ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
RNA interferens (RNAi) -baserte genet knockdown teknikker er i kjernen av Tribolium forskning. Her gir vi en oversikt over vår larve RNAi teknikk i Tribolium castaneum. Larve RNAi er en enkel, men kraftig teknikk som gir rask tilgang til tap-av-funksjon fenotyper, slik at forskere å studere genfunksjoner i ulike sammenhenger.
Abstract
Den røde mel bille, Tribolium castaneum, og tilbyr et repertoar av eksperimentelle verktøy for genetiske og utviklingsstudier, inkludert et fullt annotert genomsekvens, transposon baserte transgenesis, og effektiv RNA interferens (RNAi). Blant disse fordelene, RNAi-baserte genet knockdown teknikker er i kjernen av Tribolium forskning. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, noe som gjør det mulig å utføre RNAi på ethvert stadium i livet ved ganske enkelt å injisere dobbelt-strenget RNA (dsRNA) i billens kroppens hulrom.
I denne rapporten gir vi en oversikt over vår larve RNAi teknikk i T. castaneum. Protokollen omfatter (i) isolering av det riktige trinn i T. castaneum larvene for injeksjon, (ii) forberedelse for injeksjon innstilling, og (iii) dsRNA injeksjon. Larve RNAi er en enkel, men kraftig teknikk som gir oss rask tilgang til tap-av-funksjon phenotypes, inkludert flere genet knockdown fenotyper samt en rekke hypomorphic fenotyper. Siden nesten alle T. castaneum vev er utsatt for ekstracellulær dsRNA, tillater larve RNAi teknikken forskere for å studere et bredt utvalg av vev i forskjellige sammenhenger, inkludert den genetiske basis for organisme responser til det ytre miljø. I tillegg, enkelhet av denne teknikken stimulerer flere elev engasjement i forskning, noe som gjør T. castaneum en ideell genetisk system for bruk i et klasserom setting.
Introduction
Den røde mel bille, Tribolium castaneum, blir stadig mer populært i ulike felt av biologi skyldes delvis den enkle å utføre RNA interferens (RNAi) 1-3. RNAi-baserte genet knockdown teknikker tillate forskere å utføre tap-av-funksjonen analyserer uten å benytte komplekse genetiske metoder. T. castaneum viser en robust systemisk RNAi respons, noe som gjør det mulig å utføre RNAi på ethvert trinn ved enkel injeksjon av dobbelt-trådet RNA (dsRNA) i billens kroppshulrommet 4-6. Samtidig knockdown av flere gener er også mulig i T. castaneum ved å injisere to eller flere forskjellige dsrna molekyler på samme tid 7,8. I tillegg kan en rekke hypomorphic fenotyper bli generert ved å redusere konsentrasjonen av injisert dsRNA 8. Disse funksjonene gjør RNAi-baserte omvendt genetiske teknikker attraktive alternativer til tradisjonelle termin genetikk i T. castaneum. Siden nestenalle T. castaneum vev er utsatt for ekstracellulære dsrna molekyler 9, denne teknikken gjør det mulig for forskere å undersøke et bredt utvalg av vev i forskjellige sammenhenger. I tillegg, selv om denne rapporten fokuserer på å utføre RNAi i T. castaneum, mange prosedyrer som er beskrevet her gjelder for andre insekter. Derfor er denne protokollen nyttig for de som ønsker å utføre tap-av-funksjon analyser i sine sammenhenger av interesse i T. castaneum, så vel som for forskere som ønsker å anbringe et RNAi-basert teknikk til andre insekter.
Injisering dsRNA til larver tillater funksjonell analyse på en rekke bille livsstadier, inkludert larve, pupal, og adulte stadier 4,5,10. Vi har tidligere rapportert vår generelle larve RNAi protokollen inkludert molekylærbiologi prosedyrer 11. I dagens rapport, har vi fokus på å beskrive dsrna injeksjonsprosedyrer, som er best forklares med visuelle medhjelpere. Vi tilbyrdetaljerte steg-for-trinn-injeksjon prosedyrer samt gode og dårlige injeksjon eksempler. Denne visuelle protokollen utfyller vår forrige protokoll, og kombinert, gir de en mer helhetlig syn på larve RNAi prosedyrer i T. castaneum. Videre diskuterer vi parametere for dsrna molekyler som kan påvirke suksess for RNAi, anvendelse av RNAi-baserte analyser for fysiologiske undersøkelser, så vel som anvendelsen av larve RNAi protokollen i et laboratorium undervisningen.
Protocol
1. T. castaneum Aksjer og dyrking
- Bestem deg for en T. castaneum belastning å bruke for eksperimentet.
MERK: Flere lab-etablert T. castaneum stammer er tilgjengelige. Ga-1 (Georgia-1) er foreldre stamme av Ga-2 som ble anvendt for sekvensering 3 genomet. Siden Ga-1 aksjer de fleste DNA polymorfismer (som single nucleotide polymorphisms, SNPs) med Ga-2, og er sunnere enn Ga-2 på grunn av mindre innavl, er det ideelt for RNAi eksperimenter. Pu-11 er en annen praktisk belastning å bruke , som sin unike forbedret gul fluoriserende protein (EYFP) uttrykk i fremtiden fløyen primordia tillater oss å skille den siste larve instar fra andre instars (se Figur S4 av Clark-Hachtel et al. 2013 12). Det er viktig å dokumentere hvilke bille stamme ble benyttet i forsøket, som genetiske bakgrunn synes å betydelig affect RNAi fenotyper 13. - Forbered T. castaneum mel kultur ved tilsetning av 5% (beregnet på vekt) av pre-siktet ølgjær organisk hel-hvetemel (etter blanding, oppbevare kulturen mel ved -20 ° C). Alikvot av kulturen mel (ved romtemperatur) i 6 ml plastflasker (Drosophila arkiv omtrent 40 g / flaske).
- Kultur T. castaneum ved 30 ° C med 70% fuktighet. Bruk en fuktighetskontrollert inkubator hvis mulig. Legg 30-40 voksne per kultur flaske (mann: kvinne ratio 1: 1) for å starte kultur.
MERK: Selv om formen er sjelden et problem ved 30 ° C, lavere temperaturer (for eksempel 25 ° C) med 70% fuktighet kan føre til muggvekst i kulturen mel. Senk fuktigheten hvis dette skjer. - Overfør de voksne til en ny kultur flaske annenhver uke for subculturing (se trinn 5.2 til 5.5 for hvordan du isolerer voksne fra kultur mel).
MERK: Det tar omtrent tre uker å få tak i den siste stadium larver. Alternatsvis, T. castaneum kulturer kan holdes på en lavere temperatur (20-25 ° C), men med et større dyrkning periode (utviklings tid ved 25 ° C er omtrent dobbelt så høy som ved 30 ° C).
2. Utarbeidelse av løsninger og Instrumenter for Larve dsRNA Injection
- Syntetisere dsrna molekyler homologe til målgenet ved in vitro transkripsjon. Oppbevar ved -80 ° C. Se Philip og Tomoyasu 2011 11 for detaljerte molekylærbiologiske prosedyrer. Se også diskusjon for en rekke parametere som må vurderes ved utforming dsrna molekyler.
- Lag 10 ml 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 7,6 ved 25 ° C) ved å blande 8,5 ml av 1 M Na HPO 2 4 med 1,5 ml 1 M NaH 2 PO 4. Sjekk pH med et pH-meter og justere deretter.
- Lag 1 ml av 10x injeksjonsbuffer ved blanding av 10 pl 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 7,6 ved 25 ° C), 100 _6; l på 0,5 M KCl, 100 mL av grønn mat fargestoff, og 790 mL av dobbel-destillert vann (DDH 2 O). Fortynne 10x injeksjon buffer for å lage 2x injeksjon buffer (200 mikroliter 10x injeksjon buffer + 800 mL DDH 2 O). Oppbevar både 10x og 2x injeksjon buffere ved 4 ° C inntil nødvendig.
- Forbered Sticky Glass Slides.
- Dekke en hel glass lysbilde med en form for avtagbart lim for larve injeksjoner. For voksne eller pupal injeksjoner, lage to tynne strimler av lim langs lengre kantene av raset.
- La limet tørke i flere dager, noe som sikrer at limet forblir klebrig nok til å overholde biller til raset, mens også rester Myk nok til å lette deres fjerning etter injeksjon.
MERK: Hvis limet holder for klissete, kan du bruke en finger og trykk på lim, noe som vil redusere klebrighet. Hver side kan holde opp til 40 eller 50 biller, og kan gjenbrukes til den ikke klarer å sikkert holde dyrene. Alternatively kan dobbeltsidig tape også benyttes, selv om båndet er noen ganger ikke klebende nok til å holde larvene.
- Gjør en Etherization Basket.
- Fjern stempelet fra en 10 ml engangssprøyte og kuttet sprøyten i halvparten rundt 6 ml linje.
- Kast den nederste halvdelen av sprøyten. Kort varme snittflaten av den øverste del av sprøyten med en gassbrenner, og raskt å presse den smeltede plast bort på et stykke nylonmesh for å lime mesh på sprøyten. Klippe bort overflødig mesh Når plasten stivner.
- Forbered eteren flaske. Tilsett 30 ml ether til en smal munn-100 eller 250 ml glassflaske. Legg flere stykker av silkepapir for å øke fordampningen av eter.
MERK: Ether presenterer en brannfarlig og er også skadelig. Håndter alltid eter under en avtrekkshette. Lukk lokket tett mens den ikke er i bruk.
MERK: is kan brukes som et sikrere alternativ (for eksempel i en klasse), selv om sedation er mindre effektive.
3. Utarbeidelse av Larve Injection Apparatus
- Legg inn en XY mekanisk plattform på en disseksjonsmikroskop.
MERK: XY mekanisk stadiene er tilgjengelig fra store mikroskop selskaper. Alternativt kan billig mikroskop stadier også brukes for de fleste dissecting mikroskop med noen modifikasjoner (se Materialer tabell for eksempel). - Plasser en mekanisk nål manipulator nær XY mekanisk scenen.
- Monter en injeksjonssprøyte. Bruk en fire-veis stoppekran (med Luer-forbindelser) for å koble en 30 ml engangssprøyte til en glass nålholderen, slik at manipulering av injeksjonssprøyten uten å påvirke trykket i injeksjonsnålen (se Philip og Tomoyasu 2011 11 for den detaljerte injeksjonssprøyte montasje).
4. Pulling kanyler
- Trekk borsilikatglass nåler (B100-50-15, OD: 1 mm, ID: 0,5 mm, 15 cm lengde) av ennål avtrekker.
MERK: For Sutter P-87 eller P-97, bruker du innstillingen "Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Tid = 90" eller følge kapittel 2 i Pipette Cookbook: Heft Cell, C. elegans, Drosophila, og Sebrafisk - Anbefalt programmer. Optimale innstillinger varierer avhengig av hvilken modell av nålen avtrekker. Innstillingen for en generisk Drosophila kanyle er et godt utgangspunkt. - Butikken trakk nåler i en plasteske (f.eks en plast CD-etui) og fest med avtagbar montering kitt.
5. Isolasjon og utvelgelse av Larver
- Plasser en # 25 sil på en sil mottaker.
- Plasser innholdet i flasken kultur (biller og kultur mel) på sikten, og sile innholdet umiddelbart. Ikke la innholdet på sil uten sikting, som larver vil raskt prøve å grave gjennom silen og blir sittende fast. Aggressivt sile innholdet å la melet fallgjennom og la eldre larver (vanligvis 6. og 7. instar larver), puppe og voksne (sammen med sine støpte-off neglebåndene, exuviae) bak på toppen av sil.
- Overfør de resterende på sil (biller og exuviae) til frøet pan materialer. Fortsett å banke på pannen for å hindre at biller rømmer.
- Fjern exuviae og de mel-partikler som er igjen på overflaten av billene ved forsiktig blåser over frøet pan.
- Trykk frøet pan å flytte innholdet til bunnen av kjelen. Deretter la pannen uutnyttet i flere sekunder. Vent til de voksne, som er mer mobile enn andre stadier, for å komme ut fra bunken. Fjern voksne ved hjelp av en art pensel (f.eks 1 cm bredde).
- Separat puppe ved forsiktig å banke på frøet pannen samtidig holde munningen av kjelen litt nedover, så puppe en tendens til å rulle raskere mot munningen. Bruk en pensel til å fjerne puppe, slik at bare larver på frøet pan.
- Pless isolert larver i en ren petriskål. Velg et passende stadium av larver for injeksjon og plassere dem i en egen petriskål.
MERK: Tidlig i forrige stadium larver (1-2 dagen etter den siste larve molt) er ofte egnet når analysere RNAi effekt på voksne morfologi samt på metamorfose. Det er imidlertid noen ganger nødvendig å utføre RNAi på den nest siste (eller enda tidligere) trinn for å evaluere tidlig gen-funksjon (for eksempel, figur 3E-3H. Også se Clark-Hachtel et al. 2013 12). Bruk puppe som en referanse for å identifisere størrelsen av instar larver. Den siste instar larver er litt lengre enn puppe. Alternativt kan pu-11 brukes til å identifisere den siste instar larver, så vel som for å bestemme tidsforløpet for utvikling av siste stadium larver (figur S4 av Clark-Hachtel et al. 2013 12). - Behold den merkede larver i en petriskål til etherization. Plasser restenlarver og andre stadier av biller (som puppe og voksne) tilbake i en kultur flaske med mel og returnere det til inkubatoren.
6. Utarbeidelse av kanyler
- Plasser en tidligere trukket glass nålen på et objektglass ved hjelp av enten klebrig tack eller dobbeltsidig tape. Bruk pinsett, teste trakk enden av nålen mens du ser gjennom dissekere mikroskop for å se hvor de tips svinger. Grab området litt mot tuppen siden av der nålen svinger med pinsett og vri for å bryte.
- Beholde gode nåler og forkaste andre. Betrakt en god nål som har en åpning som er verken for stor eller for liten (ca. 0,05 mm diameter. Figurene 1A og 1B), og er vinklet for å gjøre gjennomtrengning av larve hårstråene lettere (figurene 1B og 2A-2B). Betrakt en dårlig nål som (i) er for liten, noe som gjør opptak av dsRNA-løsning inn i nålen diffikult (trinn 7) (figurene 1D og 2D), (ii) er for stor, noe som fører larveskade og mulig dødelighet ved injeksjon (figurene 1C og 2F), (iii) butt, slik at gjennomtrengning av hårstråene vanskelig og øker skade.
- Sett Needle nålholderen inn.
- Først skru tuppen av nålen holderen og legg tilbake enden av nålen inn i holderen spissen. Deretter plasserer gummipakningen under holderen spissen (minst 1 cm fra bakenden av glasset p).
- Sett på baksiden av nålen inn i holderen, med gummipakningen satt helt inn i åpningen av nålholderen. Skru spissen tilbake på holderen.
- Plasser den sammensatte nålholderen på nålen manipulator. Hold nålen holder horisontalt. Justere posisjonen til manipulatoren, slik at spissen av nålen er plassert i sentrum av den oppfatning når man ser igjennom MICRoscope.
7. frontloading dsRNA løsning i Needle
- Klargjør dsRNA injeksjonsløsningen like før injeksjon ved å justere konsentrasjonen med DDH 2 O, og å blande den dsRNA-løsning med like volumer av 2x injeksjon buffer (trinn 2.3). Hold den blandede oppløsningen på is. Se diskusjon om dsRNA konsentrasjon.
- Skjær tuppen av en 20 mL engangspipette tips. Pipetter 10 mL av løsningen i den trimmede pipettespissen. Fjern forsiktig pipettespissen fra pipetten samtidig holde fluidet på spissen ved å tilveiebringe mottrykk. Alternativt, fjern forsiktig spissen og deretter flytte løsningen til enden av spissen ved å tilveiebringe trykk ved bruk av en finger.
- Plasser pipettespissen med dsRNA løsning på objektbord ved hjelp av klebrig klebe med åpningen som vender mot spissen av nålen.
- Ser gjennom mikroskop, beveg lastet mot spissen av nålen inntil spissen avnålen befinner seg i den innlastede pipettespissen og inn i løsningen.
- Mens du ser gjennom mikroskop, trekk forsiktig tilbake på stempelet av injeksjonssprøyten å sakte trekke dsRNA løsningen inn nålen.
MERK: Du må ikke over nålen. Etter hvert som enden av dsRNA-løsning nærmer seg spissen av nålen, redusere frekvensen av holdningen og stoppe last løsningen før spissen av nålen vil nå luft. Hvis luften når spissen, vil løsningen bli hurtig trukket inn i nålholderen, noe som resulterer i alvorlige forurensningsproblemer. Detaljerte rengjøringsprosedyrer nålholderen er beskrevet i Philip og Tomoyasu 2011 11. - Fjern trykket fra injeksjonssprøyten og nåleholderen ved å åpne stengeventilen. Deretter flytter pipettespissen bort fra spissen av nålen. Hev nålen opp fra scenen for å hindre utilsiktet skade nålen mens plassere larvene på scenen. Fjern tømt pipettespissen fra scenen. 8. dsRNA Injection
- Plasser larvene inn i etherization kurv. Bruk mindre enn 10 larver hvis lære teknikken. Bruk 30-40 larver i en runde gang komfortabel med teknikken.
- Plasser kurven med larver i eter flasken og lukker lokket.
MERK: Ether presenterer en brannfarlig og er også skadelig. Utfør dette trinnet under en avtrekkshette. - Etherize larver i ca 3 min. Sjekk larvene for bevegelse etter 3 min. Plasser dem tilbake i eter flaske for en annen 30 sek hvis de fremdeles i bevegelse. Ikke etherize for mer enn 5 min, da dette kan øke dødelighet.
MERK: Den optimale etherization tid kan variere avhengig av temperatur og luftfuktighet. - Overfør etherized larver fra kurven til det ikke-klebrige kanten av en glass klebrig lysbilde. Bruk pinsett og mens du ser gjennom mikroskop, plukke opp hver larver én etter én, og plassere dem på lysbildet. Legg dem sidelengs og banke forsiktig ned kroppen sin fROM hode til hale med pinsett, litt å strekke dem som du går, for å sørge for at de er sikret på lysbildet.
- Plasser den klebrige lysbilde med larver på mikroskopet scenen.
- Sett dsRNA lastet nålen forsiktig inn i ryggsiden av larvene å unngå skade på CNS. Også unngå ryggmidtlinjen, som larve hjerte ligger her. I dette og etterfølgende trinn, alltid bruke stadium å bevege larvene til nålen (i stedet for ved hjelp av nålen manipulatoren for å bevege nålen).
MERK: Den spesifikke injeksjonsstedet spiller ingen rolle som RNAi i T. castaneum synes å være systemisk. Imidlertid er det vanligvis enklest å injisere inn i den dorsale side av toraks eller abdominale segmenter. - Etter innsetting av nålen inn larvene, trekk nålen litt tilbake for å gi plass til dsRNA å gå inn i larve kroppens hulrom.
- Trykk forsiktig på injeksjonssprøyten før larvene sving grønn (eller fargen av injeksjonsbuffer) og se stretched og full.
MERK: Hvis lære teknikken, prøve å injisere så mye som mulig for å bestemme mengden av løsning som kan injiseres i en larve uten betydelig dødelighet. Det er generelt omtrent 0,5 til 0,7 mikroliter. - Fjern nålen fra larvene. Mens kanylen fjernes, litt dra tilbake på injeksjonssprøyte for å unngå dsRNA tap (også være forsiktig med å trekke inn luft).
- Injisere alt larver på lysbildet. Sørg for å fjerne larver som ikke ble riktig injisert. Komplett injeksjon før larver våkne opp (i ca 10 min).
- Fjern lysbildet med injisert larver fra injeksjons mikroskop og forlate lysbildet for 5 mer min før alle larver gjenopprette fra etherization.
- Med pinsett og under et dissekere mikroskop, forsiktig løft larvene fra hode til hale for å frigjøre dem fra den klebrige lysbildet. Plasser den nylig utgitte larver i en ren petriskål. La larvene på petriskål i 10-15 min for å tillate injeksjon wound å koagulere.
- Plasser larvene til en ny flaske med rent hvetemel og etiketten hensiktsmessig herunder belastning navn, type dsRNA injiseres, konsentrasjonen av dsRNA, antall larver injisert, og datoen.
- Kultur den injiserte larver ved 30 ° C med 70% fuktighet. Observere larvene for RNAi fenotyper regelmessig.
MERK: Den siste stadium larver forpupper seg innen 7 dager. Deretter vil puppe Eclose inn voksne etter 7 dager (hvis det ikke er unormalt i timing forårsaket av RNAi). - Vurdere å vurdere effektiviteten av RNAi slå ned av flere forskjellige molekylærbiologi teknikker, for eksempel kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR) og western blotting. Se Miller et al. 2012 7 og Philip og Tomoyasu 2011 11 for detaljert qPCR og Western Blot protokollen, henholdsvis.
- Analyser RNAi relaterte fenotyper.
MERK: RNAi relatertfenotyper kan observeres på en rekke forskjellige stadier, og under forskjellige dyrkningsbetingelser, avhengig av de gener som er målrettet. RNAi kan påvirke bille morfologi, metamorfose, fysiologi og atferd. Hvor ofte tilstedeværelse av fenotype er kontrollert og under hvilke betingelser billene er alet opp bør tilpasses de konkrete spørsmålene som undersøkes gjennom RNAi.
9. Bekreftelse på Knockdown og fenotypisk Analyser
Representative Results
En av de viktigste trinnene for vellykket injeksjon er å gjøre en god nål. Som beskrevet i trinn 6, spissen av nålen må brytes før injisering T. castaneum. Eksempler på gode og dårlige nåler er vist i figur 1. En god nål har en skarp spiss og stiv, med en omtrent 0,05 mm diameter åpning (figur 1B).
Figur 2 viser en vellykket injeksjon (figurene 2A og 2B), så vel som flere tilfeller av mislykkede injeksjoner (figur 2C-2F). Med en riktig størrelse injeksjonsnål, nålespissen trenger inn i larve hårstråene med minimal motstand (figur 2A), og dsRNA-løsning (grønn) strømmer inn i larver uten noen lekkasje (figur 2B). Ikke over injisere, da det vil føre overløp av dsRNA løsning selv med en riktig størrelse kanyle (Figur2C). Hvis spissen av nålen er for tynt, nålespissen ofte ikke klarer å trenge gjennom larve hårstråene og svinger slik at injeksjonen vanskelig (figur 2D). Hvis dette skjer, noen ganger hjelper trimming nålespissen. P er ofte fortsatt brukbart, om enn med noen vanskeligheter i å trenge inn i larveskjellaget (figur 2E). Det er imidlertid en stor mengde av dsRNA-løsning lett skyves ut fra nålen selv med et lett trykk på injeksjonssprøyten, hvilket ofte resulterer i en overflyt av dsRNA-løsning (figur 2F).
Ved utføring av RNAi, er det viktig å ha en positiv kontroll for å bedømme at RNAi virker på riktig måte, og en negativ kontroll for å verifisere at effekten observeres er ikke en ikke-spesifikk effekt av dsRNA eller en konsekvens av injeksjonsprosedyrer (for eksempel skade forårsaket ved injeksjon, eller abnormitet fra etherization). Injeksjon av dsRNA målretting EYFP kan tjene som engod positiv kontroll ved hjelp av pu-11 strekk 5,7. Når EYFP dsRNA blir injisert i den siste larvestadiet, kan en betydelig reduksjon i EYFP signal i fremtiden vinge primordia observeres så tidlig som en dag etter injeksjon (figur 3A). Den knockdown av EYFP er fullført to dager etter injeksjon av EYFP dsRNA (figur 3B), og dette vedvarer knockdown gjennom pupal stadium (figur 3C og 3D), og gjennom hele livet av billen hvis dsRNA-konsentrasjonen er høy nok (eksempel 1 mikrogram / mikroliter) 7. EYFP dsRNA kan også bli brukt som en negativ kontroll som det er en ikke-endogene gen sekvensen og bør ikke forårsake morfologiske og fysiologiske forstyrrelser (figurene 3A-3D).
Vi følger bilder av larve RNAi for tilbakedannet (VG), en kritisk vinge gen 12, som et annet eksempel på hvordan effektive denne injeksjon basert RNAi teknikken er i T. castaneum. Når dsRNA for vg injiseres i nest siste etappe larver (en scene før den siste larvestadiet), kan et fullstendig tap av vingestrukturer observeres i pupal scenen (Tall 3E og 3F). Den resulterende voksen også helt mangler vingestrukturer (Tall 3G og 3H). RNAi resultat for vg eksemplifiserer både robusthet og den systemiske natur RNAi i T. castaneum.
Figur 1: (A) Eksempler på ubrutt, gode og dårlige nåler (B) Tuppen av en godt brutt god nål (C) Tuppen av en ødelagt nål som er for stor og sløv (D) Spissen... av en blakk n nål som er for tynne. Scale barer (rød) er 0,05 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:... (A) En riktig størrelse kanyle innføres i det siste stadium larve (B) Larver hensiktsmessig injisert med den grønne dsRNA-løsning (C) Overløp av dsRNA-løsning ved injeksjonspunktet forårsaket av over-injeksjon (D ) En tynn nål ikke å trenge gjennom larve hårstråene. (E) En stor kanyle innføres i det siste stadium larve. (F) Larver injisert med en stor kanyle, noe som resulterer i overflyt og lekkasje av dsRNA-løsning. Pilene viser nåler.ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempler på vellykket RNAi i T. castaneum. (AD) De siste larve injeksjon av EYFP dsrna resulterer i en reduksjon av EYFP ekspresjon. (A) Larver en dag etter injeksjon. (B) Larver to dager etter injeksjonen. (C) Kontroll puppe. (D) som resulterer fra puppe larve EYFP dsRNA injeksjon. De negative kontroller er buffer injeksjon (A, B) og DsRed dsRNA injeksjon (C, D). Pilspisser og piler indikerer EYFP uttrykk eller mangelen på dem i vingen primordia og øyne, hhv. (EH) Penultimate larve RNAi for vg. (E) Wild-type puppe. (F) vg RNAi puppe. Mangelen på vinge strukturer er allerede synlig på pupal scenen (pil). G) Wild-type voksen. (H) vg RNAi voksen. Wing relaterte strukturer er helt mangler (pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det finnes en rekke viktige problemstillinger som må vurderes for å garantere suksess for RNAi, inkludert lengden og konsentrasjon av dsrna molekyler, konkurranse mellom ulike dsrna molekyler (når man prøver flere slå ned), og muligheten for Off-target Effects (OTE).
dsRNA Lengde
Lengden dsrna molekyler påvirker effektiviteten til systemisk RNAi respons, med en lengre dsRNA være mer effektiv til å utløse RNAi 7,14,15 (selv om lengre grense på dsRNA er for tiden ukjent). Den dsRNA lengde må være lenger enn 50 bp å indusere effektive RNAi i T. castaneum 7. dsRNA mellom 150 bp og 500 bp synes å være ideell for RNAi eksperimenter. Men lengre dsrna molekyler kan også brukes, vil de ha en økt sjanse for OTE og gene-kloning skritt vil bli stadig vanskeligere.
dsRNA Konsentrasjon
ve_content "> Forskjellige grader av genet knockdown kan oppnås, avhengig av konsentrasjonen av dsRNA. 1 ug / mL synes å være en rimelig utgangskonsentrasjon, noe som ofte gir en nær-null-fenotype (kan variere avhengig av gen (er) av interesse ). RNAi kan utføres med en høyere konsentrasjon (f.eks, 7-8 pg / mL) for å oppnå en sterkere RNAi fenotype. RNAi med en seriell fortynning av dsRNA kan noen ganger være fordelaktig å produsere en serie av hypomorphic fenotyper (Supplemental Data Tomoyasu et al. 2009 8, og Borras-Castells upubliserte data).RNAi Competition
Multiple genet knockdown kan oppnås i T. castaneum ved å injisere flere forskjellige dsrna molekyler samtidig. Imidlertid er det også kjent at det å ha flere forskjellige dsrna molekyler tilstede i organismen ofte resulterer i konkurranse mellom dsRNAs for tilgang til RNAi komponenter
Off-målretting
OTE er en iboende interesse for RNAi-baserte tilnærminger. En måte å redusere OTE er å identifisere regioner i målgenet med likeartede sekvenser med andre gener og unngå disse regionene ved utformingen av dsRNA. En enkel BLAST analyse mot T. castaneum spådd genet sett kan identifisere slike regioner. Flere online-verktøy også tillate evaluering av potensielle OTE (f.eks E-RNAi 19). Utføre RNAi for to ikke-overlappende regioner av målgenet er en enkel og effektiv måte å eliminere muligheten for at observert fenotyper er forårsaket av OTE. Muligheten for OTE minimaliseres hvis RNAi i to ikke-overlappende regioner produsere de samme fenotyper (med mindre de to ikke-overlappende regioner har en tilsvarende sekvens).
Vurderer genet knockdown av andre enn fenotypiske analyser midler er ofte avgjørende for å effektivt presentere RNAi relaterte data. To store måter å evaluere genet knockdown er QRT-PCR og Western blot analyse. QRT-PCR er en praktisk måte for å måle nivået av mål-mRNA, og har vært brukt i mange RNAi-relaterte studier, inkludert de i T. castaneum (se Miller et al. 2.012 7 for eksempel). Howeveh, må man vise forsiktighet, slik vi nylig har sett noen tilfeller der målet mRNA nivå er oppregulert ved RNAi (selv om proteinproduktet er nedregulert) (Borras-Castells upubliserte data). Det er foreløpig ukjent om dette RNAi indusert mRNA oppregulering kan være utbredt eller unikt for visse gener. Western blot-analyse er en annen måte for å bekrefte genet knockdown. Denne metode er ganske pålitelig som den måler mengden av det endelige proteinprodukt. Kravet til et spesifikt antistoff mot proteinproduktet av målgenet er en ulempe for denne tilnærming. Utnytte flere uavhengige målinger i tillegg til fenotypeanalyser vil øke tilliten til de fenotypiske data innhentet av RNAi-baserte analyse.
Siden unnfangelsen i T. castaneum, RNAi har primært blitt brukt til å studere gen-funksjon i utvikling og mønster formasjon. Disse T. castaneum utviklingsstudier har vært svært vellykket i characterizing evolusjonært konservert og sin retning funksjoner av gener (anmeldt i Denell 2008 1 og Klingler 2004 2). Men RNAi-baserte studier i T. castaneum er ikke begrenset til utviklingsbiologi. For eksempel kan RNAi bli anvendt for å studere genfunksjon i et vidt spekter av fysiologiske og adferdsmessige responser, inkludert stresstoleranse, predatorer, aggresjon, mate valg, aktivitetsmønstre, og forsvarsmekanismer.
En vanskelighet for å bruke RNAi til disse sammenhenger er sannsynligheten for mitogen effekt. Ofte vil gener som er av interesse har en rekke roller i hele T. castaneum livssyklus, og dermed gjøre fjerning av gener uten utilsiktede fenotypiske effekter vanskelige. Imidlertid kan muligheten til å enkelt utføre RNAi på en rekke scener ofte være en effektiv strategi for å unngå disse mitogen effekt. For eksempel kan utføre RNAi hos voksne i stedet for larver eller pupper tillate oss å omgå unintendens dødelighet forårsaket av genet knockdown under tidlig utvikling. Fleksibiliteten av RNAi respons hos T. castaneum dermed gjør denne modellen et attraktivt valg for å tilpasse RNAi til eksperimenter av gen-funksjon i fysiologiske og atferdsmessige responser.
T. castaneum systemet er også ideell for bruk i en pedagogisk laboratorium. T. castaneum kan være enkelt dyrket på en mel / gjær blandingen ved romtemperatur (25 ° C) uten hyppig subculturing, og RNAi teknikker i T. castaneum er enkle nok til å tilpasses til et laboratorium med unge, lærings forskere. Som RNAi blir en viktig teknikk i en rekke biologiske felt, er det avgjørende at studentene blir utsatt for denne teknikken. Den rett-frem natur larve RNAi teknikk i T. castaneum også oppfordrer flere studenter til å være involvert i forskning, noe som gjør T. castaneum en førsteklasses kandidat for et klasserom orientert genetisk system. </ P>
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Senter for Bioinformatikk og Funksjonell genomforskning (CBFG) ved Miami University for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av Miami University etablererstipend (YT), og National Science Foundation (YT: IOS 0.950.964).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organic whole wheat flour | Heartland Mill Inc. Kansas | G1 | |
| Brewer’s yeast | MP Biomedicals | 2903312 | Sift yeast with #35 stainless sieve before use. Wear protective mask and cover the sieve with plastic wrap, as the sifted yeast is a fine particle and respiratory hazardus. |
| 6 oz plastic Drosophila stock bottles | Fisher Scientific | 11-888 | |
| Sieve | Fisher Scientific | 04-881N | 8 in. dia. x 2 in.D. Use #25 (Nominal opening 710 µm) for larvae, pupae, and adults. |
| Sieve | Fisher Scientific | 04 881 10P | 8 in. diameter #35 (Nominal seive opening: 600 µm) Stainless Steel Sieves, 8 in. dia. x 2 in.D. This sieve is ideal to remove clumps from yeast powder. |
| Sieve receiver | Fisher Scientific | 04-866B | 8 in. diameter |
| 1.5 Quart spouted sample pan | Seedburo Equipment Co. | Model 33 | collection pan |
| Incubator | BioCold Environmental Inc | BC26-IN | Keep it 30 °C with 70% humidity. |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374500 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S397-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Food dye | Kroger | green, blue, or red preferable | |
| Microscope glass slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Tack-It Over&Over | Aleene's | Repositionable glue for sticky slides. Double sided tape can be used as an alternative, however, we found that the adhesiveness varies. | |
| Plastic CD case | Amazon | ||
| Boroslilicate glass capillary | Sutter Instrument | BF100-50-15 | O.D. 1 mm, I.D. 0.5 mm, 15 cm. Without filament |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-87 or P-97 | |
| Removable mounting putty | Loctite Fun-Tak | ||
| Compressed gas duster | OfficeMax | OM96091 | |
| Forceps | Fine Science Tool | 11231-30 | Dumoxel #3 (to manipulate beetles) |
| Forceps | Fine Science Tool | 11252-20 | INOX #5 (to break needle tips) |
| Ethyl ether, anhydrous | Fisher Scientific | E138-500 | |
| Nylon mesh | Flystuff/Genessee Scientific | 57-102 | 120 µm pore size/49% open area |
| Media bottle, 100 ml | VWR | 89000-926 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | SteREO Discovery V12. Injection microscope. | |
| Stereomicroscope | Fisher/Zeiss | 12-070-513 | Stemi2000. Use to break the needle and place larvae onto the sticky slide. |
| X-Y mechanical stage | Zeiss | 4354600000000000 | |
| X-Y mechanical stage | Microscopenet.com | A512 | Inexpensive alternative |
| Manipulator | Narishige | M-152 | |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Glass capillary holder | Narishige | IM-H1 | |
| 30 ml Disposable syringe | BD syringe | 309650 | BD Luer-Lok Tip |
| Four-way stopcock | Cole-Parmer Instrument Co. | EW-30600-03 | Stopcocks with Luer connections; 4-way; male slip |
| Art paint brush | Amazon | Art Advantage Oil and Acrylic Brush Set, 24-Piece | Any general paint brush will work. |
References
- Denell, R. Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo. Genetics. 180, 1779-1786 (2008).
- Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
- Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
- Tomoyasu, Y., et al. Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium. Genome biology. 9, R10 (2008).
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi. PLoS ONE. 7, e47431 (2012).
- Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles. Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).
- Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Larval RNAi in Drosophila. Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).
- Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).
- Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle. Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).
- Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC genomics. 14, 5 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).
- Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum. Nature. 433, 643-647 (2005).
- Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
- Yang, X., et al. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless. Developmental biology. 333, 215-227 (2009).
- Horn, T., Boutros, M. E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).
Tags
Molecular Biology RNA-interferens RNAi gene knockdown rød mel bille,Erratum
Formal Correction: Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015.
Citeable Link.
An erratum was issued for Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.
Step 4.1 was updated from:
Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 70, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.
to
Pull borosilicate glass needles (B100-50-15, O.D.: 1 mm, I.D.: 0.5 mm, 15 cm length) by a needle puller.
NOTE: For Sutter P-87 or P-97, use the setting “Heat = 770, Pull = 45, Vel = 75, Time = 90” or follow Chapter 2 of the Pipette Cookbook: Adherent Cell, C. elegans, Drosophila, & Zebrafish– Recommended Programs. The optimal settings vary depending on the model of the needle puller. The setting for a generic Drosophila injection needle is a good starting point.
