiska och oorganiska matriser av ben. Osteoklaster härrör från monocyter / makrofager härstamning av benmärgen 2-5. Avvikelser i funktion eller bildning av osteoklaster kan resultera i en mängd olika kliniska patologier, inklusive vanliga tillstånd som osteoporos.
Förmågan att generera osteoklaster in vitro har möjliggjort betydande framsteg i vår förståelse av skelettbiologi 6. Som ett resultat, är nya terapeutiska medel utvecklas för att behandla osteoklast relaterade sjukdomar som är ansvariga för betydande sjuklighet och dödlighet 7 8,9. Benhomeostas förändras på ett antal sjukdomar, bland postmenopausal osteoporos, där ökad osteoklastaktivitet leder till patogena förlust av benmassa och densitet 10. Med ökande tillgången av transgena musmodeller av human sjukdom, det finns större möjlighet att dechiffrera rollen av osteoklasterna i human skelettsjukdom 11-13.
Talrika protokoll för osteoklast odlingstekniker visas i litteraturen, med många variationer beskrivs 9,12,14. Xing och kollegor beskriver liknande metoder protokollet som beskrivs nedan, i sin beskrivning av osteoclastogenic analyser från murina benmärgsceller. Emellertid för att frigöra de benmärgsceller Följande rörben skörd, Xing et al. Spola märgen kavitet med α-MEM komplett medium14. Catalfamo undersöker effekten av hyperglykemi på osteoklast funktion och beskriver en metod i vilken alla celler mobiliseras genom benmärgs spolning odlas under 24 h, vid vilken punkt de icke-vidhäftande cellerna kasseras 12, en teknik som också används av Boyle et al . 9 Dessa tidigare publicerade protokoll kräver bruket att spola benmärgen, en mödosam metoder, vilket också medför en risk för en stickskada och förlust av värdefull benmärg, som man måste skära båda ändarna av benet. Det protokoll, som vi beskriver, implementerar användning av en mortel och mortelstöt för att isolera osteoklaster, som är likartad med metoden enligt makrofag isolering beskrives av Weischenfeldt et al., 15
Vår erfarenhet är dock att osteoklaster isolering och odling in vitro med hjälp av tidigare publicerade tekniker ger variabla utfall i termer av osteoklasterna produktion, vilket ofta lederi en oförmåga att odla osteoklaster. Därför har vi tagit fram ett protokoll som möjliggör konsekvent isolering av mus benmärgen att producera ett stort antal multinukleära osteoklaster in vitro, med en ungefärlig avkastning på 70-80% av cellerna initialt pläterade bildar makrofager och därefter osteoklaster, i närvaro av osteoklast induktionsmedia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Etiska riktlinjer: All forskning på ryggradsdjur har utförts enligt protokollen godkänts av Stanford administrativa panelen för Laboratory Animal Care (APLAC).
1. Förberedelser
- Tillåt 10 ml kommersiellt tillgänglig densitetsgradient cellseparationsmedia (som innehåller polysackaros och natrium-diatrizoat, justerades till en densitet av 1,077 g / ml) för att komma till RT i ett 50 ml koniskt rör.
- Förbered flödescytometri (FACS) buffert med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 2% fetalt kalvserum (FCS). Ta en 50 ml alikvot och upprätthålla denna alikvot vid RT för användning under densitetsgradient cellseparationsmedia steget.
- Ha en hink med is redo att upprätthålla isolerade vävnader och celler i under isoleringsförfarandet.
2. Förbered Odlingsmedia
- Förbered basalmedia: MEM (Minimal Essential Medium), utan fenolrött (500 ml), glutamat (1x), FCS (10x), 10.000 enheter / ml penicillin (1x).
- Filtrera basala medier med ett 0,22 pm filter.
- Förbered benmärg makrofager induktionsmedia:
- Ta 50 ml av de basala media framställts i steg 2.1.
- Lägg Prostaglandin E2 (PGE2, Mr 352,465 g / mol) vid 10 -7 M slutlig koncentration.
- Lägg makrofag-kolonistimulerande faktor (M-CSF) vid 10 ng / ml.
- Filtrera inte den slutliga lösningen av benmärgs makrofagstimulerande media.
- Förbered osteoklastaktivitet induktion media:
- Ta 50 ml av de basala media framställts i steg 2.1.
- Lägg Prostaglandin E2 (PGE2, Mr 352,465 g / mol) vid 10 -7 M slutkoncentration
- Lägg makrofag-kolonistimulerande faktor (M-CSF) vid 10 ng / ml.
- Lägg RANKL vid 10 ng / ml.
- Filtrera inte den slutliga lösningen av osteoklaster induktionsmedia.
3. Benmärgs Isolering
- Euthanize en C57BL / 6 musmed användning av inhalation av koldioxid metod, följt av cervikal dislokation.
OBS: Gnagare måste avlivas av utbildad personal med lämplig teknik, utrustning och agenter. - Placera och fäst musen på en dissektion styrelse och spraya med 70% alkohol.
- Dissekera ut lårben, skenben, överarmsben och ryggraden.
- Börja med musen i ryggläge. Gör ett snitt vertikalt längs den nedre extremiteten och börja med att dissekera längs längden av lårbenet och skenbenet genom att dividera mjukdelsbilagor. Slutligen, rubba ben från knäet och höftleden att befria ben helt från skelettet.
- Fortsätta för att göra en incision längs längden av den övre extremiteten för att isolera humerus. Rubba överarmsbenet vid axel och armbåge lederna genom att dissekera mjukvävnad kapsel fastsättning.
- Slutligen, vrid musen över, så att musen ligger benägen. Göra ett hudsnitt längs längden av ryggraden, i mittlinjen. Observera paravertebrala mjukavävnad på vardera sidan av ryggraden och incise längs den beniga kanten av ryggraden, dissekera genom paravertebrala mjuka vävnadsmassan. Med användning av en sax, göra ett horisontellt snitt över ryggraden vid basen av halsen, och vid slutet av ryggraden, alldeles proximalt till svansen införing, vilket frigör ryggraden från mjuk vävnad fastsättning.
- När benen skördas, hålla dem i FACS-buffert på is.
- Använd silkespapper för att rengöra muskler och mjukdelar från benen.
- Placera de rengjorda ben i en mortel med 3 ml FACS-buffert.
- Krossa benen försiktigt i mortel.
- Sug bort blodfläckade vätska och överföring in i ett 50 ml koniskt rör genom att passera lösningen genom ett 70 ^ m cellfilter.
- Tillsätt 5 ml FACS buffert till den krossade ben och krossa ytterligare. Återigen, ta bort vätskan med hjälp av en pipett och överföra till 50 ml koniska rör genom en 70 pm sil.
- Typiskt krossa benen twice till tre gånger i färsk FACS-buffert, med användning av en mortel och mortelstöt, varje gång tillsätta ytterligare 5 ml färskt FACS-buffert, tills vätskan inte färgas röd.
- Centrifugera benmärgen lösningen vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C för att ge en cellpellet.
4. Gradient Separation av benmärgsceller
- Aspirera supernatanten och återsuspendera i 10 ml FACS-buffert (som hölls vid RT).
- Ta 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml av kommersiellt tillgänglig densitetsgradient cellseparationsmedia (RT).
- Layer benmärgen lösningen på densitetsgradient cellseparationsmedia. Gör detta långsamt med hjälp av en elektrisk pipett. Vinkel pipettspetsen mot innerytan nära toppen av det koniska röret och luta det koniska röret till ca 30 °. Med användning av en långsam hastighet inställning på pipett försiktigt utvisa benmärgen lösning för att inte störa den densitetsgradient cellseparationsmedia.
OBS: I slutändan kommer det attfinnas en tydlig definition mellan de två lösningarna (cellulär lösning och densitetsgradient cellseparationsmedia lösning). - Med användning av en RT-centrifug, centrifugera densitetsgradient cellseparationsmedia och cell lösning på ett balanserat centrifugera vid 200 xg under 15 min. Dessutom avlägsna acceleration och retardation på centrifugen för att säkerställa tillräcklig fasseparation med användning av densitetsgradient cellseparationsmedia-gradient.
- Efter centrifugering, aspirera bort den grumliga mellanskiktet som innehåller de benmärgsceller av intresse.
- Överför dessa celler i en ny koniska rör. Tillsätt 20 ml ytterligare FACS-buffert (hölls på is) för att tvätta cellerna.
- Centrifugera vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C för att ge en cellpellet.
- Resuspendera slutliga cellpelleten i 1 ml av makrofagstimulerande medier för att möjliggöra för cellräkning med användning av en hemocytometer.
5. Cellräkning
- Ta 10 | il av cellösningen och blandamed 10 pl av trypanblått. Belastning 10 | il av den resulterande blandningen på en hemocytometer och erhålla cellantalet per ml lösning.
6. cellodling
- Placera 2 ml av makrofagstimulerande media i varje brunn i en 24-brunnsplatta.
- Lägg 200.000 celler till varje brunn.
OBS: Enligt vår erfarenhet är cell-plating tätheten en av de viktigaste kraven för adekvat in vitro odling av osteoklaster. - Skaka försiktigt plattan och lägg i en vanlig inkubator vid 37 ° C.
- Ändra inte media i 3 dagar.
- Efter 3 dagar i makrofagstimulerande media, ändra media till osteoklaster media.
- Härefter ändra medierna dagligen under 5-7 dagar, vid vilken tidpunkt, bör stora, multinukleära osteoklaster vara synliga på odlingsplattan.
7. Färgning med Tartrat syrafosfatas (TRAP)
- Efter 5-7 dagar av in vitro-cultur, aspirera media från kulturen väl.
- Tvätta brunnarna försiktigt med 1x PBS tre gånger.
- Fixera cellerna genom tillsats av 4% paraformaldehydlösning och låt stå i 1 h vid 4 ° C.
- Under denna tid, förbereda TRAP fläcken (som är kommersiellt tillgängliga) genom för-värmning till 37 ° C.
- Efter 1 timme i paraformaldehyd, aspirera av paraformaldehyd och tvätta försiktigt 3 gånger med 1 x PBS.
- Tillsätt 1 ml förvärmda TRAP fläcken i varje brunn i plattan som skall färgas.
- Placera plattan i en inkubator vid 37 ° C under 1 h, skyddat från ljus.
- Efter 1 h, aspirera bort TRAP fläcken.
- Tvätta brunnarna tre gånger med förvärmda avjoniserat vatten.
- Motfärg brunnen med Gills hematoxylin (FÖRSIKTIGHET) under 1-2 min.
- Bild osteoklaster använder ljusfältsmikroskopi.
- Tvätta brunnarna med avjoniserat vatten tills en lämplig färgintensitet av fläcken har uppnåtts, typiskt när kärnorna visas blue.
8. osteoklast Resorption Assay
- Använd en kommersiellt tillgänglig 24 brunnar polystyren odlingsskål som är pre-beläggs med ben substrat eller ett oorganiskt kristallint kalciumfosfatbeläggning.
- Placera 2 ml makrofagstimulerande media i varje brunn.
- Lägg 200,000 nyisolerade benmärgsceller som erhållits vid slutet av steg 2 till varje brunn.
- Skaka försiktigt plattan innan den placeras i en inkubator vid 37 ° C under 3 dagar.
- Dag 3, ändra media att osteoklastdifferentiering media.
- Utför dagliga medie förändringar med osteoklastdifferentiering medier i 5-7 dagar.
9. Kvantifiering av osteoklaster Resorption aktivitet
- Efter 5-7 dagar av odling in vitro i osteoklastdifferentiering media på ett mineraliserat substrat, analysera den mineraliserade ytan, såsom beskrivs nedan, för att bedöma förmågan hos osteoklaster för att bilda resorptiom gropar, en indikator på osteoklastiska.
- Aspirera media från resorption analysplattan och tillsätt 100 ìl av 10% blekmedel lösning till varje brunn.
- Inkubera cellerna med 10% blekmedelslösning under 15 min vid RT.
- Tvätta brunnarna tre gånger med destillerat vatten.
- Aspirera bort eventuellt kvarvarande vatten och skaka av överflödigt vatten från plattan och låt lufttorka i 3-5 timmar.
- Kontrast plattan med en kommersiellt tillgänglig Von Kossa färgning kit för att möjliggöra enklare visualisering av un-resorberas substrat.
- Använd ljusfältsmikroskopi att ta bilder av representativa delar av resorberas ytan.
- Använda bildanalys programvara, beräkna hur många procent av resorberas ytan för att möjliggöra kvantifiering av osteoklastisk resorptiv aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med denna metod var att lätt isolera ett stort antal osteoklaster in vitro, typiskt i en vecka. Framgångsrik isolering av stora antal osteoklaster bekräftades med användning av tartrat-resistent surt fosfatas-färgning (Figur 1A). Stora osteoklaster visualiseras som stora lila celler med flera kärnor (typiskt ≥ 3 kärnor). Med hjälp av detta protokoll, är det vanligt att isolera osteoklaster med så många som 30 kärnor per osteoklaster (Figur 1B).
Med hjälp av en mineraliserad yta anses vara den gyllene standarden metoden för bedömning av osteoklaster resorptiv aktivitet in vitro. Med hjälp av denna metod, andelen mineraliserad yta, eller "resorption gropar" som har bildats tillåter bestämning av osteoklaster resorptiv kapacitet (Figur 2).
_upload / 52056 / 52056fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. (A) tartrat syrafosfatas färgning av odlade benmärgs efter 10 dagar i odling enligt osteoklaster induktiva förhållanden. Ljusa fält mikroskop vid 10x förstoring visar flera stora, multinukleära osteoklaster som är TRAP positiva (lila färgning). Ett exempel på ett stort, multinukleära osteoklaster beskrivs av en röd streckad linje. (B) Ljusfält mikroskop vid 10x förstoring som visar ett stort, multinukleära, TRAP positiva osteoklaster. Ett exempel på en kärna i en multinukleära osteoklaster visas med den röda pilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Ljusfält mikroskop vid 10x förstoring visar resorption gropar som bildas av osteoklastisk resorption aktivitet. Mineralized matris färgas med Von Kossa fläcken för att möjliggöra visualisering. Den svarta streckade linjer beskriva ett exempel på resorberas områden matris. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En möjlighet att enkelt isolera och odla ett stort antal osteoklaster in vitro har ansvarat för att hjälpa till att främja förståelse av ben biologi och osteoklastförmedlad sjukdomar. Det var identifieringen av RANKL som leder till detta, när det var nyligen identifierats som den huvudsakliga regulatorn av osteoklastbildning, differentiering och överlevnad 16-18.
Det har varit vår erfarenhet att odling av osteoklaster från benmärg in vitro är till stor del beroende av såddtäthet. Vi observerade att ett misslyckande av detta protokoll för att ge osteoklaster är oftast på grund av en suboptimal såddtäthet vid plätering benmärgsderiverade celler. Således, i detta protokoll, rekommenderas att ympa 200.000 celler per 24-brunnar väl. I syfte att uppnå maximal framgång med denna teknik, är det rekommenderat att förbereda osteoklast induktionsmedia exakt som beskrivits ovan och för att ändra media vid same tid varje dag, efter de första 3 dagarna när man inte behöver störa odlingsplattor. Detta kan ge en konstant koncentration av osteoklaster induktionsmedie faktorer. Dessutom har vi funnit att användningen av specifika reagens ger också större potential för odling av ett stort antal flerkärniga osteoklaster.
Denna teknik är begränsad genom tillgängligheten av en RT-centrifug, i vilka en kan förändra acceleration och retardation parametrar och tillvaratagande av specifika reagens. Det är annars en mycket enkel protokoll, som vi har haft stor framgång, i en rad olika möss med olika ålder och genetisk bakgrund (t.ex. C57BL / 6, CD1, NOD SCID, Lep db - / -).
Denna teknik ger en tillförlitlig metod för att generera osteoklaster in vitro och att bestämma deras förmåga att resorberas mineraliserad matrix. Med hjälp av detta protokoll, är det möjligt att isolera ett stort antal multinukleära osteoklaster i Lifeo typiskt i en vecka. Vår erfarenhet är att osteoklaster isolering och odling in vitro med hjälp av tidigare publicerade tekniker resulterar i mycket varierande resultat när det gäller osteoklasterna produktion, vilket ofta leder till en oförmåga att odla osteoklaster 9,12,14.
Osteoklast-funktionen är komplex och benresorption är en högt iscensatt process som förmedlas på den lokala nivån av överhörning mellan osteoblaster och osteoklaster 19. Förutom lokal styrning av ben balans, nya belägg för att osteoklastaktivitet styrs system av faktorer relaterade till immun, neuronal och andra systematiska faktorer 20-24.
Eftersom förståelsen av osteoklaster biologi fortsätter att avancera snabbt, inklusive deras skiftande roll i processer, från benremodellering till deras roll i regleringen av cancermetastaser till ben 25-27, kommer detta protokoll gör det möjligt för forskare att bestålunda isolera stora mängder av osteoklaster in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har avslöjande eller intressekonflikt att deklarera.
Acknowledgments
Vi omnämna det stöd från NIH bidrag R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, The Oak Foundation och The Hagey Laboratorie för Pediatric regenerativ medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget's Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O'Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
