Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כימות Orofacial פנוטיפים ב Published: November 6, 2014 doi: 10.3791/52062
Automatic Translation
1, 1
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

Summary

שיטה לכמת את גודלו וצורת orofacial של עוברי laevis Xenopus פותחה. בפרוטוקול זה, מדידות גודל מסורתיות בשילוב עם morphometrics הגיאומטרי כדי לאפשר ניתוחים מתוחכמים יותר של התפתחות וליקויי orofacial.

Abstract

צפרדעים הפכו לכלי חשוב עבור לנתח את המנגנונים לפיקוח על בנייה ופגמי craniofacial. שיטה לכמת פיתוח orofacial תאפשר לניתוח קפדני יותר של פנוטיפים orofacial על ביטול עם חומרים שיכולים מבחינה גנטית או מולקולרי לתפעל ביטוי גנים או תפקוד חלבון. שימוש בשתי תמונות ממדיות של הראשים העובריים, ממדים-כגון גודל מסורתיים כרוחב orofacial, גובה וarea- נמדדים. בנוסף, מדד עגלגלות של פתיחת הפה העוברית משמש לתאר את הצורה של הפה. morphometrics הגיאומטרי של שתי תמונות ממדיות אלה מבוצעים גם כדי לספק מבט מתוחכם יותר של שינויים בצורתו של אזור orofacial. ציוני דרך מוקצות לנקודות ספציפיות באזור orofacial וקואורדינטות נוצרות. ניתוח מרכיבי עיקרון משמש להפחתת קואורדינטות ציון דרך לרכיבי עיקרון שאז להפלות הטיפולקבוצות. תוצאות אלו מוצגות כעלילת פיזור שבו אנשים עם צורות orofacial דומות להתקבץ יחדיו. זה גם שימושי לביצוע ניתוח פונקצית מבחין, שסטטיסטי משווה את עמדותיהם של ציוני הדרך בין שתי קבוצות טיפול. ניתוח זה מוצג ברשת שינוי בהם שינויים בעמדת ציון דרך נתפסים כוקטורים. רשת היא על גבי וקטורים אלה, כך שדפוס השתאה מוצג כדי להראות היכן עמדות ציון דרך משמעותיות השתנו. שינויי צורה בניתוח פונקצית המבחין מבוססים על מדד סטטיסטי, ולכן יכולים להיות מוערך על ידי p-value. ניתוח זה הוא פשוט ונגיש, הדורש רק stereoscope ותוכנה חופשית, ובכך יהיה משאב מחקר והוראה רב-ערך.

Introduction

בין הסוגים הנפוצים וההרסניים ביותר של מומים מולדים אנושיים כאלה המשפיעים על הפה ופנים, הם כמו בקיעי orofacial 1. ילדים עם מבני orofacial פגומים לעבור ניתוחים רבים במהלך חייהם ואת המאבק עם מומי פנים, דיבור, שמיעה ובעיות אכילה. לכן, קידום מחקר חדש בפיתוח cranio- וorofacial הוא בעל חשיבות עליונה למניעה וטיפול בסוגים אלה של מומים מולדים בבני אדם. Laevis Xenopus התפתח ככלי חדש ללנתח את המנגנונים לפיקוח על בניית craniofacial (כמה דוגמאות כוללות את 2,3,4 -11). לכן, שיטה כמותית לניתוח שינויים בגודל ובצורה במהלך פיתוח של הראש והפנים של מין זה יכול להיות מאוד חזק 3.

כאן, אנו מציגים שיטה כאמור; שילוב מדידות גודל מסורתיים עם morphometrics הגיאומטרי מותאם ממחקר צפרדעים 12 13-15. מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר לחוקרים לכמת גודל פנים וצורות כדי להבחין בין פנוטיפים orofacial השונים במהלך התפתחות נורמלית ולא נורמלית. ניתוח זה יאפשר לבידול טוב יותר בין פגמי craniofacial העדינים כגון אלה הנובעים מהשפעות סינרגיסטי של גנים ו / או גורמים סביבתיים. בנוסף, שיטת כימות זה עשויה גם לחשוף אפילו שיפור או הצלה קל של פגם orofacial. זה כן הופך אותו למדריך שימושי בניתוח הרפוי פוטנציאלי.

השילוב של מדידות פנים וmorphometrics הגיאומטרי שאנו מציגים כאן מאפשר ניתוח סטטיסטי מקיף יותר של שניהם בגודל ובצורה של אזור orofacial מאשר פרוטוקולים הנוכחיים אשר במידה רבה לנצל רק אחת או 15-18 האחר. יתר על כן, אנו מציגים דרך פשוטה להעריך הן את המדיאלי ומטוסים לרוחב שלהפנים ללא צורך בציוד הדמיה תלת-ממדי מתוחכם המשמש במחקרים הנוכחיים 13,19.

אנו מדגימים פרוטוקול זה על צפרדעי laevis עוברים שטופלו במעכב קולטני חומצה רטינואית שגורם פיתוח orofacial חריג ו2,3 חיך שסוע חציון. כימות של הממדים וצורה של אזור orofacial בעוברים אלה חשפה שינויים בmidface שדומה לבני אדם עם בקיעי חיך דומים ומודלים של עכברי 20,21. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את ההשפעות של תרכובות אחרות בפיתוח orofacial כגון חומרים טבעיים, קוטלי עשבים, או חלבונים כגון גורמי גדילה. יתר על כן, שינויי גודל וצורת orofacial הנובעים מהפרעות של ביטוי גנים באמצעות הפסד או רווח של ניסויי פונקציה (באמצעות morpholinos antisense או מצננים / Talens) יכול להיות גם לכמת באמצעות פרוטוקול זה. לבסוף, פיתחנו specifica שיטה זוlly להעריך מורפולוגיה צפרדעים; עם זאת, הוא שונה בקלות לניתוח של כל חוליות. יישומים אחרים יכולים לכלול גם שימוש בפרוטוקול זה להשוואה בין מינים קשורים באופן הדוק למחקרים אבולוציוניים או אקולוגיים. בעוד הדוגמא שאנו מספקים כאן מנצלת פרוטוקול זה כדי לתאר את הניתוח באזור orofacial, זה יכול בקלות להיות שונה לניתוח של אזורים אחרים, איברים, או מבנים.

פרוטוקול כימות orofacial זה יהפוך למשאב יקר ערך עבור קהילת המחקר, כמו גם כלי ללימוד מצוין לסטודנטים לתואר ראשון כהפגנת וידאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בוצעו באמצעות laevis Xenopus אושרו על ידי IACUC (# AD20261 פרוטוקול).

1. ריאגנטים הכנה וחומרים דרושים

  1. ריאגנטים:
    1. הפוך 1 ליטר של 10x MBS (מלוח של בארת השתנה) פתרון 22. להוסיף NaCl (880 מ"מ), KCl (10 מ"מ), MgSO 4 (10 מ"מ), HEPES (50 מ"מ, pH 7.8), וNaHCO 3 (25 מ"מ) ל1 ליטר של מים מזוקקים. התאם ל- pH 7.8 עם NaOH.
    2. הפוך 1 ליטר של MBS 1x על ידי דילול של פתרון MBS 10x ב900 מיליליטר של מים מזוקקים 100 מיליליטר. להוסיף 0.7 מיליליטר של M CaCl פתרון 2 1.
    3. הפוך 1 ליטר של 0.1x MBS על ידי דילול של פתרון 1x MBS ב900 מיליליטר של מים מזוקקים 100 מיליליטר. ל1 ליטר של פתרון MBS 0.1x, להוסיף 1 מיליליטר של 10 מ"ג פתרון גנטמיצין מיליליטר / לשימוש בתרבות עובר.
    4. הפוך MBS מלח גבוה על ידי המסת 4 מיליליטר של 5 M NaCl בשל 10x MBS 100 מיליליטר. ואז להוסיף מים מזוקקים עד נפח כולל הוא 1 ל
    5. הפוך 70% אתנול על ידי דילול דואר 100%thanol 70% אתנול באמצעות מים מזוקקים.
    6. הפוך BMS-543 על ידי הכנת פתרון מניות 10 מ"מ בsulfoxide דימתיל (DMSO).
    7. הפוך paraformaldehyde% 4 (PFA) על ידי הוספת 4 גרם של אבקת paraformaldehyde 50 מיליליטר מים מזוקקים. חום על פלטה חשמלית לכ -65 מעלות צלזיוס, ובשלב להוסיף 5 M NaOH ירידה מבחינת עד פתרון מנקה.
      1. לאחר הפתרון מנקה, מסירים מאש ומוסיף 50 מיליליטר 2x PBS ו -100 Tween-20 μl. אפשר להתקרר לRT על קרח. התאם ל- pH בין 7.2 ו -7.5 שימוש בHCl.
    8. בצע פתרון ופר פוספט עם Tween (PBT) על ידי המסת 8 גרם NaCl, 0.2 גר 'KCl, 1.44 גרם של Na 2 4 HPO, ו0.24 גרם של KH 2 PO 4 ב800 מיליליטר מים מזוקקים. באמצעות HCl, להתאים את ה- pH 7.4. הוסף 2 מיליליטר של Tween-20. התאם את עוצמת קול סופי עם מים מזוקקים שווה 1 L.
    9. בצע פתרון ציסטאין על ידי המסת 1 גרם של ציסטאין ב 50 מיליליטר מים מזוקקים או 0.1x MBS. להוסיף 1.5 מיליליטר של 5 M NaOHnd להתאים את ה- pH 7.8.
    10. הפוך 10% מניות פתרון benzocaine על ידי הוספת 10 גרם של אבקת benzocaine 100 מיליליטר 100% EtOH. להמתת חסד של זכרים בוגרים ועוברים מוכנים לקיבעון, לדלל את פתרון 0.05%.
    11. בצע פתרון אחסון אשכים על ידי הוספת 1 מיליליטר של סרום עגל עד 9 מיליליטר של חיץ L15.
  2. נדרשו כלים וציוד:
    1. השג את הציוד המפורט בטבלה של חומרים וציוד, שמוצג באיור 1.
    2. לשנות כלי פיפטה. הנח את קצה פיפטה פסטר זכוכית לתוך להבת מבער בונזן. סובב את קצה פיפטה עד שהוא נמס ויוצר סוף אטום מעוגל.
    3. שטח פלסטלינה לתוך החלק התחתון של צלחת פטרי פלסטיק, החלקה על מנת לכסות את כל הצלחת (ניתן להשתמש בכל גודל) (איור 1Aiv).
      1. לחץ קל מחט מתגרה ישר לתוך הצלחת מרופדת חימר בזווית של 45 מעלות. החזק את המחט יש, ולאט לאט להזיז את פטרילחלק אופקי כדי ליצור קו בדיכאון (איור 1Bi). חזור על פעולה עבור המספר הרצוי של שורות.
      2. השתמש בסופו של כלי טפטפת זכוכית כדי להפוך את השקעים רדודים, עגולים בכל שורה של המנה מצופה חימר למקום ראשי עובר (איור 1Bii) וסיוע בארגון העוברים בזמן צילום.
      3. לצילום, למלא צלחת עם PBT (איור 1Biii). בין שימושים, לשטוף ביסודיות את הצלחת ומשטח חימר עם מים סטריליים, ואחריו 70% אתנול.

2. טיפולי תרבות ומונעי העובר laevis Xenopus

  1. בהפריה חוץ גופית ותרבות של ביצי צפרדעים:
    1. השג ותרבות Xenopus laevis עובר באמצעות שיטות סטנדרטיים פורסם 22,23.
    2. בקצרה, להרדים זכר בוגר על ידי טבילה ב0.05% פתרון benzocaine. לנתח אשכים ולאחסן במאגר אחסון אשכים. הזרקנשים בוגרות עם גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG), לאסוף ביצים בMBS מלח גבוה, ולהפרות במבחנה עם אשכים גזורים (איור 2 א, ב ').
    3. עוברי תרבות ב0.1x MBS ב 15 מעלות צלזיוס עד שיגיע לשלב הרצוי (עובר שלב על פי הטבלה רגילה של laevis Xenopus ידי Nieuwkoop ופאבר 24,25).
      1. כאן, עובר תרבות עד שלב 22 (24 שעות לאחר הפריה (hpf)), ולהסיר את קרום vitelline תחת סטראו באמצעות שני זוגות מלקחיים חידדו. העברה עובר עם סטנדרטי, פיפטה העברה חד פעמית לצלחת נקייה פטרי (בקוטר 100 מ"מ) המכילה 30-40 מיליליטר של 0.1x MBS.
  2. טיפולים מונעי של עוברי צפרדעים (באיור 2):
    1. מלא את הבארות הכרחיות של תרבות צלחת 24 גם עם 1 מיליליטר של 0.1x MBS באמצעות פיפטה-אדם מכויל. תיחום מחוץ להיטב עם סימן נקודת קנסאה (איור 2 ד, הבלעה). השתמש בסמן גם לתייג את התוכן שיש להוסיף לכל אחד גם על מכסה צלחת תרבות 24 גם. להעתיק את המידע הזה על גבי דף הגדרה 24 גם במחברת המעבדה.
    2. העבר 5-10 עוברים לבאר כל שימוש בתקן, פיפטה העברה חד פעמית (איור 2 ג). הנח אותו המספר של עוברים בכל טוב.
    3. ראש הדף למעלה או להסיר את MBS 0.1x, כך שהוא ברמה עם הקו המסומן 1 מיליליטר (איור 2 ד). הוספת הנפח המתאים של DMSO (כך שהנפח הסופי של DMSO הוא 1%) ועדינות מערבולת. היזהר שלא להוסיף DMSO הקרוב מדי לעוברים, ולהימנע ממגע של עובר עם פני השטח של המאגר.
    4. הוספת הנפח המתאים של חומר כימי לבארות המיועדות ועדינות מערבולת שוב. כאן, להוסיף 1 μl של 10 מ"מ BMS-453 (אנטגוניסט לרצפטור חומצה רטינואית) ו -9 μl של DMSO ל 1 מיליליטר של 0.1x MBS.
    5. אם הכימי רגיש לאור, באופן רופף לעטוף את רחוב ללא מוצאצלחת מכשור בנייר אלומיניום. עוברי תרבות ב-15 מעלות צלזיוס חממה עד השלב הרצוי. בדוגמא זו, טיפול בעוברים ל16-18 שעות.
  3. שטיפת עוברים מחוץ לטיפול וגידול עד שלבי ראשן:
    1. הסר מחצית עד שלושה רבעים מהפתרון עם טפטפת העברה חד פעמי. היזהר שלא להפריע לעוברים. בעזרת פיפטה העברה חדשה, למלא את היטב עם 0.1x MBS. חזור על 3-6 פעמים זה.
    2. העברה עובר לצלחת פטרי גדולה (150 מ"מ בקוטר) המכילה של 0.1x MBS עם גנטמיצין 100 מיליליטר (1 מיליליטר / ליטר). דגירה עובר ב 15 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים שלב 42-45 (hpf 82-100).
    3. לשנות את גנטמיצין פתרון MBS 0.1x מכיל יומי, ולהסיר עובר מת מייד על מנת למנוע זיהום או מוות של עוברים אחרים. רשום את מספר העוברים המתים במחברת מעבדה.
  4. עוברי תיקון בparaformaldehyde (PFA):
    1. תקן את העוברים בין שלבי 42 ו -45 (82 ו -100hpf, בהתאמה) על ידי העברתן לצלחת תרבות חדשה 24 גם מכילה 1-2 מיליליטר של MBS 0.1x. תווית את המכסה עם אותו המידע כהגדרת הטיפול שתוארה לעיל (הסעיף 2.2.1).
    2. להסיר כמה שיותר MBS 0.1x מכל טוב שאפשר, ועדיין משאיר את העוברים מכוסים והבטחת קשר מינימאלי כדי למנוע פגיעה. להוסיף 1-2 מיליליטר של 0.05% פתרון benzocaine ב0.1x MBS ולדגור עד עוברים כבר לא מגיבים לגירויים.
    3. להוסיף 1-2 מיליליטר של PFA 4%. לחלופין, למקם את העוברים בצינורות microcentrifuge כותרת לקיבעון, אם מועדפים.
    4. דגירה עובר בPFA למשך 24 שעות ב 4 ° C על שייקר מסתובב. הסר PFA על ידי ביצוע 3-4 שוטף עם PBT במשך 3-5 שעות.

3. מצלם את אזור Orofacial של ראשני צפרדעים

  1. הכנה מראש צילום (זה מתואר באיור 3):
    1. הנח עוברים קבועים בצלחת פטרי גדולה (150מ"מ קוטר) המכיל כ 100 מיליליטר של PBT.
    2. לעשות שני חתכים לנתק את הראש מהגוף (איור 3 א, קווים שחורים מוצקים). ראשון, להחזיק את העובר עם זוג המלקחיים ולעשות חתך בצד האחורי של הבטן עם אזמל סטרילי (איור 3 ב). לעשות חתך שני בצד הקדמי של הבטן, ליד הלב, כדי להסיר את הראש (איור 3 ג) לחלוטין.
    3. פיפטה ניתקה ראשי עובר לתוך צלחת מרופדת חימר (חלק 1.2.2) שימוש בתקן, פיפטה העברה חד פעמית.
      1. עבור תצוגות קדמיות, השתמש בשני זוגות מלקחיים למצב את הצד אחורי ראשי העובר בפנים השקעים עגולים. שימוש במלקחיים כדי לתפעל שני ראש העובר והחימר מסביב, עוברי מצב כזה שהם עומדים בפני המצלמה ואינם מוטים לאחור או לכל צד (איור 3D). דחף בעדינות את החימר מקיף סביב הראש באמצעות מלקחיים ו / או הזכוכיתכלי פיפטה כדי לאבטח את הראש במקום.
      2. לנוף צדדי, להשתמש במלקחיים כדי למקם את הראש עובר בתוך השקעים עגולים כזה שהם בצד שלהם, פונים לאותו כיוון, והם שטוחים נגד החימר. מניפולציות ראש העובר וחימר מסביב כך שבלוטות המלט של כל העוברים מוצבות כלפי מטה באותה הזווית (איור 3E). השתמש בשורות נמשכות עם המחט מתגרה כמדריך כדי להבטיח דיוק, כאשר במדידות לרוחב.
  2. לכידת תמונות של ראש הראשן:
    1. לצלם את הראש של ראשן שימוש בכל מיקרוסקופ לנתח עם מצלמה דיגיטלית שמחוברת לתוכנת המצלמה המקבילה. השתמש בהגדלה הגבוהה ביותר שיכול להיות כל הזמן קבוע לכל העוברים.
    2. מרכז עוברים ולהתמודד עם כולם באותו הכיוון. צלם תמונות באמצעות תנאי התאורה הטובים ביותר שיאפשר לתמונה מדויקת ביותר של אזור orofacial. מיקוםאורות, כדי למנוע צללים מוגזמים. לשמור תמונות כ.tiff קבצים עם הרזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית.

4. מדידה וניתוח מימדי גודל פנים בראשני צפרדעים

  1. למדוד ממדי orofacial (מסוכמים באיור 4):
    1. לקבוע את רוחב הפנים. לזהות את הנקודות בן חלק הגחון של כל עין פוגש פריפריות של הפנים (איור 4 א, ​​חיצים), ולמדוד את המרחק בין נקודות אלה (איור 4 א, ​​קו אדום).
    2. לקבוע את גובה פני. ראשית, לקבוע את קו האמצע על ידי מדידת המרחק בין כל עין וחישוב ציון המחצית. בשלב הבא, לצייר קווים אופקיים המסמנים ביותר קצות הגב של העיניים והגב רוב הנקודה של בלוטת המלט (איור 4, קווים לבנים). על קו האמצע, למדוד את המרחק בין הקווים אופקיים (איור 4, קו אדום).
    3. לקבוע tהוא אזור orofacial. השתמש באותם קווים אופקיים מציינים את קצות הגב של העיניים ובלוטת מלט כדי להדריך את מדידת שטח (איור 4C, קווים לבנים). התחל בנקודה בה הקו האופקי מציין את החלק העליון של בלוטת המלט עומד בפריפריה של הצד השמאלי של הפנים (איור 4Ca).
      1. צייר הקו לאורך הקצה של הפנים המקיפות את העין עד לנקודה שבה הקו האופקי מציין את החלק העליון של העיניים עומד בפריפריה של הפנים (איור 4Cb). תמשיך לעקוב לאורך הקו האופקי ביותר גב זה, עד לנקודה שבה עומדת בפריפריה של הצד הימני של הפנים (איור 4Cc).
      2. עקוב אחר כלפי מטה לאורך הקצה של הפנים המקיפות את העין עד לנקודה שבה הקו האופקי ביותר הגחון סימון העליון של בלוטת המלט עומד בפריפריה של הצד הימני של הפנים (איור 4Cd). תמשיך לעקוב לאורך UNT הקו הזה התחתון האופקיil הוא עומד בנקודה שבה מעקב החל. השתמש בתוכנה לעריכת תמונות כדי לחשב את השטח בתוך המעקב.
    4. לקבוע את אורך החוטם. על תמונות לרוחב, להפוך את קו אנכי שמסמן את הקדמית של העין. בשלב הבא, למדוד את המרחק האופקי מרוב הנקודה הקדמית שבו הפנים עומדים בקצה הגב של בלוטת המלט לקו האנכי לציון הקדמי של העין (איור 4D).
    5. לקבוע את רוחב הפה. מדוד את המרחק האופקי בין נקודות ימין ועל שמאל שבו "שפתיים" העליונה והתחתונה של פגוש הפה פתיחה (איור 4E). אלה יכולים להיחשב שווה ערך צפרדע commissures שְׁפָתִי.
    6. לקבוע את עגלגלות הפה. לחשב את הפה עגלגלות כיחס היבט הפוך שבו (4   ×   [האזור]) / (π   ×   [ציר מרכזי] 2 >).
      1. השתמש בכלי לאסו בצילום עורך להתחקות הקצוות של פתיחת הפה, כפי שמוצג באיור 4F. בחר לנתח בסרגל הכלים הראשיים, ולבחור למדוד. לחלופין, לחשב עגלגלות מהמדידה של שטח וקוטר של פתיחת הפה.
  2. ניתוח נתונים של ממדי פנים:
    1. קלט המדידות של ממדי פנים לתכנית ניתוח נתונים להשוואת קבוצת הטיפול עם השליטה. לקבוע את הממוצע של כל מדידה עבור שני קבוצות ניסוי ובקרה ליצירת גרפים בר. לקבוע סטיית תקן על מנת ליצור שורות שגיאה. לבצע מבחני t של הסטודנט לבחינה סטטיסטי השוואה בין קבוצות.
      הערה: מידע זה יכול להיות די משתנה בשל השיעורים שונים מעט של פיתוח בין עוברים.

5. ניתוח כמותי של צורת Orofacial וMorphometrics

  1. ציוני דרך מקום וCreaקובץ te ציון הדרך לתאם (באיור 5 א).
    1. בחר ציוני דרך כזו שהם ללכוד את הצורה של תמונת היעד, וניתן להציב שוב ושוב באותו מיקום יחסי בכל הדגימות מנותחות. אם מבנה אינו קיים בכל הדגימות, אל תניח לנקודת ציון במבנה זה.
      1. כאן, מקום 24 ציוני דרך לייצג את midface עם סימנים מזהים כגון עיניים, נחיריים, ופה. לעקביות, מקום ציוני הדרך באמצע הדרך בין ציוני דרך הונחו בעבר (למשל, ציוני דרך פה, איור 5Ai).
    2. ללכוד קואורדינטות נקודת ציון וליצור "ציון הדרך לתאם קובץ". פתח את התמונה הראשונה של פנים ראשן (לדוגמא, את עובר השליטה הראשון).
      1. בחר בכרטיסייה התוספים בסרגל הכלים הראשיים ולבחור Pointpicker מהתפריט הנפתח. בחר את ציוני דרך כרטיסיית הוספת נקודות ומקום במקומות רצויים כציוני דרך יופיעו כצלבים צבעוניים (
      2. הזז מקומות ציון דרך לאחר מיקום על ידי בחירת כלי צלבי העבר. כאשר כל ציוני הדרך הוצבו על התמונה, בחר בכרטיסיית תוצאות תצוגה בסרגל הכלים הראשיים ולבחור הצג (איור 5Aii) כדי להציג את קואורדינטות אתר ולהעתיק לתכנית גיליון אלקטרוני (איור 5Aiii).
      3. בעת הדבקת קואורדינטות אלה מעוברים הראשונים לתכנית גיליון אלקטרוני, להשאיר שורה ריקה מעל לנתונים. בטור ב 'בשורה זו ריקה (שורת 1), "LM =" סוג עם מספר ציוני דרך במדגם. הנה, הזן "LM = 24" מאז 24 ציוני דרך נוצרו (איור 5Aiii, תיבה אדומה).
      4. בשורה מתחת לנקודתי נתונים, הסוג "id =" עם שם זיהוי המדגם. כאן באיור 5Aiii, הזן "ID = CON1", מאחר שזו נקודת הציון לתאם נתונים של עובר השליטה הראשון (איור 5Aiii, חץ אדום).
        5. הערה: חשוב שכל עובר ניתן שם ייחודי ב" = זיהוי "השורה. הנה לדוגמא, הסדרה הבאה של קואורדינטות נקודת ציון ניתנת תעודת הזהות של "CON2" שכן הוא היה העובר השני בקבוצת הביקורת.
      5. העתק את העמודות השניה ושלישית כולו למסמך טקסט ולשמור כקובץ txt.
  2. הגדר את תוכנת מורפומטריות לניתוח נתונים (באיור 5 ב).
    1. כאן, בחר באפשרות צור נתונים חדשים סט בתפריט הראשי בתוכנה morphometric. תן שם לקובץ והנתונים שנקבעו בתיבות המתאימות (לדוגמא, "חומצה הרטינואית עיכוב" ו- "ציוני דרך פנים", בהתאמה) במסך הקופץ (איור 5Bi). לייבא את הקובץ כפי TPS, וselect קובץ הטקסט של קואורדינטות ליצור מערך נתונים (איור 5Bi, חץ אדום).
    2. יישור נתונים ופרוקרוסטס להתאים:
      1. בצע פרוקרוסטס כושר ויישור. סמן את הנתונים שנקבעו בכרטיסיית פרויקט העץ, לבחור פעולות הכנות בסרגל הכלים הראשיים, וניו Fit סדום בתפריט הנפתח.
      2. בחר יישור על ידי ציר ראשי ובחר לבצע פרוקרוסטס Fit בחלק התחתון של התיבה (איור 5Bii, חץ אדום). חזור להקדמת תפריט נפתחת, בחר באפשרות צור שונות המשותפות מטריקס (איור 5Biii), ובחר לבצע.
      3. הצג את המתאמים של מטריקס השונה המשותפת בכרטיסיית התוצאות.
    3. צור "קובץ מסווג" על ידי הקצאת כל דגימה בנתונים מוגדרים משתנה מסווג המקום להבחין אם הוא משתייך בקבוצת הניסוי או לקבוצת הביקורת.
      1. תוויות לשתי עמודות בגיליון אלקטרוני. תווית הכותרת של קולום הראשוןn עם "תעודת זהות" וקלט של אותו המזהה הניתן לכל דגימה (לדוגמא, CON1, RARINHIB1, וכן הלאה; איור 5Biv). תווית הכותרת של העמודה השנייה עם "טיפול" וקלט לתוך כל תא קבוצת הטיפול שמתאימה למדגם הרשום בתא מזהה הסמוך.
      2. כאן, להשתמש במדבקות "מעכב השליטה וRAR" כמסווגים (איור 5Biv). העתק לקובץ טקסט ולשמור כקובץ txt. משתני יבוא מסווג לתוכנת morphometric. בחר התאמה על ידי מזהה, ופתח את קובץ הטקסט (איור 5Bv).
  3. צור עלילת פיזור ניתוח מרכיבים עיקרי (PCA) על ידי בחירה בתפריט הנפתח של הווריאציה והבחירה עיקרי רכיב ניתוח (איור 6Ai). בשלב הבא, בחר בכרטיסייה הגרפיקה כדי לראות שלוש לשוניות נוספות: שינויי צורת מחשב, ערכים עצמיים, וציוני מחשב (איור 6Aii). ציוני PC הכרטיסייה מציגה בivariate scatterplot המרכיב העיקרי של נתוני ציון דרך בכושר סדום (איור 6Aii).
    1. כדי לשנות את המרכיבים עיקריים הם זממו, להעלות את התפריט המוקפץ במרחב העלילה ובחר את הציר הרצוי לשנות (איור 6Aiii, חץ אדום).
    2. בחר בכלי נקודות צבע נתונים (איור 6Aiii). מסווגים בחר יובא קודם (סעיף 5.2.2) בתפריט הנפתח השני שמופיע כדי לקבוע את הצבע של כל קטגוריה (איור 6Aiv).
    3. להציג את כמות שונות שנתפסה על ידי כל אחד ממרכיבים העיקריים בכרטיסיית התוצאות (איור 6Av). גרף יצוא כקובץ .bmp.
  4. צור רשת שינוי ניתוח פונקצית מבחין (DFA) בתוכנה מורפומטריות ידי בחירת ניתוח פונקצית Discriminant תחת לשונית ההשוואה (איור 6Bi). בתפריט המוקפץ, להבטיח כי בסיס הנתונים המתאימים הוא selected ואת סוג הנתונים הוא קואורדינטות פרוקרוסטס-כושר.
    1. סמן את הזוגות של קבוצות להשוואה, ולהפעיל 1,000 בדיקות תמורה (איור 6Bii).
    2. תחת הגרפיקה, לצפות במפת הווקטור של הקואורדינטות בכרטיסיית הבדל צורה (איור 6Biii). אם התמונה היא הפוכה, להעלות את התפריט המוקפץ במרחב העלילה להעיף את התרשים בכיוון הנכון (איור 6Biii).
    3. כיוון הווקטורים משקף את פער צורה מהקבוצה הראשונה בהשוואה לשנייה, אשר מוצג בתפריט פונקציות Discriminant לפני הפעלת הניתוח (איור 6Bii). להפוך את הכיוון של הווקטורים, להעלות את התפריט המוקפץ במרחב העלילה ולשנות את הסימן של גורם קנה המידה, כך שהוא שלילי (איור 6Biii, ד). הערך של הערך בקנה מידה מוגדר בפקטור של עשר בצורה הטובה ביותר מייצגת את ההבדלים הסטטיסטיים בעמדת ציון דרך between שתי קבוצות ללא עיוות, ובדרך כלל נשארים בברירת המחדל (איור 6Biv).
    4. כמו כן, בתפריט המוקפץ, לשנות את הגרף לרשת שינוי כדי להרכיב את הווקטורים על רשת (איור 6Biii, v).
    5. ציין את מספר הקווים אופקיים ואנכיים של הרשת בתפריט המוקפץ (איור 6Biii, v).
    6. לייצא את הגרף כקובץ .bmp.
    7. צפה מרחקי סדום וMahalinobis וp-ערכים תחת לשונית התוצאות (איור 6Bvi).
  5. ניתוחי morphometric נוספים כי הם שימושיים להערכת קבוצת טיפול יותר מפעם אחת
    1. צור רשת שינוי ניתוח המרכיבים ראשי. צורת המחשב משנה כרטיסייה מציגה את מפת הווקטור של שינויי צורה והיוו את שונות בתוך כל קבוצת מדגם. השתמש בתפריט המוקפץ במגרש בשטח כדי לכוון את התמונה כראוי ולהרכיב וקטורים על רשת שינוי. הגדר את גורם קנה המידהלערך על ציר x של גרף ציוני מחשב שמתאים למרכז המשוער של קבוצת הביקורת. לייצא את התמונה כקובץ .bmp.
    2. צור scatterplot CVA. בכרטיסיית ההשוואה בסרגל הכלים הראשיים, בחר Canonical משתנה ניתוח, ולהאיר את הסט משתנה מסווג שיובא בעבר (ראה סעיף 5.2.3). בחר 1,000 חזרות לבדיקות תמורה, ובחר הפעלה. בחר בכרטיסייה ציוני קורות חיים כדי להציג scatterplot CVA bivariate. זה מקודד לפי צבע המבוסס על מסווגים נטען. לשנות את ערכת צבעים על ידי הבאת את התפריט המוקפץ במרחב העלילה (ראה סעיף 5.3.3). יצוא כקובץ .bmp.
    3. צור רשת שינוי CVA. רשת שינוי של תוצאות CVA יכולה להיות שנוצרה בעת ההשוואה יותר משתי קבוצות. בכרטיסיית הגרפיקה, לבחור משנה את צורתו קורות חיים כדי לחזות את רשת השינוי של קואורדינטות נקודת הציון. להעלות את התפריט המוקפץ במרחב העלילה לשנותהכיוון של הווקטור, להרכיב תוצאות על רשת שינוי, ולציין את מספר קווי הרשת. לייצא את הגרף כקובץ .bmp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן, ניתוח כמותי של גודל orofacial וצורה הודגם להשוות עוברים שטופלו במעכב חומצה רטינואית קולט (מעכב RAR) לבקרה שלא טופלה. טופלו עוברים עם ריכוז 1 מיקרומטר של מעכב כימי זה משלב 24-30 (26-35 hpf), נשטף החוצה, וקבוע בשלב 42 (82 hpf). לאחר מכן הם עובדו ונותחו כמתואר בפרוטוקול. תוצאות הן הנתונים מקוריים, אך עולה בקנה אחד עם תצפיות בפרסומים קודמים 2,3. טופלו עובר בקרה עם הרכב, DMSO, והתפתחתי באופן נורמלי (איור 7Ai, ii). עוברים שטופלו בריכוז 1 מיקרומטר של מעכב RAR הראו צמצום קל של הפנים, מומים העין, ופה עוברי פגום פתיחה שהיה בצורה משולשת יותר (איור 7Aiii, ד).

ראשית, ממדי orofacial מסורתיים נמדדו ומסוכמים באיור 7. S משמעות tatistical נקבעה על ידי ביצוע מבחן t של סטודנט בהנחה שונות שאינו שווה בין עוברי המעכב טופלו ובקרות לכל מדידה. מצאנו ששניהם אורך החוטם ופרצוף רוחב ירדו באופן משמעותי בעוברי מעכב טופל RAR השוואה לקבוצת ביקורת (p-ערכים = 0.0062 ו0.0058, בהתאמה; איור 7Bi, ii). בעוד פנים של גובה והפה העגלגלות היו גדלו באופן משמעותי (p-ערכים = 3.7772 x 10 -6, 1.4812 x 10 -7), פה רוחב ירד משמעותי (p-value = 2.5175 x 10 -10; איור 7Biii-V) .the תוצאות לא הראו הבדל משמעותי באזור orofacial כולל בין שתי הקבוצות (p-value = 0.3754; איור 7Bvi). נתונים אלו מראים כי אובדן של איתות חומצה רטינואית בזמן מסוים בתוצאות פיתוח בחוטם קצר יותר, צמצום קל של אזור midface, ומום של פתיחת הפה העוברית.

NT "> כדי לספק מבט מתוחכם של שינויי הצורה של אזור orofacial העוברי בתגובה לאותות חומצה רטינואית מופחתים, אנחנו הבאים מנוצלים מורפומטריות גיאומטרית ניתוחים. לאחר זיהוי והתאמת ציוני דרך orofacial באמצעות תוכנת ניתוח morphometric, אז אנחנו בחנו את השונות בתוך כל קבוצה דרך ניתוח מרכיבים עיקרי (PCA). כאשר שני המרכיבים העיקריים הראשונים היו זממו נגד כל עוברים אחרים, מעכב RAR טופלו נבדלה מפקדים לאורך ציר PC1 (איור 7 ג) באופן ברור. בדיקה זו הראתה גם חריגות בset- המדגם מאויר על ידי שני עוברי מעכב טופל שלא אשכול עם שאר הקבוצה (איור 7 ג, חיצים).

בשלב הבא, את ההבדלים הסטטיסטיים בצורה של אזור orofacial בין עוברי מעכב טופל RAR ובקרות הוערכו ומדמיינים ידי ביצוע ניתוח מבחין פונקציה (DFA). ב מרחק פרוקרוסטסetween שתי הקבוצות היו שונות באופן משמעותי (מרחק = 0.2665, p-value <0.0001, איור 7D), המצביע על שינוי בצורת orofacial כאשר איתות חומצה רטינואית מופרת. ואכן, שינויים דרמטיים בעמדה של ציוני דרך לרוחב באזור orofacial מצביעים על צמצום צורת הפנים המתאימה לגובה בעוברי המעכב שטופלו (איור 7D). בנוסף, השינוי החיצוני הקל בעמדה של ציוני דרך האף (איור 7D, חיצים) חושף את החריגות בעמדת נחיר בעוברים אלה שעולים בקנה אחד עם תוצאה ירידה של החוטם. השינויים בציוני דרך המגדירים את הקצוות של שינויי עמדת תכנית הפה פתיחה המשקפים את ההיווצרות של פה בצורה משולשת פתיחה שעולים בקנה אחד עם שסע החציון דווח במחקרים הקודמים שלנו 2,3. בנוסף למשמרות וקטור, דפוס העיוות של רשת השינוי גם ממחיש שינויי צורה באואזור ofacial. עיקום באזור midface עולה בקנה אחד עם hypoplasia midface וצמצום פנים כולל ראה בעוברים עם אותות ירדו חומצה הרטינואית (איור 7D).

תוצאות ניתוח פונקצית מבחין (DFA) מראים שינויי צורה שעולה בקנה אחד עם הניתוח האיכותי שלנו, כמו גם חושפים כמה שינויים שלא נתפסו כראוי על ידי מדידות גודל מסורתיות לבד. לדוגמא, בעוד ששטח orofacial לא היה שונה באופן משמעותי בין בקרות ומעכב טופל עוברים (איור 7Bvi), רשת שינוי DFA חשפה שינויים דרמטיים באזור זה עולה בקנה אחד עם צמצום הפנים ראו בעוברים שטופלו במעכבי (איור 7 א, ד). יתר על כן, המשמרות השתאה דפוס וציון הדרך של פתיחת הפה, בשילוב עם השינוי המשמעותי שראינו בפה עגלגלות, להמחיש את העיוות של הפה פתיחת צורה באמברי מעכב טופל מערכת הפעלה. לסיכום, שילוב של מדידות מסורתיות של ממדי פנים וניתוח morphometric גיאומטרי ממחיש את השינויים בצורה ובגודל של אזור orofacial כאשר אותות חומצה רטינואית הם שיבשו.

איור 1
איור 1. חומרים דרושים. כלים () לניתוח נתונים. צלחת 24 גם (i), (ii) פיפטה העברה חד פעמית סטנדרטית, (iii) דומון # 5 מלקחיים Inox, (iv) צלחת פטרי מרופד חימר, (v) מחט מתגרה ישר, כלי טפטפת זכוכית (vi), (vii ) אזמל סטרילי, חד פעמי. (עריכת B) של המנה מצופה החימר. (I) מחט מתגרה ישר משמשת לציור קווים אופקיים בחימר. (Ii) כלי טפטפת זכוכית משמש כדי להפוך את השקעים מעגליים לאורך כל שורה. (Iii) הצלחת מלאה בPBT להדמיה.

page = "תמיד"> איור 2
איור 2. בהפריה חוץ גופית ותרבות של ביצי צפרדעים. (א) לאחר הזרקת HCG, מבוגר Xenopus laevis נקבות מושרה להטיל ביצים. ביצים (ארוחת בוקר) שנאספו בMBS מלח הגבוה, מופרה עם אשכים שחולצו מזכר, ותרבותי באמצעות שיטות סטנדרטית. עוברים (ג) מועברים ל צלחת 24-היטב המכילה 0.1x MBS שימוש בתקן, פיפטה העברה חד פעמית. (ד) פיפטה-אדם מכויל משמשת למדידה 1 מ"ל לריק גם, וסמן משמש לתיחום לרמה זו בצד החיצוני של כל הבארות עוברים המכילים (הבלעה). 0.1x MBS הוא הוסיף אז או נלקח, כך שהוא ברמה עם סימן זה.

"Width =" highres.jpg 500 "/>
איור 3. הכנת ראשי עובר להדמיה. (א) תרשים של שני החתכים יידרשו להסיר ראשים, קווים שחורים מוצקים. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. (ב) החתך הראשון מתבצע בסוף האחורי של הבטן כדי להסיר את לחץ הזנב ושחרור מהאזמל. סרגל = 400 מיקרומטר. החתך השני (C) הוא עשה בקצה הקדמי של הבטן, ליד הלב, לנתק את הראש לגמרי. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. (ד) צפיות פרונטאלית של שורה של ראשי העובר ממוקמים בחימר. סרגל קנה מידה = 650 מיקרומטר. (E) צפיות ברוחב של שורה של עמדת ראשי העובר בחימר. CG סרגל = 500 מיקרומטר: בלוטת מלט.

איור 4
איור 4. מדידות גודל מסורתיות של ממדי orofacial. () רוחב strong> פנים. חצים מצביעים על נקודות שבן החלק הגחוני של העין עומד בפריפריה של הפנים. קו אדום הוא רוחב הפנים, שנמדד כמרחק בין נקודות אלה. קווי סרגל קנה מידה = 210 מיקרומטר. גובה (B) פנים. לבן הם מדריכים ושורטטו לפני המדידה בקצה הגב של העיניים וקצה הגב של בלוטת המלט. קו אדום הוא גובה פני, שנמדד כמרחק בין שני המדריכים האלה על קו האמצע של הפנים. סרגל קנה מידה = 210 מיקרומטר. אזור Orofacial (C). קווים לבנים הם מדריכים ושורטטו לפני המדידה. (א) נקודה שבה המדריך התחתון עומד בקצה הגחון של העין השמאלית. קו אדום מראה את המעקב מסביב לעין השמאל. (ב) נקודה שבה קצה הגב של העין פוגש את המדריך העליון. קו כחול מראה את גבול הגב של אזור orofacial, בזמן שהעביר המדריך העליון בקצה הגב של העיניים. פוינט (ג) שבו המדריך העליון עומד בפריפריה הפנים תקין. מופעי קו ירוקיםהמעקב מסביב לעין ימין. פוינט (ד) שבו בקצה הגחון של עין ימין פוגש את המדריך התחתון. קו צהוב מציג גבול הגחון של אזור orofacial, בזמן שהעביר המדריך התחתון בקצה הגב של בלוטת המלט. סרגל קנה מידה = 210 מיקרומטר. אורך סנאוט (ד '). קו לבן הוא בקצה הקדמי של העין והוא נמשך כמדריך לפני המדידה. קו אדום הוא באורך חוטם, שנמדד מהקו הזה לנקודה שבה קצה הגב של בלוטת המלט פוגש את הפריפריה לרוחב של הפנים. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. רוחב (E) פה. חצים הם נקודות שבהם נפגשים הגב ושפתי הגחון. הקו האדום הוא רוחב הפה, שנמדד כמרחק בין שתי הנקודות הללו. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. עגלגלות (F) בפה. המערכת של פתיחת הפה היא לייחס ומוצגת באדום. CG: בלוטת מלט. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר.

FO איור 5. לכידת ציוני דרך והקדמות לניתוח morphometric גיאומטרי. (א) שימוש בתוכנה לעריכת תמונות ותוכנת גיליונות אלקטרוניים למקום ציוני דרך ונקודתי ציון של לכידה. צלבים צבעוניים (i) הם ציוני הדרך מונחת על התמונה באמצעות כלי נקודות הוספה בImageJ לייצג את הצורה של אזור orofacial. (Ii) נתונים לנדמרק מוצג על ידי שימוש בכלי תוצאות תצוגה. (Iii) נתונים ציון דרך להעתיק ולהדביק לתוך גיליון אלקטרוני. מעל העמודה השנייה היא כותרת זיהוי מספר ציוני הדרך וכונתה על ידי "LM = 24" (תיבה אדומה). מתחת לעמודה השנייה של נתונים, המדגם ניתן שם ייחודי וכונה על ידי "id = CON1" (חץ אדום). זה חוזר על עצמו לכל התמונות בסדרת מדגם והנתונים נשמרים כקובץ טקסט. ניתוח נתונים ראשוני (ב ') בsoftw מורפומטריות גיאומטריתהם תכנית. קובץ הטקסט שנוצר מהתוכנה לעריכת תמונות (i) מיובא לתכנית מורפומטריות, MorphoJ, כקובץ TPS. קובץ מצויינים על ידי חץ אדום. (Ii) נתונים לנדמרק לתאם מיושר על ידי התאמת סדום על ידי צירים עיקריים. חץ אדום מציין ביצוע של יישור. (Iii) מטריצת שונות משותפת של ציוני דרך בכושר פרוקרוסטס מופקת בתפריט הפעולות הכנה. (Iv) קובץ מסווג נוצר בגיליון אלקטרוני. עמודת A ו- B מקבלים כותרות "ID" ו- ​​"טיפול", בהתאמה. הקלט של הזהות שניתן לכל מדגם באיסוף נתוני אתר נמצא תחת עמודה, וקבוצת הטיפול שבה כל מדגם שייך הוא קלט בעמודה B. (v) הקובץ מסווג מיובא לתכנית מורפומטריות כמערכת משתנה מסווג ובהתאמה על ידי מזהה עבור ערכת הנתונים שנבחרה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר שלנתון זה.

איור 6
איור 6. ניתוח סטטיסטי בתוכנת morphometric. עיקרי (א) רכיב ניתוח PCA (PCA) (i) נבחרה בכרטיסיית הווריאציה. (Ii) שני המרכיבים העיקריים הראשונים של ציוני דרך סדום מוצגים כscatterplot בכרטיסיית ציוני מחשב. (Iii) בתפריט מוקפץ שהעלה על שטח החלקה. תפריט זה משמש כדי לשנות את מנהל רכיבים הם זממו נגד כל אחת (חץ אדום) אחר ולצבוע את נקודות נתונים (מסומנות בכחול). (Iv) נקודות נתונים צבעוניות על פי המשתנים מסווגים בתפריט המוקפץ. (V) אחוז מהשונות שנתפס על ידי כל אחד ממרכיבים העיקריים מוצג בכרטיסיית התוצאות. פונקצית Discriminant (ב) ניתוח (DFA) (i) DFA נבחר בכרטיסיית ההשוואה. (ii) ערכת נתונים של סדום קואורדינטות נבחרה לDFA, והמסווגים שנטענו בעבר נבחרו לקיבוץ. הקבוצות הרצויות להיות בהשוואה נבחרות ובדיקות תמורה מנוהלות. (Iii) תוצאות DFA מוצגות כמפת וקטור בכרטיסיית הבדל צורה. תפריט מוקפץ במרחב העלילה יכול לשמש כדי לכוון את התמונה בצורה נכונה. (Iv) על ידי בחירה בכרטיסייה הסט Scale Factor בתפריט המוקפץ, הסימן לגורם בקנה מידה ניתן לשנות. (V) מפת הווקטור משתנה לרשת שינוי עם המספר הרצוי של קווי רשת על ידי בחירה לשנות את סוג הגרף בתפריט המוקפץ של מפת הווקטור. (Vi) מרחקי מלנוביס ופרוקרוסטס וp-ערכים מקבילים נתפסים תחת לשונית התוצאות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7. ניתוח Orofacial שליטה וRAR עכבות טופל עוברים. (א) (i, ii) נציג תמונות של בקרות. ברים בקנה מידה = 270 מיקרומטר. (Iii, iv) עוברים שטופל בריכוז 1 מיקרומטר של מעכב RAR, BMS-453. ברים בקנה מידה = 260 מיקרומטר. (I, iii) חזיתית צפיות. פתיחת פה מתוארת בנקודות אדומות. (II, IV) צפיות בצד. CG:. בלוטת מלט (ב ') ממדי orofacial מסורתיים של שליטה (שחור) ומעכב טופל עוברים (כחולים). אורך חוטם (i), במ"מ (ii) פניה רוחב, במ"מ (iii) פניה גובה, במ"מ (iv) פה רוחב, במ"מ (v) פה עגלגלות, מספר יחידה-פחות שנקבע בImageJ באמצעות המשוואה: (4   ×   [האזור]) / (π   ×   [ציר מרכזי] 2). (Vi) אזור Orofacial, במ"מ (ג) רכיב ניתוח. פקדים הם בעוברי מעכב טופל שחורים וRAR הם בכחול. חיצים שחורים מצביעים על חריגים. PC1 = 73.63%, PC2 = 9.56%. (ד ') ניתוח פונקצית Discriminant בו מוצגות מרחק פרוקרוסטס וp-value, בנוסף לרשת שינוי. סוף המעגל סגור של וקטור הוא עמדת ציון דרך בעוברים שטופלו במעכבי RAR. סוף השורה של הווקטור הוא מיקום אתר בבקרה. חיצים שחורים מצביעים על שינוי בציוני דרך האף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

laevis Xenopus הפך לכלי שימושי עבור לנתח מנגנוני התפתחות פיתוח orofacial בסיס; עם זאת, אין כיום פרוטוקולים מתארים גודל ובצורה של שינויים באזור זה בצפרדעים. השיטה המתוארת כאן תתרום באופן משמעותי לתחום של פיתוח orofacial כך שהוא מאפשר לכימות קפדני יותר של פנוטיפים orofacial בצפרדעים ובעלי חוליות אחרות.

ההיבט הראשון, הקריטי ביותר של ביצוע פרוטוקול זה כמו שצריך הוא היכולת למדוד ממדי פנים ולקבוע את מיקום אתר הן מדויק וreproducibly. לשם כך, זה קריטי, כי פניהם עובריים להצטלם באותה זווית, הכיוון וגדלה. יש להקפיד במיוחד להשיג מדידות מדויקות של אורך החוטם, שכן קשה לתמרן עוברים רוחבי ולהשיג את המיקום עקבי. העובדה שיש באדם אחד לבצע את כל המדידות על יםיום ame ממזער סוג זה של שגיאה, תוך מיקסום שחזור של התוצאות. ההיבט הקריטי ביותר השני של הבטחת תוצאות טובות הוא ההפחתה של השתנות מיותרות, כגון הבדלים התפתחותיים או רקע גנטי. זה חשוב במיוחד בעת בחינת מובהקות סטטיסטיות בין פגמים עדינים. עוברים, ולכן, צריכים להיות באותו השלב שבו טיפלו וצילמו. יתר על כן, יש להקפיד על מנת להבטיח שיעורים התפתחותיים שקולים בין ובין קבוצות טיפול. כדי להקטין את בעיות כאלה עם השתנות, לוודא שכל העוברים הם מאותו ההורים והם שלב התאמה בתחילת הניסוי. גם להפחית את המקורות חיצוניים של השתנות כגון מקורות שונים חיץ וכרכים, מספרים שונים של עוברים, וחלוקות במנות התרבות (לדוגמא, למנוע צפיפות).

צעד מפתח בהערכה של שינויים בצורה בmorphometrics הגיאומטרי הוא alignment של אתר מרכז באמצעות כושר סדום. על ידי יישום של האלגוריתם המתמטי הזה, כל מידע על גודל או הבדלים בסיבוב של התמונה הוסר. מטריצת השונות המשותפת שנוצרה לאחר מכן קובעת את המתאמים הבלתי מתוקננות של אתר מרכז בין כל העוברים בערכת הנתונים, שבו רב משתנים techniques- הסטטיסטי כגון מרכיב עיקרי או analyses- פונקצית מבחין יכול להתבצע.

ניתוח עיקרי רכיב (PCA) מפחית מדגם מורכב, קבוצה קטנה יותר של משתנים הנקראים מרכיבים עיקריים 26. המרכיב הראשון אחראי למרבית השונות בתוך קבוצת המדגם, בכל רכיב שלאחר מכן היווה את השאר. על ידי התוויית שני המרכיבים הראשונים נגד כל תוכנת מורפומטריות באמצעות אחרת, דגימות שדומות ביותר אשכול ביחד. בדרך זו, PCA מפלה קבוצות בתוך קבוצת מדגם, תוך קביעת הווריאציה בתוכם בו זמנית. בסוםמקרי דואר, קבוצות לא יכולות להיות נבדלים זה מזה באופן ברור וחפיפה לאורך או או שני צירים. במקרה זה, יש יתרון לעלילת רכיבים אחרים (למשל, PC3) במטרה לחשוף את התכונות עדינות שבו קבוצות מופלות. זה רלוונטי במיוחד כאשר השונות הכוללות מופצת באופן שווה יותר בין מספר משתנה הראשון.

ניתוח פונקצית המבחין (DFA) של נתונים בכושר פרוקרוסטס קובע אם דגימות בסט נתונים מופלים ביעילות לקבוצות לפי משתנה הרציף המגדירים אותם. דוגמאות מסווגות ולכן לקבוצות לפני הניתוח, והמשתנים מתורגמים לרכיבים הנקראים פונקציות להפלות כדי לקבוע את הקשר הסטטיסטי בין הקבוצות 27. לפני הפעלת ניתוח זה, חשוב כדי לציין את מספר בדיקות תמורה. בדיקות תמורה אלה באקראי את הנתונים כך שכל הנחות לגבי ההפצה שלה הן eliminaטד. חזרות מבחן תמורה יותר להגביר את הדיוק של p-value. כאשר דמיינו כרשת שינוי, שינויים משמעותיים בעמדת נקודת ציון בין הקבוצות מושווים מוצגים. יתר על כן, דפוס העיוות של הרשת מגלה בהם שינויי צורה להתרחש. החסרון של ניתוח זה הוא שזה יכול להיות מנוצל אך ורק להשוואה בין שתי קבוצות. אם יש שלוש או יותר קבוצות בסדרת מדגם להשוואה, עדיף לבצע ניתוח משתנה הקנונים. זה דומה לDFA בכך שהיא מייצרת P-ערך סטטיסטי; עם זאת, הוא מראה שינויים המתרחשים על פני המדגם כולו נקבע, בנוסף לאלה המתרחשים בין קבוצות בודדות, במסגרת הקבוצה.

המגבלה העיקרית של פרוטוקול כימות orofacial הזה היא שהוא יכול להיות מיושם רק לנתונים דו-ממדיים. המטרות העתידיות שלנו כוללות שימוש בסריקת CT או confocal לפתח שיטות דומות לניתוח של נתונים תלת-ממדיים. מצד השני,עבודה עם תמונות דו-ממדיות היא גם אחת מנקודתי החוזק העיקריות של פרוטוקול זה. stereoscopes הבסיסי בלבד מצוידים במצלמות נדרשים ללכידת תמונות של הפנים העוברית. Openware מנוצל לניתוח נתונים זה גם מגדיל את הנגישות של שיטה זו, תוך הפחתת העלות. יתר על כן, ידע מתקדם בהדמית פלפולים, ניתוחים סטטיסטיים, או תכנות מחשבים אינו נדרשת כדי לחלץ תוצאות משמעותיות ומשמעותיות מהנתונים. למעשה, טכניקה זו נמצאת בשלבי לימדו כחלק מקורס מעבדה לתואר ראשון במחלקה לVCU של ביולוגיה. כך, פרוטוקול כימות orofacial שהוצג כאן הוא קל ללמוד וליישם בפרק זמן קצר. כייצוג וידאו, שלבים קריטיים כגון מיקום עוברים וניווט התוכנה מודגשים כדי להבטיח את הפרוטוקול יכול להיות מנוצל בהצלחה על ידי אפילו סטודנטים וחוקרים לא מאומנים. לסיכום, פרוטוקול זה יספק משאב יקר ערךעבור קהילת המחקר וככלי הוראה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

כספים סטארט-אפ לא דיקינסון מVCU תמכו בעבודה זו.

המחברים מבקשים להודות דן Nacu לכשרון האמנותי שלו ביצירת האיור סכמטי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Zeiss fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-10
Sterile, disposable scalpel Sklar 06-2015
24-well plate Fisher Scientific 087721
Standard Disposable transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri dishes Falcon 351058
Incubators Ectotherm set to 15 °C or 20 °C
Modeling Clay Premo, or other non-toxic modeling clay in black or white
Straight teasing needle Thermo Scientific 19010
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97 Sutter Instrument Co. Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Pipettemen Gilson F144802, F123600, F123602
BMS-453 Tocris 3409
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich 158127
Petri dishes Falcom 353003, 351058 100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol VWR 89125-170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 93 כימות Orofacial morphometrics הגיאומטרי, פיתוח orofacial פגמי orofacial שינויי צורה מידות פנים
כימות Orofacial פנוטיפים ב<em&gt; צפרדעים</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kennedy, A. E., Dickinson, A. J.… More

Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus. J. Vis. Exp. (93), e52062, doi:10.3791/52062 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter