ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.
Abstract
החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, מציעה רפרטואר של כלים ניסיוניים למחקרים גנטיים והתפתחותיים, כולל רצף מבואר באופן מלא הגנום, transgenesis מבוסס transposon, והתערבות יעילה RNA (RNAi). בין יתרונות אלה, טכניקות גן מציאה RNAi מבוססות נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב חיים פשוט על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית.
בדו"ח זה, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בט castaneum. הפרוטוקול כולל בידוד (i) של השלב הנכון של ט זחלי castaneum להזרקה, (ii) הכנה להגדרת ההזרקה, וכן (iii) הזרקת dsRNA. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה שמספקת לנו גישה מהירה לphenotyp אובדן של הפונקציהes, כולל פנוטיפים מרובים גן מציאה, כמו גם סדרה של פנוטיפים hypomorphic. מאז כמעט כל ט רקמות castaneum רגישות לdsRNA תאי, טכניקת RNAi הזחל מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים, כולל את הבסיס הגנטי של תגובות האורגניזם לסביבה החיצונית. בנוסף, הפשטות של טכניקה זו מעוררת יותר מעורבות סטודנטים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מערכת גנטית אידיאלית לשימוש בסביבה בכיתה.
Introduction
החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, הוא צוברת פופולרי בתחומים שונים של ביולוגיה נובעת בחלקו את הקלות של ביצוע התערבות RNA (RNAi) 1-3. טכניקות גן מציאה מבוססת RNAi לאפשר למדענים לבצע פסד של פונקצית ניתוחים ללא שימוש בשיטות גנטיות מורכבות. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב באמצעות הזרקה פשוטה של פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית 4-6. מציאה בו זמנית של מספר רב של גנים היא גם אפשרית בט castaneum על ידי הזרקת שתיים או יותר מולקולות dsRNA שונות באותו הזמן 7,8. בנוסף, סדרה של פנוטיפים hypomorphic יכולה להיות שנוצרה על ידי הפחתת הריכוז של הזריק dsRNA 8. תכונות אלו הופכות את החלופות אטרקטיביות טכניקות גנטיות הפוכים מבוסס RNAi לגנטיקה קדימה מסורתית בט castaneum. מאז כמעטכל ט רקמות castaneum רגישות למולקולות dsRNA תאיים 9, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים. בנוסף, למרות שדו"ח זה מתמקד בביצוע RNAi בט castaneum, נהלים רבים המתוארים כאן חלים על חרקים אחרים. לכן, פרוטוקול זה שימושי למי שרוצה לבצע פסד של פונקצית הניתוח בהקשרי עניין שלהם בט castaneum, כמו גם עבור חוקרים המבקשים להחיל טכניקה מבוססת RNAi לחרקים אחרים.
הזרקה לתוך dsRNA זחלים מאפשרת אנליזה פונקציונלית במגוון שלבי חיי חיפושית, כוללים זחל, הגולם, ומבוגר בשלבים 4,5,10. יש לנו שדווחו בעבר הפרוטוקול שלנו כולל זחל RNAi לרבות נהלי ביולוגיה מולקולרית 11. בדו"ח הנוכחי, אנו מתמקדים הבמתארים את נהלי הזרקת dsRNA, אשר הסבירו הטובים ביותר עם עוזרים חזותיים. אנו מספקיםנהלים מפורטים צעד אחר צעד הזרקה, כמו גם דוגמאות הזרקה טובות ורעות. פרוטוקול חזותי זו משלים הפרוטוקול הקודם שלנו, וכאשר בשילוב, הם מספקים תמונה מקיפה יותר של נהלי RNAi זחל בט castaneum. בנוסף, אנו דנים פרמטרים למולקולות dsRNA שיכול להשפיע על ההצלחה של RNAi, יישום של מבחני מבוססי RNAi למחקר פיסיולוגי, כמו גם תחולתו של פרוטוקול RNAi זחל במעבדה הוראה.
Protocol
1 ט מניות castaneum וCulturing
- החלט על T. זן castaneum להשתמש לצורך הניסוי.
הערה: ט-הוקם מעבדה כמה זני castaneum זמינים. Ga-1 (גאורגיה-1) הוא הזן של ההורים של Ga-2 ששימש לקביעת רצף הגנום 3. מאז Ga-1 המניות ביותר פולימורפיזם DNA (כגון פולימורפיזם של נוקלאוטיד בודד, SNPs) עם Ga-2, והוא בריא יותר מGa-2 עקב פחות הכלאות, הוא אידיאלי עבור ניסויי RNAi. Pu-11 הוא זן נוח אחר להשתמש , כביטוי הייחודי שלה משופר צהוב חלבון פלואורסצנטי (EYFP) בprimordia אגף העתיד מאפשר לנו להבחין instar הזחל האחרון מinstars האחר (ראה איור S4 של קלארק-Hachtel et al. 2013 12). חשוב לתעד את אשר חיפושית מתח היה בשימוש בניסוי, כרקע גנטי נראה באופן משמעותי AFFect RNAi פנוטיפים 13. - הכן ט קמח תרבות castaneum ידי הוספת 5% (לפי משקל) של שמרי הבירה-הסתנן מראש לקמח מחיטה מלאה אורגני (לאחר הערבוב, לאחסן את קמח התרבות ב-20 מעלות צלזיוס). Aliquot קמח התרבות (בטמפרטורת חדר) לתוך 6 בקבוקי פלסטיק עוז מניית דרוזופילה (כ -40 גר '/ בקבוק).
- ט תרבות castaneum ב30 מעלות צלזיוס עם לחות 70%. השתמש בחממה מבוקרת לחות במידת האפשר. להוסיף 30-40 מבוגרים לבקבוק תרבות (זכר: נקבת יחס 1: 1) כדי להתחיל את התרבות.
הערה: למרות שהעובש הוא לעתים רחוקות בעיה ב30 מעלות צלזיוס, טמפרטורות נמוכות יותר (C כגון 25 °) עם לחות 70% יכולים לגרום לצמיחת עובש בקמח התרבות. מנמיכים את לחות אם זה קורה. - העבר את המבוגרים לבקבוק תרבות חדש בכל שבועיים לsubculturing (ראה שלב 5.2-5.5 לאיך לבודד את המבוגרים מקמח התרבות).
הערה: זה לוקח בערך שלושה שבועות כדי לקבל את זחלי instar האחרונים. Alternatively, ט יכולות להיות כל הזמן תרבויות castaneum בטמפרטורה נמוכה יותר (20-25 ° C), אם כי בתקופה ארוכה יותר culturing (זמן התפתחותי ב25 ° C הוא כ כפול ב30 מעלות צלזיוס).
2 הכנת פתרונות ומכשירים להזרקת הזחל dsRNA
- לסנתז מולקולות dsRNA הומולוגיות לגן המטרה על ידי שעתוק במבחנה. אחסן ב-80 מעלות צלזיוס. ראה פיליפ וTomoyasu 2011 11 לנוהלי ביולוגיה מולקולריים מפורטים. כמו כן ראה דיון למספר הפרמטרים שצריכים להילקח בחשבון בעת תכנון מולקולות dsRNA.
- הפוך 10 מ"ל של 0.1 חיץ פוספט M נתרן (pH 7.6 ב25 ° C) על ידי ערבוב 8.5 מ"ל של 1 M Na 2 HPO 4 עם 1.5 מ"ל של 1 M לאא 2 PO 4. בדוק את pH עם מד pH ולהתאים בהתאם.
- הפוך 1 מ"ל של חיץ 10x הזרקה על ידי ערבוב 10 μl של 0.1 M חיץ פוספט נתרן (pH 7.6 25 מעלות צלזיוס), 100 _6; l של 0.5 M KCl, של צבע מאכל ירוק 100 μl, ו790 μl מים מזוקקים כפולים (DDH 2 O). לדלל את חיץ 10x ההזרקה לעשות חיץ הזרקת 2x (O 200 חיץ הזרקת μl 10x + 800 μl DDH 2). לאחסן 10x והזרקת 2x מאגרים על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
- הכן דביקות זכוכית שקופיות.
- כסה שקופיות זכוכית שלמות עם צורה של דבק repositionable זריקות זחל. לזריקות למבוגרים או גלמים, לעשות שתי רצועות דקות של דבק בשולי הארוכים יותר השקופיות.
- אפשר מדביק להתייבש במשך כמה ימים, אשר מבטיח כי הדבק נשאר דביק מספיק כדי לדבוק חיפושיות לשקופית, תוך שמירה גם גמיש מספיק כדי להקל על הסרתם לאחר הזרקה.
הערה: אם הדבק נשאר דביק מדי, להשתמש באצבע ולהקיש על הדבק, אשר תפחית את הדביקות. כל שקופית יכולה להכיל עד 40 או 50 חיפושיות, וניתן לעשות שימוש חוזר עד שלא מצליח להחזיק באופן מאובטח בעלי החיים. Alternatively, יכולה לשמש גם קלטת דו צדדית, למרות שהקלטת ולפעמים לא דבק מספיק כדי להחזיק את הזחלים.
- הפוך סל Etherization.
- הסר את הבוכנה ממזרק חד פעמי מ"ל 10, ולחתוך את המזרק במחצית סביב קו 6 מ"ל.
- מחק את החצי התחתון של המזרק. בקצרה לחמם את פני השטח החתך של חלק העליון של המזרק עם מבער גז, ולדחוף את הפלסטיק נמס במהירות על גבי פיסת רשת ניילון להדביק את הרשת על גבי המזרק. לחתוך כל רשת עודפת פעם הפלסטיק מתקשה.
- הכן את בקבוק האתר. הוסף 30 מ"ל של אתר לתוך בקבוק זכוכית 100 או 250 מ"ל צר פה. להוסיף כמה חתיכות של נייר טישו על מנת לשפר את האידוי של אתר.
הערה: Ether מציג סכנת שריפה, והוא גם מזיק. תמיד טפלנו באתר מתחת למכסת מנוע קטר. סגור את המכסה בחוזקה בזמן שאינה בשימוש.
הערה: קרח יכול לשמש כחלופה בטוחה יותר (כגון בסביבה בכיתה), למרות שsedation הוא פחות יעיל.
.3 הכנת מכשירי הזרקת הזחל
- הנח שלב מכאני XY על מיקרוסקופ לנתח.
הערה: שלבי XY מכאני זמינים מחברות מיקרוסקופ גדולות. לחלופין, שלבי מיקרוסקופ זולים יכולים לשמש גם עבור רוב המיקרוסקופים לנתח עם כמה שינויים (ראה טבלת חומרים לדוגמא). - הנח מניפולטור מחט מכאני ליד הבמה המכנית XY.
- להרכיב מזרק הזרקה. השתמש בברזלים לארבעה צדדים (עם חיבורי Luer) כדי להתחבר מזרק חד פעמי מ"ל 30 לבעל מחט זכוכית, המאפשר מניפולציה של מזרק הזריקה מבלי להשפיע על הלחץ במחט הזריקה (ראה פיליפ וTomoyasu 2011 11 למזרק ההזרקה מפורט הרכבה).
.4 מחטי הזרקת משיכת
- משוך מחטי זכוכית בורוסיליקט (B100-50-15, OD: 1 מ"מ, ID: 0.5 מ"מ, 15 אורך סנטימטר) על ידיחולץ מחט.
הערה: לקבלת סאטר P-87 או P-97, להשתמש בהגדרה "החום = 70, משוך = 45, Vel = 75, זמן = 90" או מעקב פרק 2 של ספר בישול פיפטה: תא חסיד, ג elegans, דרוזופילה, ודג הזברה - מומלצת תוכניות. ההגדרות אופטימליות להשתנות בהתאם לדגם של חולץ המחט. ההגדרה למחט זריקת דרוזופילה גנריות היא נקודת התחלה טובה. - חנות משכה מחטים במקרה פלסטיק (לדוגמא, במקרה תקליטור פלסטיק) ובטוח עם מרק הרכבה נשלף.
.5 בידוד ובחירה של זחלים
- הנח 25 מסננת # אל תוך מקלט מסננת.
- מניחים את התוכן של בקבוק התרבות (חיפושיות וקמח התרבות) במסננת, ולנפות את התוכן באופן מיידי. אל תשאיר את התוכן במסננת ללא סינון, כזחלים ינסו במהירות לחמוק מבעד למסננת ונתקע. אגרסיביות לנפות את התוכן כדי לאפשר את קמח הסתיודרך ולהשאיר את הזחלים בוגרים (בדרך כלל 6 וה 7 זחלי instar ה), גלמים, ומבוגרים (יחד עם העור הקרני שלהם נזרק, exuviae) מאחורי על גבי המסננת.
- העבר את החומרים שנותרו במסננת (חיפושיות וexuviae) למחבת הזרע. לשמור הקשה המחבת כדי למנוע החיפושיות לברוח.
- הסר את exuviae וחלקיקי הקמח שנותרו על פני השטח של החיפושיות בעדינות על ידי נושבת על פני מחבת הזרע.
- הקש על מחבת הזרע להעביר את התוכן לתחתית המחבת. לאחר מכן, לעזוב את המחבת שלא נוצל במשך כמה שניות. חכה למבוגרים, שהם יותר ניידים מאשר שלבים אחרים, לצאת מהערימה. הסר מבוגרים באמצעות מכחול אמנות (למשל, רוחב 1 סנטימטר).
- גלמים נפרדים בעדינות על ידי דפיקות מחבת הזרע תוך שמירה על הפה של המחבת מעט כלפי מטה, כגלמים נוטים להתגלגל מהר יותר לכיוון הפה. להשתמש במכחול כדי להסיר את הגלמים, ומשאיר רק את הזחלים על מחבת הזרע.
- Plאס הזחלים המבודדים בצלחת פטרי נקייה. בחר שלב מתאים של זחלים להזרקה ומניח אותם בצלחת פטרי נפרדת.
הערה: זחלים מוקדמים האחרונים instar (1-2 יום לאחר נשירת הזחל הסופית) היא לעתים קרובות מתאימה בעת ניתוח השפעת RNAi על מורפולוגיות מבוגרות כמו גם על מטמורפוזה. הוא, לעומת זאת, לפעמים יש צורך לבצע RNAi בהלפני האחרון שלב (או אפילו קודם לכן) כדי להעריך את תפקוד גן מוקדם (לדוגמא, איורים 3E-3H. ראה גם קלארק-Hachtel et al. 2013 12). השתמש גלמים כהתייחסות גודל לזהות instar של זחלים. זחלי instar האחרונים הם מעט יותר מגלמים. לחלופין, pu-11 יכולים לשמש כדי לזהות את זחלי instar האחרונים, כמו גם כדי לקבוע את המהלך של הפיתוח של זחלי instar האחרונים (איור S4 של קלארק-Hachtel et al. 2013 12) הזמן. - שמור את הזחלים שנבחרו בצלחת פטרי עד etherization. הנח את שארשל זחלים ושלבים אחרים של חיפושיות (כגון גלמים ומבוגרים) בחזרה לבקבוק תרבות עם קמח ולהחזיר אותו לחממה.
.6 הכנת מחטי הזרקה
- מניחים מחט זכוכית משך בעבר לשקופית מיקרוסקופ זכוכית או באמצעות נקודת סימון דביק או קלטת דו צדדית. בעזרת מלקחיים, לבדוק את הסוף משך את המחט תוך מבט דרך מיקרוסקופ לנתח כדי לראות היכן עיקולים הקצה. תפוס את האזור מעט לכיוון צד קצה שבו מתכופף המחט עם המלקחיים וטוויסט לשבור.
- שמור מחטים טובות וזורקים אחרים. קחו למשל מחט טובה כמו שיש פתח כי הוא לא גדול מדי ולא קטן מדי (כ 0.05 קוטר מ"מ. איורים 1 א ו -1 B), והוא בזווית כדי להפוך את החדירה של ציפורן הזחל קל יותר (1B דמויות ו2A-2B). קחו למשל מחט רעה כמו (i) קטנה מדי, מה שהופך את הספיגה של פתרון dsRNA לתוך מחט diffiפולחן (1D דמויות ו2D) (שלב 7), (ii), (ג 1 דמויות ו2F) הגדולים מדי שיגרום לפגיעת זחל וקטלני אפשריים על זריקה, (iii) בוטה חדירה עושה, של פגיעה הקשה והגדלת הציפורן.
- הכנס את המחט לתוך מחזיק המחט.
- ראשית, להתיר את קצו של בעל המחט ולמקם את הקצה האחורי של המחט לתוך קצה בעל. לאחר מכן, הנח את אטם הגומי מתחת לקצה בעל (לפחות 1 סנטימטר מהקצה האחורי של מחט הזכוכית).
- הכנס את החלק האחורי של המחט לתוך המחזיק, עם אטם הגומי המוכנס כהלכה לתוך הפתיחה של בעל המחט. הברג את הקצה לאחור על בעל.
- הנח את מחזיק המחט התאסף על מניפולטור המחט. שמור את בעל המחט קרוב לאופקי. להתאים את המיקום של מניפולטור, כך קצה המחט נמצא במרכז התצוגה כאשר מסתכלים דרך MICRoscope.
.7 פתרון Frontloading dsRNA לתוך המחט
- הכן את פתרון הזרקת dsRNA רק לפני הזרקה על ידי התאמת הריכוז עם DDH 2 O וערבוב פתרון dsRNA עם כמויות שווה של חיץ 2x הזרקה (שלב 2.3). שמור את הפתרון המעורב על קרח. ראה דיון בעניין ריכוז dsRNA.
- חותך את הקצה של קצה פיפטה חד פעמי 20 μl. פיפטה 10 μl של הפתרון לקצה פיפטה הגזוז. מוציא בזהירות את קצה פיפטה מפיפטה, תוך שמירה על הנוזלים בקצה על ידי אספקת backpressure. לחלופין, להסיר בזהירות את הקצה ולאחר מכן להעביר את הפתרון לסוף של הקצה על ידי אספקת לחץ באמצעות אצבע.
- הנח את קצה פיפטה עם פתרון dsRNA על הבמה מיקרוסקופ באמצעות נקודת סימון דביקה עם הפתיחה מול קצה המחט.
- במבט מבעד למיקרוסקופ, לנוע באיטיות את הקצה נטען כלפי המחט עד קצהמחט היא רק בתוך קצה פיפטה הטעון ולפתרון.
- בעוד אני מסתכל מבעד למיקרוסקופ, בעדינות למשוך בחזרה על הבוכנה של מזרק ההזרקה למשוך את פתרון dsRNA לתוך המחט לאט.
הערה: אל תעמיס את המחט. כסופו של פתרון dsRNA מתקרב לקצה המחט, להאט את קצב משיכת ולעצור את טעינת הפתרון לפני קצה המחט יגיע אוויר. אם האוויר מגיע לקצה, הפתרון יהיה נמשך במהירות לבעל המחט, וכתוצאה מכך בעיות זיהום חמורות. הליכי ניקוי מפורטים של בעל המחט מתוארים בפיליפ וTomoyasu 2011 11. - הסר את הלחץ ממזרק ההזרקה ומחזיק את המחט על ידי פתיחת השסתום. לאחר מכן, להזיז את קצה פיפטה מן קצה המחט. הרם את המחט מהבמה על מנת למנוע פגיעה בטעות את המחט תוך שימת הזחלים על הבמה. הסר את קצה פיפטה התרוקן מהבמה. .8 הזרקת dsRNA
- הנח את הזחלים לתוך סל etherization. השתמש בפחות מ -10 זחלים אם לומד את הטכניקה. השתמש 30-40 זחלים בסיבוב נוח פעם אחת עם הטכניקה אחת.
- מניחים את הסל עם זחלים בבקבוק האתר ולסגור את המכסה.
הערה: Ether מציג סכנת שריפה, והוא גם מזיק. לבצע שלב זה מתחת למכסת מנוע קטר. - זחלי Etherize דקות בערך 3. בדקו את הזחלים לתנועה לאחר 3 דקות. למקם אותם בחזרה בבקבוק האתר ל30 שניות אחרת אם הם עדיין נעים. אל etherize ליותר מ -5 דקות מכיוון שהדבר עלול להגדיל את הקטלניות.
הערה: בפעם etherization האופטימלית עשויה להשתנות בהתאם לטמפרטורה ולחות. - העבר את הזחלים המסוממים מהסל לקצה שאינו מקל של שקופית זכוכית דביקה. בעזרת מלקחיים ותוך מבט מבעד למיקרוסקופ, להרים כל אחד זחלים על ידי אחד ומניח אותם על גבי השקופית. להניח אותם רוחבית ולטפוח בעדינות את גופם fראש rom לזנב עם המלקחיים, מעט מתיחתם כמו שאתה הולך, כדי לוודא שהם מובטחים לשקופית.
- מניחים את השקף הדביק עם זחלים על הבמה מיקרוסקופ.
- הכנס את המחט טעונה dsRNA בעדינות לתוך צד הגב של הזחלים כדי למנוע נזק למערכת העצבים המרכזית. כמו כן להימנע קו האמצע הגב, כמו לב הזחל נמצא כאן. בצעדים זו ולאחר מכן, תמיד להשתמש בבמה כדי להעביר את הזחלים למחט (במקום להשתמש במניפולטור המחט כדי להזיז את המחט).
הערה: באתר ההזרקה הספציפי לא משנה כRNAi בט castaneum נראה מערכתי. עם זאת, זה בדרך כלל הקל ביותר כדי להזריק לתוך צד הגב של מגזרי חזה או בבטן. - לאחר החדרת המחט לתוך הזחלים, למשוך את המחט מעט אחורה כדי לאפשר מקום לdsRNA להיכנס לחלל גוף הזחל.
- דחוף בעדינות על המזרק להזרקה עד ירוק תור זחלים (או הצבע של חיץ ההזרקה) ולחפש יםtretched ומלא.
הערה: אם לומד את הטכניקה, מנסה להזריק ככל האפשר כדי לקבוע את הסכום של פתרון שיהיה ניתן להזריק לתוך זחל ללא קטלני משמעותי. זה בדרך כלל על 0.5-0.7 μl. - הסר את המחט מהזחלים. תוך הסרת המחט, מעט למשוך את בוכנת ההזרקה כדי למנוע אובדן dsRNA (גם להיזהר שלא למשוך באוויר).
- הזרק את כל הזחלים בשקופית. הקפד להסיר את זחלים שלא הוזרקו בהצלחה. הזרקה מלאה לפני הזחלים מתעוררת (בכ -10 דקות).
- הסר את השקופית עם זחלים מוזרקים ממיקרוסקופ ההזרקה ולהשאיר את השקופית למשך 5 דקות נוספות עד שכל הזחלים להתאושש מetherization.
- עם מלקחיים ותחת מיקרוסקופ לנתח, בעדינות להרים את הזחלים מהראש ועד זנב לשחרר אותם מהשקופית הדביקה. הנח את הזחלים שזה עתה שוחרר בצלחת פטרי נקייה. השאר את הזחלים על צלחת פטרי ל10-15 דקות, כדי לאפשר ההזרקה wound לקריש.
- הנח את הזחלים לתוך בקבוק חדש עם קמח נקי ותווית כראוי כוללים את שם הזן, הסוג של dsRNA מוזרק, ריכוז של dsRNA, מספר הזחלים המוזרקים, ואת התאריך.
- תרבות הזחלים מוזרקים ב30 מעלות צלזיוס עם לחות 70%. שים לב לזחלים לפנוטיפים RNAi באופן קבוע.
הערה: pupate זחלי instar האחרון בתוך 7 ימים. לאחר מכן, הגלמים יהיו eclose למבוגרים לאחר 7 ימים (אם אין חריגות בעיתוי שנגרמו על ידי RNAi). - לשקול את יעילות הערכה של RNAi להפיל על ידי מספר טכניקות ביולוגיה המולקולרית שונות, כגון סופג כמותי שעתוק-PCR ההפוך (qRT-PCR) ומערבי. ראה פרוטוקול מילר et al. 2012 7 ופיליפ וTomoyasu 2011 11 לqPCR מפורט ומערב כתם, בהתאמה.
- לנתח פנוטיפים הקשורים RNAi.
הערה: RNAi קשורניתן לצפות פנוטיפים בכמה שלבים שונים ובתנאי תרבות שונים, בהתאם לגנים שהיו ממוקדים. RNAi יכול להשפיע על מורפולוגיה חיפושית, מטמורפוזה, פיזיולוגיה, וההתנהגות. באיזו תדירות את נוכחותו של פנוטיפ מסומנת ובאילו תנאי החיפושיות גדלות צריכים להיות מותאמים לשאלות הספציפיות מתוחקרת באמצעות RNAi.
.9 אישור ניתוח מציאה ופנוטיפי
Representative Results
אחד הצעדים המרכזיים לזריקה מוצלחת הוא להפוך את מחט טובה. כפי שתואר בשלב 6, קצה המחט צריך להיות שבור לפני הזרקת ט castaneum. דוגמאות למחטים טובות ורעות מוצגות באיור 1. יש מחט טובה קצה חד ונוקשה, עם פתיחת קוטר כ 0.05 מ"מ (איור 1).
איור 2 מציג את זריקה מוצלחת (2A דמויות ו2B), כמו גם כמה מקרים של זריקות לא מוצלחות (איורים 2C-2F). עם מחט זריקה בגודל כראוי, קצה המחט חודר את ציפורן הזחל עם התנגדות מינימאלית (איור 2 א), ופתרון dsRNA (הירוק) זורם לתוך הזחלים ללא כל דליפה (איור 2). אל, כפי שהוא יגרום יתר להזריק הצפה של פתרון dsRNA אפילו עם מחט זריקה בגודל כראוי (איור2C). אם קצה המחט דק מדי, קצה המחט לעתים קרובות לא מצליח לחדור לציפורן ועיקולי הזחל, מה שהופך את הזריקה הקשה (איור 2 ד). אם זה יקרה, זמירה קצה המחט לפעמים עוזר. מחטים גדולות יותר הן לעתים קרובות עדיין אפשריים לשימוש, אם כי בכמה קשיים בחדירה לציפורן הזחל (איור 2E). עם זאת, כמות גדולה של פתרון dsRNA נדחפה בקלות החוצה מהמחט אפילו עם לחץ קל על מזרק ההזרקה, לעתים קרובות וכתוצאה מכך גלישה של פתרון dsRNA (איור 2F).
בעת ביצוע RNAi, זה חשוב שתהיה שליטה חיובית להעריך שRNAi פועל כראוי, וביקורת שלילית כדי לוודא שההשפעה שנצפתה היא לא השפעה הלא ספציפית של dsRNA או תוצאה של נהלי הזרקה (כגון פגיעה על ידי הזרקה, או חריגות מetherization). הזרקה של EYFP מיקוד dsRNA יכולה לשמש כטוב ביקורת חיובית בעת השימוש ב5,7 זן pu-11. כאשר EYFP dsRNA מוזרק בשלב הזחל האחרון, לירידה משמעותית באות EYFP בprimordia אגף העתיד ניתן לצפות כבר בהודעת יום זריקה אחת (איור 3 א). מציאה של EYFP הושלמה יומיים לאחר ההזרקה של EYFP dsRNA (איור 3 ב) ומציאה זו נמשכת דרך (3C הדמויות ו3D) שלב גלמים וכל אורך חיי החיפושית אם ריכוז dsRNA הוא גבוה מספיק (כגון 1 מיקרוגרם / μl) 7. גם EYFP dsRNA יכול לשמש כביקורת שלילית כפי שהוא רצף גן שאינו ממקור פנימי ולא צריך לגרום לשיבושים מורפולוגיים או פיסיולוגיים (ציורים A3-3D).
אנחנו סיפקנו תמונות של RNAi זחל לשריד (טוב מאוד), גן אגף קריטי 12, כדוגמא נוספת לאופן EFfective טכניקת RNAi מבוסס הזרקה זה בט castaneum. כאשר dsRNA לVG מוזרק לתוך זחלי שלב הלפני אחרון (שלב אחד לפני שלב הזחל האחרון), אובדן של מבני האגף שלם ניתן לצפות בשלב גלמים (3E דמויות ו3F). מבוגרים וכתוצאה מכך גם חסרים לחלוטין מבני אגף (איורים 3G ו 3H). תוצאת RNAi לVG מדגימה הן את החוסן ואת האופי המערכתי של RNAi בט castaneum.
איור 1: דוגמאות (א) למחטים רצופים, טובות, ורעות (ב) קצה מחט טובה שבורה היטב (C) קצה מחט שבורה, כי הוא גדול ובוטה מדי (D) הקצה... של כל הקופה מחט n דקה מדי. ברים סולם (אדום) הם 0.05 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:... () מחט זריקה בגודל כראוי מוכנסת לתוך זחל instar האחרון (B) זחל הזריק כראוי עם פתרון dsRNA הירוק (C) הצפה של פתרון dsRNA בנקודת ההזרקה נגרמת על ידי יתר ההזרקה (D ) מחט דקה שלא הצליחה לחדור לציפורן הזחל. (מחט זריקה גדולה מוכנסת לתוך זחל instar האחרון E). (F) זחל דקירה ממחט גדולה, וכתוצאה מכך הגלישה והדליפה של פתרון dsRNA. חצים מצביעים על המחטים."Target =" ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: דוגמאות של RNAi המוצלח בט castaneum. הזרקת זחל האחרונה של תוצאות EYFP dsRNA בהפחתה של ביטוי EYFP (AD). גלמים () זחלי יום אחד לאחר הזרקה. (B) זחלי יומיים לאחר הזרקה. גלמים (C) בקרה. (ד ') כתוצאה מ הזרקת הזחל EYFP dsRNA. הבקרות השליליות הן הזרקת חיץ (A, B) והזרקת dsRed dsRNA (C, D). ראשי החץ וחצים מצביעים על ביטוי EYFP או היעדרה בprimordia הכנף ועיניים, בהתאמה. (EH) פןהאולטימטיבי זחל RNAi לVG. (E) גולם Wild-type. (F) VG גולם RNAi. חוסר מבני אגף הוא כבר נראה לעין בשלב גלמים (חץ). G) מבוגר Wild-type. (H) VG מבוגר RNAi. מבני אגף הקשורים חסרים לחלוטין (חץ). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
ישנן מספר הסוגיות החשובות שצריכים להילקח בחשבון על מנת להבטיח את ההצלחה של RNAi, כולל האורך והריכוז של מולקולות dsRNA, תחרות בין מולקולות dsRNA שונות (בעת ניסיון מרובה להפיל), וכן את האפשרות של Off-יעד אפקטים (OTE).
אורך dsRNA
האורך של מולקולות dsRNA משפיע על היעילות של תגובת RNAi המערכתית, עם dsRNA יותר להיות יעיל יותר כדי לעורר RNAi 7,14,15 (אם כי הגבול הארוך של dsRNA אינו ידוע כרגע). אורך dsRNA צריך להיות ארוך יותר מ50 נ"ב לגרום RNAi היעיל בט castaneum 7. dsRNA בין 150 נ"ב ו500 נ"ב נראה אידיאלי עבור ניסויי RNAi. גם למרות שניתן להשתמש במולקולות dsRNA יותר, תהיה להם סיכוי מוגבר של OTE וצעד שיבוט הגנים יהפוך קשה יותר ויותר.
ריכוז dsRNA
ve_content "> דרגות שונות של מציאה גן ניתן להשיג בהתאם לריכוז של dsRNA. 1 מיקרוגרם / μl מופיע להיות ריכוז התחלה סביר, אשר לעתים קרובות מייצר פנוטיפ כמעט ריק (עשוי להשתנות תלוי בגן (ים) של עניין ). ניתן לבצע RNAi עם ריכוז גבוה יותר (לדוגמא, 7-8 מיקרוגרם / μl) כדי לקבל פנוטיפ חזק RNAi. RNAi עם דילול סדרתי של dsRNA לפעמים יכול להיות מועיל כדי לייצר סדרה של פנוטיפים hypomorphic (משלימה נתונים של Tomoyasu et al. 2009 8, ונתונים שלא פורסמו Borràs-Castells).RNAi תחרות
מציאה גן מרובה יכולה להיות מושלמת בט castaneum על ידי הזרקה כמה מולקולות dsRNA שונות בו זמנית. עם זאת, הוא ידוע גם שיש כמה מולקולות dsRNA שונות קיימים בתוך האורגניזם לעתים קרובות תוצאות תחרות בין dsRNAs לגישה לרכיבי RNAi
מיקוד-Off
OTE הוא חשש מובנה לגישות מבוססות RNAi. אחת דרכים למזער OTE היא לזהות אזורים בגן המטרה שחולקים רצפים דומים עם גנים אחרים ולהימנע מאזורים אלה בעת תכנון dsRNA. ניתוח תפציץ פשוט נגד T. סט הגן חזה castaneum יכול לזהות אזורים כאלה. כמה כלים מקוונים מאפשרים גם הערכה של OTE הפוטנציאלי (למשל, E-RNAi 19). ביצוע RNAi לשני אזורים שאינם חופפים של גן המטרה הוא דרך קלה ויעילה כדי לשלול את האפשרות שנצפתה פנוטיפים נגרמים על ידי OTE. האפשרות של OTE ממוזערת אם RNAi לשני אזורים שאינם חופפים לייצר את אותו פנוטיפים (אלא אם כן שני אזורים שאינם חופפים לשתף רצף דומה).
הערכת גן מציאה באמצעים אחרים מאשר פנוטיפי מנתח היא לעתים קרובות קריטית לנתונים הקשורים RNAi ביעילות נוכחי. שתי דרכים עיקריות להעריך מציאה גן הן qRT-PCR וניתוח כתם מערבי. qRT-PCR הוא דרך נוחה כדי למדוד את הרמה של mRNA היעד, ונעשה שימוש במחקרים הקשורים לRNAi רבים, כולל אלה בט castaneum (ראה אל מילר ואח. 2012 7 לדוגמא). Howevאה, יש לנקוט בזהירות, כפי שיש לנו לאחרונה ראו כמה מקרים שבי רמת mRNA היעד היא על ידי RNAi מוסדר עד (אם כי מוצר החלבון הוא למטה מוסדר) (נתונים שלא פורסמו Borràs-Castells). לא ידוע כרגע אם mRNA RNAi מושרה זה עד תקנה יכול להיות נפוץ או ייחודי לגנים מסוימים. ניתוח כתם מערבי הוא דרך נוספת כדי לאשר מציאה גן. שיטה זו היא די אמינה כפי שהוא מודד את כמות מוצר החלבון הסופי. הדרישה של נוגדן ספציפי נגד חלבון המוצר של גן המטרה היא חיסרון בגישה זו. ניצול מדידות עצמאיות רבות, בנוסף לניתוח פנוטיפי יגדיל את הביטחון של נתונים פנוטיפי המתקבלים על ידי ניתוח מבוסס RNAi.
מאז ראשיתה בט castaneum, RNAi יש בעיקר נעשה שימוש כדי לחקור את תפקוד גן בפיתוח ויצירת תבנית. ט אלו מחקרים התפתחותיים castaneum היו מוצלחים ביותר בcharacterizing פונקציות אבולוציונית שימור והתפצלו של גנים (שנסקר בDenell 2008 1 וKlingler 2004 2). מחקרים עם זאת, מבוסס RNAi בט castaneum אינם מוגבל לביולוגיה התפתחותית. לדוגמא, יכול להיות מנוצל RNAi ללמוד תפקוד גן במגוון רחב של תגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות, כוללים סובלנות מתח, טריפה, תוקפנות, בחירת בן זוג, דפוסי פעילות, ומנגנוני הגנה.
קושי אחד של יישום RNAi להקשרים אלה הוא את הסבירות לתופעות pleiotropic. לעתים קרובות, הגנים של עניין יהיו מגוון של תפקידים ברחבי ט מחזור החיים castaneum, ובכך להפוך את ההסרה של גנים ללא תופעות פנוטיפי לא מכוונות קשות. עם זאת, את היכולת לבצע בקלות RNAi במגוון רחב של שלבים לעתים קרובות יכולה להיות אסטרטגיה יעילה למניעת תופעות pleiotropic אלה. לדוגמא, ביצוע RNAi במבוגרים במקום זחלים או גלמים עשוי לאפשר לנו לעקוף uninנטה קטלני הנגרם על ידי מציאה גן במהלך ההתפתחות מוקדמת. הגמישות של תגובת RNAi בט castaneum כך הופך את המודל הזה לבחירה אטרקטיבית עבור התאמת RNAi לניסויים של תפקוד גן בתגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות.
ט מערכת castaneum היא גם אידיאלית לשימוש במעבדה הוראה. ט castaneum יכולה להיות בקלות בתרבית על קמח / תערובת שמרים בטמפרטורת חדר (C ° 25) ללא subculturing תכוף, וטכניקות RNAi בט castaneum פשוטים מספיק כדי להיות מותאמים למעבדה עם מדענים צעירים, לומדים. כRNAi הופך טכניקה חיונית במגוון רחב של תחומים ביולוגיים, זה קריטי, כי תלמידים נחשפים לטכניקה זו. הטבע ישר קדימה של טכניקת RNAi הזחל בט castaneum גם מעודד את תלמידים יותר להיות מעורבים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מועמד לכיתת אוריינטציה מערכת גנטית. </ P>
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למרכז לביואינפורמטיקה וגנומיקה פונקציונלית (CBFG) באוניברסיטת מיאמי לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מיאמי מענק הזנק (יט), וקרן הלאומית למדע (יט: IOS 0,950,964).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
| Brewer’s yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
| 6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
| Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults. |
| Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
| Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
| 1.5 Quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
| Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30 °C with 70% humidity. |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
| Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
| Plastic CD case | Amazon | ||
| Boroslilicate glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
| Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
| Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
| Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
| Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
| Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
| Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120 µm pore size/49% open area |
| Media bottle, 100 ml | VWR | 89000-926 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
| Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
| X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
| X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
| Manipulator | Narishige | M-152 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
| 30 ml Disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
| Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip |
| Art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |
References
- Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. Genetics. 180, 1779-1786 (2008).
- Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
- Tomoyasu, Y., et al. Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium. Genome biology. 9, R10 (2008).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi. PLoS ONE. 7, e47431 (2012).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles. Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).
- Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Larval RNAi in Drosophila. Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).
- Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).
- Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle. Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).
- Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC genomics. 14, 5 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental biology. 333, 215-227 (2009).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).
Tags
ביולוגיה מולקולרית גיליון 92 התערבות RNA RNAi מציאה גן חיפושית קמח אדומה,Erratum
Formal Correction: Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015.
Citeable Link.
An erratum was issued for Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.
Step 4.1 was updated from:
Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.
to
Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 770, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.
