Summary
甲量化非洲爪蟾胚胎的口面的大小和形状的方法已被开发出来。在这个协议中，传统大小的测量相结合，与几何形态测量，以允许口颌面发育和缺陷的更复杂的分析。
Abstract
爪蟾已成为解剖理事颅面发展和缺陷的机制的一个重要工具。 A到量化口面的开发方法将允许颜面部表型废除后，更严谨的分析与物质，可以遗传或分子操纵基因表达或蛋白质的功能。使用胚胎头的二维图像，传统的大小尺寸，如口面的宽度，高度和区内─被测量。此外，胚胎口开口的真圆度测量，用于描述所述口的形状。也执行这些二维图像的几何形态测量，以提供变化的口面部区域的形状的一个更复杂的图。标被分配给特定点的口面部区域，并创建坐标。一个主成分分析方法，以减少具有里程碑意义的坐标主要成分是那么的歧视待遇组。这些结果显示为散点图，其中以类似的口面形状的个体聚集在一起。它也执行判别函数分析，该统计比较两个治疗组之间的地标的位置是有用的。该分析显示在变换格，其中变化的地标位置被看作向量。网格叠加在这些载体中，使得整经图案被显示，以显示其中显著地标位置发生了变化。在判别函数分析的形状的变化是基于一个统计测量值，并因此可以通过一个p值来评价。这种分析既简单又方便，只需要一个立体镜和免费软件，因此将是一个有价值的研究和教学资源。
Introduction
其中最普遍的和破坏性的类型的人的出生缺陷是指那些影响嘴和面部，如口面裂1。与颜面部畸形患儿的结构进行多次手术整个生命周期，并与面部抽搐，言语，听力和吃饭问题挣扎。因此，促进新的研究中cranio-和口颌面发育是至关重要的，以防止这些类型的出生缺陷和治疗的人类。 非洲爪蟾已作为解剖理事颅面发展的机制的新工具（一些实例包括2,3,4- -11）。因此，定量的方法来分析发展的头这一物种的面部在大小和形状的变化可能是非常强大的3。
在这里，我们提出这样的方法;结合改编自非洲爪蟾的研究12的几何形态测量传统的三围尺寸13-15。此协议的目标是允许研究人员进行量化的面部大小和形状正常和异常发育过程中不同的表型口面之间进行区分。这个分析将允许细微颅面畸形如从基因和/或环境因素的协同作用所产生的那些之间的更好区分。此外，这种定量方法也可以揭示甚至略有改善的颜面部缺损或救援。因此，这使得它在分析潜在的治疗提供有益的指导。
我们在座的面部测量和几何形态测量的结合使得两者的大小及颜面部区域的形状比目前的方案有更全面的统计分析，这在很大程度上只使用一个或另一个15-18。此外，我们提出了一种简单的方式来评估两者的内侧和外侧的平面面对而不需要在当前的研究中13,19中使用先进的三维成像的设备。
我们证明该协议对非洲爪蟾用视黄酸受体抑制剂诱导颜面部畸形发展，中位数腭裂2,3处理的胚胎。口面区域，在这些胚的尺寸和形状的定量揭示变化的面中部是类似于人类具有类似腭裂和小鼠模型20,21。然而，该协议可以用于评估的其它化合物上颌面发育如天然物质，除草剂，或蛋白质，如生长因子的效应。另外，从通过丢失或功能实验增益基因表达的扰动引起的口面的尺寸和形状变化（使用反义吗啉代或保鲜盒/塔伦斯）也可以使用该协议进行定量。最后，我们开发了这个方法的specificaLLY评估爪蟾形态;然而，可以很容易地修改为任何脊椎动物的分析。其他应用还可能包括使用该协议的进化和生态学研究比较密切相关的物种。虽然我们在这里提供的例子中使用这个协议描述颜面部区域的分析，它可以很容易地进行修改，对其他地区，器官或结构的分析。
这口面量化协议将成为研究界的宝贵资源，以及一个优秀的教学工具，用于本科生的视频演示。
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Protocol
使用非洲爪蟾进行的所有实验已通过IACUC（协议＃AD20261）。
1.准备试剂及所需材料
- 试剂：
- 让1升的10倍MBS（修改巴特的盐）溶液22。添加氯化钠（880毫摩尔），氯化钾（10毫摩尔）， 硫酸镁 （10毫米），HEPES（50mM的，pH值7.8），和的NaHCO 3（25毫米）到1升的蒸馏水中。调节pH至7.8，用NaOH。
- 使1升1倍的MBS稀释百毫升900毫升的蒸馏水中10倍的MBS溶液。添加0.7毫升的1M的CaCl 2溶液。
- 使1升的0.1倍的MBS稀释100毫升于900ml的蒸馏水中1倍的MBS溶液。向1升的0.1倍的MBS溶液，在胚胎培养使用加入1毫升10毫克/毫升庆大霉素溶液。
- 通过在100毫升10×的MBS溶解4毫升的5M的NaCl使高盐的MBS。然后加蒸馏水至总体积为1 L.
- 让70％的乙醇稀释100％Ethanol到70％乙醇中，用蒸馏水。
- 使BMS-543通过制备10mM储备溶液在二甲基亚砜（DMSO）中。
- 使4％多聚甲醛（PFA）通过加入4g多聚甲醛粉末至50ml蒸馏水。热的热板约65℃，此时加5 M氢氧化钠滴至溶液澄清。
- 一旦溶液清除，离火，加入50毫升2X PBS和100微升吐温20。允许冷却至室温冰上。调节pH值用HCl中7.2和7.5。
- 通过溶解8克氯化钠，0.2克的KCl，1.44克Na- 2 HPO 4，及0.24g的KH 2 PO 4在800毫升蒸馏水使用吐温（PBT）的磷酸盐缓冲盐溶液。使用盐酸，调节pH值至7.4。加2 ml吐温20。调整用蒸馏水终体积等于1升
- 使通过将1g的半胱氨酸在50毫升蒸馏水或0.1×MBS的半胱氨酸溶液。加入1.5毫升5 M氢氧化钠一次将pH调节至7.8。
- 使10％的苯佐卡因原液加入10克苯佐卡因粉末至100毫升100％乙醇。对于成年男性和胚胎准备好固定的安乐死，稀释成0.05％的溶液。
- 使睾丸存储溶液加入1 ml小牛血清的9毫升L15缓冲液中。
- 所需工具和设备：
- 获得材料和设备的表中列出的设备， 如图1所示。
- 修改吸管工具。放置一个玻璃巴斯德吸管的尖端插入从本生灯火焰。旋转枪头，直到其熔化，形成了一个圆形的密封端。
- 扁平化模型粘土成的塑料培养皿的底部，平滑，以覆盖整个板（任何尺寸都可以使用）（ 图1Aiv）。
- 轻按直取笑针刺入粘土内衬盘以45°角。持针那里，缓慢移动的Petri菜水平，以创建一个郁闷线（ 图1Bi）。重复对行的期望数目。
- 使用玻璃吸管工具末端，使粘土衬盘的每一行中的浅的圆形凹部放置胚胎头（ 图1Bii）和助剂在组织的胚胎而拍摄。
- 对于摄影，补菜PBT（ 图1Biii）。使用之间，彻底清洗餐具和粘土表面用无菌水，接着用70％乙醇。
2. 非洲爪蟾胚胎培养和抑制剂治疗
- 在非洲爪蟾卵体外受精培养：
- 获得文化非洲爪蟾使用已发布的标准方法22,23胚胎。
- 简要地说，在一个0.05％苯佐卡因溶液通过浸没安乐死成年男性。解剖睾丸并存储在睾丸的存储缓冲区。注成年女性，人绒毛膜促性腺激素（HCG），收集在高盐的MBS蛋和受精在体外用解剖睾丸（ 图2A，B）。
- 在0.1倍的MBS在15℃下培养胚，直至所需阶段（根据非洲爪蟾的由新科普和法伯24,25的普通表期胚胎）到达。
- 在这里，培养的胚胎直到阶段22（24小时后的受精（高倍视野）），并在使用两对锋利的钳子的立体显微镜除去卵黄膜。移植胚与标准，一次性移液到含有30-40毫升0.1×MBS的干净的培养皿（直径为100mm）。
- 爪蟾胚胎的抑制剂处理（ 图2中示出）：
- 填写一个24孔培养皿1毫升0.1倍MBS的使用校准移液管人必要的井。用细点大关划定井外器（ 图2D，插图）。使用该标记来也标注的内容被添加到每个孔中的24孔培养皿的盖子。在实验室的笔记本电脑将这些信息复制到一个24孔的设置页面。
- 传送5-10胚胎成每使用一个标准的，一次性移液管（ 图2C）良好。放置在每个胚胎的数量相同井。
- 补足或取出的0.1倍的MBS，以便它是与1ml的标记线（ 图2D）的水平。添加DMSO中的适当体积（以使DMSO的终体积为1％），并轻轻摇动。要小心，不要添加DMSO太近胚胎，并避免胚胎与缓冲的表面相接触。
- 添加化学品的适当体积的指定孔中，轻轻地再摇动。这里，加入1微升的10mM的BMS-453（视黄酸受体拮抗剂）和图9微升DMSO中至1ml 0.1倍的MBS。
- 如果化学品是光敏感的，松散包装的小路TURE盘中铝箔。培养的胚胎在15℃培养箱中，直到所希望的阶段。在本实施例中，治疗的胚胎为16-18小时。
- 洗出的胚胎治疗和饲养，直到蝌蚪阶段：
- 除去二分之一至四分之三用一次性移液管将溶液。要小心，不要打扰胚胎。使用新的移液管，填充井与0.1X MBS。重复此3-6次。
- 转移胚胎到装有100毫升的0.1倍的MBS用庆大霉素（1毫升/升）的大陪替氏培养皿（直径150mm）。孵化的胚胎在15℃，直到它们到达阶段42-45（82-100高倍视野）。
- 每天都在变化的0.1倍MBS含庆大霉素溶液中，并去除死胚迅速，以防止污染其他胚胎或死亡。记录在实验室笔记本死胚的数量。
- 在多聚甲醛固定胚胎（PFA）：
- 修正阶段42和45（82和100之间的胚胎高倍视野，分别）通过将它们转移到含有1-2毫升0.1×MBS的一个新的24孔培养皿中。标签盖用作为治疗建立上述相同的信息（第2.2.1节）。
- 从每口井尽可能删除尽可能多的0.1倍MBS，同时还留下涵盖胚胎，并确保最小的接触，以防止受伤。加入1-2毫升0.05％苯唑卡因溶液，0.1倍MBS和孵育，直到胚胎不再响应的刺激。
- 加1-2毫升4％PFA的。或者，将胚胎在标有微量离心管的固定，如果愿意的话。
- 孵化的胚胎在PFA中24小时，在4℃下在旋转摇床上。通过在3-5小时内进行3-4次洗涤与PBT删除PFA。
3.拍摄非洲爪蟾蝌蚪的口面区
- 预拍摄准备（这被示于图3）：
- 放置在一个大的培养皿中固定的胚胎（150毫米直径）含有约100ml的PBT。
- 使两个切口从身体（ 图3A的实黑线）切断的头部。首先，将与一对钳子的胚胎，并在肠道内的后部侧的切口，用无菌解剖刀（ 图3B）。做对肠道，心脏附近的前侧的第二切口，彻底清除头部（ 图3C）。
- 移液管被切断胚头到使用标准的，一次性移液管粘土内衬盘（1.2.2部分）。
- 对于正面的看法，使用两对钳胚胎头后侧向下凹陷的圆形内侧的位置。使用镊子操纵两个胚胎头部及周边粘土，使得它们面对摄像机和不向后或向两侧（ 图3D）倾斜位置的胚胎。轻推头部周围使用镊子和/或玻璃周围的泥土吸管工具以固定头就位。
- 横向视图，使用镊子来定位的圆形凹内胚头，这样他们就在自己身边，对着同一个方向，并且是平贴在粘土。操纵胚胎头部及周边粘土，使所有的胚胎的水泥腺体都以相同的角度（ 图3E）向下放置。使用绘制的戏弄针为指导，以确保准确性取侧卧测量时的行。
- 捕捉蝌蚪头部的图像：
- 拍摄使用任何解剖显微镜与一个附加的数码相机和相应的摄像头软件，蝌蚪的头。使用也可以保持恒定的所有胚胎的最高放大倍数。
- 居中的胚胎和面对它们都在相同的方向。采集使用最佳的照明条件，使该口面部区域的最准确的图像的图像。位置灯，以避免过多的阴影。图像保存为.TIFF与尽可能高的分辨率的文件。
4.测量和分析面部大小尺寸在非洲爪蟾蝌蚪
- 测量口面部尺寸（总结于图4）：
- 确定脸部宽度。确定在每个眼睛的腹侧部分符合面部（ 图4A中，箭头）的周围的各点，并测量这些点（ 图4A中 ，红色线）之间的距离。
- 确定的面部的高度。首先，通过测量每一只眼睛之间的距离，并计算半路标记确定的中线。接下来，绘制标注眼睛的背最边缘和最背点的水泥腺（ 图4B，白线）的水平线。在中线，测量水平线（ 图4B中 ，红色线）之间的距离。
- 决定T他颜面部地区。使用相同的水平线标记眼睛和水泥腺引导面积测量的背缘（ 图4C中 ，白线）。开始在水平标线水泥压盖的上满足面（ 图4CA）的左侧的周围的点。
- 沿面包围的眼，直到其中的水平线标记眼睛的顶端满足面（ 图4CB）的周围的点的边缘跟踪。继续沿此背最水平线跟踪，直到它遇见右侧面（ 图4CC）的周边的点。
- 迹向下沿面包围的眼，直到其中的腹侧最水平线标记水泥腺的顶部满足右侧面（ 图4CD）的周边的点的边缘。继续沿着这条底部水平线UNT追踪金正日满足的地方开始跟踪点。使用照片编辑软件来计算跟踪内的区域。
- 确定吻长。上侧的图像，使该标记的眼睛的前一个垂直线。接着，测量从前面的最点所在的面满足水泥腺垂直线标记的眼（ 图4D）的前部的背侧边缘的水平距离。
- 确定嘴巴的宽度。测量左和右的点之间的水平距离，其中所述张口相遇（ 图4E）的顶部和底部的“嘴”。这可以被认为是青蛙相当于唇合缝的。
- 确定嘴圆。计算圆口作为一个逆纵横比，其中（4 × [区域]）/（π × [长轴] 2 >）。
- 用套索工具在照片编辑器来跟踪嘴开口的边缘， 如图4F。选择主工具栏中的分析，并选择测量。可替换地，从区域和嘴开口的直径的测量计算圆度。
- 面部尺寸的数据分析：
- 输入的面部尺寸的测量值成一个数据分析程序，以治疗组与对照进行比较。确定每个测量两个实验组和对照组，以创建柱状图的平均值。确定以创建误差棒的标准偏差。进行Student的t检验进行统计比较组。
注：此数据可以说是相当的变量，由于胚胎中略有不同速率的发展。
- 输入的面部尺寸的测量值成一个数据分析程序，以治疗组与对照进行比较。确定每个测量两个实验组和对照组，以创建柱状图的平均值。确定以创建误差棒的标准偏差。进行Student的t检验进行统计比较组。
口面形状和形态测量5.定量分析
- 广场的地标和CREA德的地标坐标文件（ 图5A所示）。
- 选择的地标，使得它们捕获目标图像的形状，并可以反复放置在相同的相对位置在所有样品中被分析。如果结构没有在所有样品中存在，不会对这种结构的一个里程碑。
- 这里，将24地标来表示与识别标志，如眼睛，鼻孔和嘴的面中部。为了保持一致性，地方以前放置的标志（例如，口标志性建筑，图5AI）之间的中间标志性建筑。
- 捕捉具有里程碑意义的坐标，打造“具有里程碑意义的坐标文件”。打开一个蝌蚪面（例如，第一控制胚胎）的所述第一图像。
- 选择主工具栏上的插件选项卡，然后从下拉菜单中选择Pointpicker。选择所需的位置加分标签和地点地标建筑地标将显示为彩色的十字架（
- 通过选择移动工具，十字移动位置后的标志性地点。当所有地标都被放置在图像上，选择主工具栏上的显示结果选项卡，然后选择Show（ 图5Aii），以显示具有里程碑意义的坐标，并复制到电子表格程序（ 图5Aiii）。
- 当粘贴从这个第一胎到电子表格程序，这些坐标，离开上述数据的空行。在这个空行（第1行），键入“LM =”与样品中的标志性建筑多项B列。在这里，输入“LM = 24”，因为24标志被创建（ 图5Aiii，红色框）。
- 在下面的数据点，类型的行的“ID =”同一个名称识别所述样品。在这里，在图5Aiii，输入“ID = CON1”，因为这是具有里程碑意义的坐标，第一控制胚胎（ 图5Aiii，红色箭头）的数据。
- 整个第二列和第三列复制到一个文本文档，并保存为.txt文件。
- 选择主工具栏上的插件选项卡，然后从下拉菜单中选择Pointpicker。选择所需的位置加分标签和地点地标建筑地标将显示为彩色的十字架（
- 选择的地标，使得它们捕获目标图像的形状，并可以反复放置在相同的相对位置在所有样品中被分析。如果结构没有在所有样品中存在，不会对这种结构的一个里程碑。
- 设置用于数据分析的形态的软件程序（在图5B中示出）。
- 在这里，选择在形态软件程序的主菜单上创建新的数据集。将该文件命名，并在相应的框中设置的数据（例如，“维甲酸抑制”和“面部标志性建筑”，分别），在弹出的界面（ 图5Bi）。导入文件作为TPS，和SELECT坐标以创建数据集（ 图5Bi，红色箭头）的文本文件。
- 数据对齐和普鲁克适合：
- 执行普鲁克配合和调整。突出显示在工程树选项卡中设置的数据，主工具栏上选择预赛和新飞度的Procrustes在下拉菜单中。
- 选择对齐由主轴，并选择执行普鲁克适合在对话框（ 图5Bii，红色箭头）的底部。返回预赛下拉菜单中，选择生成协方差矩阵（ 图5Biii），然后选择执行。
- 查看该协方差矩阵的相关性，在结果选项卡。
- 创建一个“分类文件”通过分配中设置为相应的分类变量的数据中的每个样品，以区分它是否属于在实验组或对照组。
- 标签在电子表格中两列。标记第一柱上进行的标题n，其中“ID”和输入相同的ID的每个样品给出（例如，CON1，RARINHIB1，等等; 图5Biv）。标记为“治疗”和输入的第二列的标题为每个小区对应于在相邻的ID细胞中列出的样品的治疗组。
- 在这里，用“控制和RAR抑制剂”标签的分类（图5Biv）。复制到一个文本文件并将其保存为.txt文件。进口分类变量进入形态的软件程序。选择匹配标识符，并打开文本文件（ 图5BV）。
- 创建一个主成分分析（PCA）的散点图通过选择变异下拉菜单中，选择主成分分析（ 图6AI）。接下来，选择图形选项卡可以看到另外三个选项卡：PC形态的变化，特征值，和PC的分数（ 图6Aii）。电脑评分卡显示Bivariate的普鲁克适合具有里程碑意义的数据（ 图6Aii）的主成分散点图。
- 要更改主成分绘制，带来了在剧情空间的弹出菜单，然后选择所需的轴来改变（ 图6Aiii，红色箭头）。
- 选择颜色数据点的工具（ 图6Aiii）。选择分类以前进口的（ 第5.2.2节 ）中出现，以确定每个类别（ 图6Aiv）的颜色在第二个弹出式菜单。
- 查看方差在结果选项卡（ 图6AV）各主成分的捕获量。导出图像为.bmp文件。
- 通过比较选项卡（ 图6Bi）下选择判别分析建立在形态学软件程序判别函数分析（DFA）改造电网。在弹出的菜单中，确保适当的数据集是SELected和数据的类型是普鲁克配合坐标。
- 突出显示要比较组的配对，并运行1000排列测试（ 图6Bii）。
- 在图形，查看形状差异选项卡（ 图6Biii）坐标的矢量地图。如果图像被反转时，调出弹出菜单中的情节空间翻转图中的正确方向（ 图6Biii）。
- 矢量的方向反射从所述第一组中的形状差异相比于第二，它是在运行分析（ 图6Bii）之前显示在判别功能菜单。到反向矢量的方向，调出在剧情空间的弹出菜单和改变比例因子的符号，以便它是负的（ 图6Biii，ⅳ）。比例值的值被设置为10的一个因数最能代表betwee界标位置的统计差异n中的两组不变形，并且通常保持默认（ 图6Biv）。
- 另外，在弹出菜单，图形改变为变换网格叠加在载体上的网格（ 图6Biii，v）中 。
- 指定的格子中的弹出式菜单中的水平和垂直线的数目（ 图6Biii，v）中 。
- 图表导出为.bmp文件。
- 查看结果选项卡（ 图6Bvi）下的Procrustes和Mahalinobis距离和p值。
- 附加的形态分析，这对于一个以上的治疗组的评估非常有用
- 创建主成分分析变换网格。在PC形态的变化选项卡显示的形状变化占方差每个样本组中的矢量地图。使用弹出菜单中的绘图区，以正确的定位和形象载体叠加到电网改造。设置比例因子上对应于对照组的估计中心的PC分值曲线图的x轴的值。图像导出为.bmp文件。
- 创建一个CVA散点图。在主工具栏上的比较选项卡中，选择规范变量分析，突出分类变量集以前进口的（参见第5.2.3节 ）。选择1000迭代置换试验，并选择执行。选择CV得分选项卡以查看二元CVA散点图。此基础上，上载的分类器的颜色编码。改变通过打开弹出式菜单中的情节空间的配色方案（参见5.3.3节 ）。导出为.bmp文件。
- 创建一个CVA改造电网。比较两组以上时，可生成的CVA结果的变换格。在图形选项卡上，选择CV造型变化可视化的具有里程碑意义的坐标变换网格。调出弹出菜单中的情节空间改变该矢量的方向上，叠加的结果到一个转换的网格，并指定网格线的数量。图表导出为.bmp文件。
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Representative Results
此处，口面部的大小和形状的定量分析证明，比较与视黄酸受体抑制剂（RAR抑制剂），以未处理的对照处理的胚胎。胚胎均采用这种化学抑制剂的1微米的浓度从24级到30（26-35 HPF），冲了出去，并固定在42级（82 HPF）。然后将它们加工成在协议中所述进行分析。结果是原始数据，但在以前的出版物2,3观察结果一致。控制胚胎与车辆，DMSO处理的，和正常发育（ 图7AI，ⅱ）。与RAR抑制剂1微米集中处理的胚胎表现出面部，眼部异常略有缩小，并且畸形胚胎的嘴打开，这是更多的三角形（ 图7Aiii，四 ）。
首先，传统的口面部尺寸进行测量，并总结于图7B。 S tatistical意义通过进行Student的t检验，假设抑制剂处理的胚胎和对照每个测量之间不等方差来确定。我们发现，这两个吻长和脸宽的RAR抑制剂治疗的胚胎显著低于对照组（P值= 0.0062和0.0058，分别为; 图7Bi，二 ）。而面对身高和嘴圆度显著增加（p值= 3.7772×10 -6，1.4812×10 -7），口宽度显著降低（p值= 2.5175×10 -10; 图7Biii-V）。该结果显示，两组之间的整体颜面部区域没有显著差异（p值= 0.3754; 图7Bvi）。这些数据显示了视黄酸信令损失在特定的时间在开发成果较短的口鼻部中，所述面中部区域的轻微变窄，和畸形的胚胎张口。
核苷酸“>要提供的胚胎口面部区域的形状改变一个复杂的视图响应于减小的视黄酸的信号，接下来我们利用几何形态测量分析。识别和使用图像分析软件校准口面的地标后，我们接着检查中的每个的方差通过主成分分析（PCA）的基团。当第2主成分作图彼此，RAR抑制剂处理的胚胎是来自沿PC1的轴线（ 图7C）对照明确区分开。本试验还表明，在试样设定的异常值由2抑制剂处理的胚胎未与组（ 图7C中 ，箭头）的其余簇所示。接着，在RAR的抑制剂处理的胚胎和对照之间的口面部区域的形状的统计差异进行了评估，并通过执行一个判别函数分析（DFA）的可视化。该普鲁克距离between两组比较显著不同（距离= 0.2665，p值<0.0001， 图7D），这表明在口面部形状的改变时，视黄酸信令被打乱。的确，在在口面部区域侧向地标位置戏剧性的变化表明在抑制剂处理的胚胎（ 图7D）的面形状对应的高度变窄。此外，轻微的向外偏移的鼻的地标（ 图7D中，箭头）的位置显示异常的鼻孔的位置在这些胚胎，它与炉鼻的下降生长相一致。地标中定义的，反映的三角形张口就形成了张口显示位置发生变化的边缘转变为与正中裂报道在我们以往的研究2,3一致。除了矢量位移，转换网格的翘曲图案还示出了形状的变化或ofacial地区。扭曲的面中部地区与面中部发育不全和整体面部缩小见于胚胎降低视黄酸信号（ 图7D）是一致的。
判别函数分析的结果（DFA）的显示，是与我们的定性分析相一致的形状的变化，以及可知不充分的由单独的传统大小的测量捕获的一些变化。例如，当口面面积不是对照之间显著不同和抑制剂处理的胚胎（ 图7Bvi），则DFA变换网格显示与面部变窄见于抑制剂处理的胚胎（ 图7A中的D）一致的急剧变化在此区域。此外，张口的翘曲模式和具有里程碑意义的变化，再加上我们在圆口看到了显著的变化，说明了嘴的抑制剂处理安莉芳开口形状的畸形OS。总之，面部尺寸和几何形态分析的传统的测量值的组合表示时，视黄酸信号被扰乱了变化的形状和口面部区域的大小。
图1.必备材料。 （A）工具进行数据分析。 （ⅰ）24孔板上，（ⅱ）标准的一次性移液管，（ⅲ）杜蒙＃5 Inox公司镊子，（ⅳ）粘土衬里的培养皿中，（ⅴ）直挑逗针，（ⅵ）玻璃吸管工具，（ⅶ ）无菌，一次性手术刀。（B）制备粘土内衬菜。 ㈠直取笑针用于绘制在粘土水平线。 （ⅱ）在一玻璃吸管工具用于使圆形凹陷沿每一行。 （ⅲ）将皿填充的PBT用于成像。
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图2. 在非洲爪蟾卵体外受精和文化。 （A）以下的HCG注射，成年爪蟾的雌性诱导产卵。（B）将卵收集在高盐的MBS，受精睾丸从男性萃取，培养使用标准的方法。（C）的胚被转移到24孔培养皿含有用一个标准的一次性移液管的0.1倍的MBS。（D）中的已标定移液管人是用来测量1毫升到空井，和一个标记用于区分这一级上所有孔的外含胚胎（插图）。 0.1×MBS然后加入或带走，以便它是与该标记的水平。
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图3.制备胚胎头成像。去除头，实黑线所需的两个切口（A）图。比例尺= 400微米。（B）中的第一个切口是在肠道的后端以除去尾和释放压力的手术刀。比例尺=400μm的。（C）的第二切口是在肠道内，靠近心脏的前端，以完全切断的头部。比例尺= 400微米。（D）的定位在泥胚头排的正面看法。比例尺= 650微米。（E）的胚胎头排位置的侧向土的看法。比例尺= 500微米CG：水泥腺体。
图颜面部尺寸4.传统的三围尺寸。 （A） 面部宽度 。箭头表示眼睛的腹侧部中，满足该面的外围上的点。红线是面部宽度，测量这些点之间的距离。比例尺= 210微米。（B）的 面高度。白线是画在测量之前，在眼睛的背缘与水泥腺背侧边缘导向。红线是面高度，测量为在该面的中线这两个导向件之间的距离。比例尺= 210微米。（C）的 口面面积。白线是在测量之前绘制的指南。 （一）点，其中底部导向符合左眼的腹侧边缘。红色线显示了周围左眼的跟踪。 （二）点，其中眼睛的背侧边缘满足顶部导向。蓝线表示口面部区域的背侧边界，沿眼睛的背侧边缘的顶部导向跟踪。 （三）点，其中顶部导向符合正确的脸部周围。绿线显示周围右眼的跟踪。 （四）点，其中右眼的腹侧边缘满足底部导向。黄色的线示出口面部区域的腹侧边，沿着水泥腺的背缘底部导向跟踪。比例尺= 210微米。（D）的 吻长。白线是眼睛的前边缘和被绘制为在测量之前的指南。红线是吻长，从该行到那里的水泥腺背侧边缘符合脸部的横向周边上的点处测量。比例尺= 300微米。（E） 口的宽度，箭头是指向哪里的背部和腹部的嘴唇相遇。红线是嘴宽，测定这两个点之间的距离。比例尺=200μM的。（F）的 口的圆度 。口开口的周边被追踪，并以红色显示。 CG：水泥腺体。比例尺=200μM的。
图5.捕获的地标和预赛的几何形态分析。 （A）使用照片编辑软件和电子表格程序放置的地标和捕捉坐标。 （ⅰ）五彩杂交是放置使用ImageJ的添加点工具来表示口面部区域的形状图像上的地标。 （ⅱ）地标数据是通过使用显示结果工具显示。 （三）地标数据被复制并粘贴到电子表格中。上述第二列是一个首标识的地标数目和标示为“LM = 24”（红色框）。下面的数据的第二列中，样品被赋予一个唯一的名字并标示为“n = CON1”（红色箭头）。这被重复用于所有图像中的样本组的数据被保存为一个文本文件。（B）中的初步数据分析以几何形态软件安有计划。 （一）从照片编辑软件创建的文本文件导入到节目形态，MorphoJ，作为TPS文件。文件是由红色箭头表示。 （二）地标坐标数据被普鲁克配合一致通过主轴。红色箭头指示的执行对齐。 （三）在预赛菜单生成合适的Procrustes地标协方差矩阵。 （四）分类器文件在电子表格创建。列A和B中给出标题“ID”和“治疗”，分别。所述的ID提供给在地标数据集合中的每个样本被输入下塔A，且治疗组对每个样品属于被输入在列B（v）的分类器文件导入到形态学方案作为分类变量集合和匹配由标识符所选择的数据集。 请点击这里查看大图这个数字。
图中的形态软件6.统计分析。 （一）主成分分析（PCA）（一）PCA是从变异选项卡中选择。 （二）普鲁克地标前两个主成分显示为PC卡得分散点图。 （三）在弹出菜单中长大的情节空间。此菜单是用来改变其主要成分是暗算对方（红色箭头）和颜色的数据点（以蓝色突出显示）。 （ⅳ）中的数据点根据在所述弹出式菜单的分级变量着色。方差（V）的百分比由每个主成分抓获被视为在结果选项卡。（B）判别函数分析（DFA）（一）DFA从比较选项卡中选择。 （ⅱ）的Procrustes的数据集选择为DFA的坐标，并且以前上传的分类器被选择用于分组。所需的组进行比较被选择和排列测试运行。 （ⅲ）的DFA结果显示为一个矢量地图中的形状差异标签。在剧情空间的弹出菜单可以用来正确地定位图像。 （ⅳ）通过选择在弹出菜单中的设定比例因子标签，标度因子的符号可以改变。 （ⅴ）的矢量地图通过选择改变图表的类型中的矢量地图的弹出式菜单改变成变换网格的网格线的期望数目。 （六）马氏和普鲁克距离和相应的p值均在结果选项卡下查看， 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
非洲爪蟾已成为解剖的发展机制基本颜面部开发的有用工具;然而，目前没有协议描述该区域的青蛙大小和形状的变化。此处描述的方法将通过允许在非洲爪蟾和其他脊椎动物口面部表型的更严格的量化显著向口面发展领域。
正确地执行该协议的第一，最关键的方面是既准确和可重复地测量人脸的尺寸和确定界标放置的能力。为此，这是至关重要的胚胎面以相同的角度，方向和倍率进行拍照。特别是，必须注意，以获得鼻子长度的精确测量的，因为它是难以横向操纵胚胎和实现一致的位置。有一个人完成的一切都测量AME一天最大限度地减少这种类型的错误，同时最大限度地提高了结果的可重复性。在保证良好的效果第二个最关键的环节是不必要的变异，如发育差异或遗传背景的减少。评估细微缺陷之间的统计显着性时，这是特别重要的。胚胎，因此，必须在相同的阶段治疗与拍摄时。此外，应注意保证发育率之间和各治疗组相同。为了降低这样的问题，可变性，以确保所有的胚胎是来自同一个父母，并且阶段匹配在实验的开始。也减少可变性的外部来源，例如在培养皿中不同的缓冲源和体积，不同数目的胚胎，和分布（例如，避免拥挤）。
在经过几何形态测量形状变化评估的一个关键步骤是alignmen地标吨，通过普鲁克配合协调。通过应用这种数学算法的，大约尺寸或在图像的旋转差异的任何信息被删除。随后产生的协方差矩阵来确定非标准化相关的所有可进行胚胎中的数据集，在其上多变量统计techniques-如主成分或判别函数analyses-中的地标坐标。
主成分分析（PCA）降低复杂样品的一组变量，称 为主分量26小。第一组分占所述样品组内最方差，每个随后的成分占其余部分。通过绘制前两个部件相互利用形态软件，样品是最相似的集群在一起。以这种方式，主成分判别组样品组内，同时确定在他们之内的变化。在SOMê情况下，基团可以不被彼此清楚地区分和沿任一或两个轴重叠。在这种情况下，有利的是，以揭示细微特征通过这些基团被鉴别绘制其他组件（例如，PC3）。这是特别相关的，当总变化更均匀地分布在第一几个变量之一。
的普鲁克拟合数据的判别函数分析（DFA）的确定在一组数据样本由定义它们的连续变量有效判别成组。因此，样品被分为分析前组和变量被转换成组件称为判别函数，以确定该组27之间的统计关系。前运行的这一分析，以指示的置换试验数是很重要的。这些置换随机测试数据，使得有关它的分布做任何假设都是elimina特德。更置换检验的迭代增加的p值的准确性。当可视化为变换网格，在组与组之间的地标位置显著变化被比较的显示方式。此外，网格的翘曲图案揭示其中发生形状的变化。这一分析的缺点是，它只能被用于两个组的比较。如果有三个或更多的组中的一组样本进行比较，这是更好地执行一个典型变量分析。这类似于一个DFA中，它产生一个统计的p值;然而，它示出了发生在除了那些组内的各组之间存在设置整个样本的变化。
这口颌面量化协议的主要限制是它只能应用于二维数据。我们未来的目标包括利用CT扫描或共聚焦显微镜来开发类似的方法对三维数据的分析。另一方面，与二维图像的工作也是这个协议的主要优势之一。需要用于捕获胚胎脸部的图像配有摄像头只有基本stereoscopes。用于此数据分析的OpenWare也增加了该方法的可访问性，同时降低了成本。此外，不需要强辞夺理成像，统计分析，或计算机编程的一种先进的知识，以从数据中提取有意义的和显著效果。事实上，这种技术目前正在讲授的本科生课程实验生物学的VCU部门的一部分。因此，这里提出的口面部量化协议是简单易学并应用在很短的时间周期。作为一个视频表示，关键步骤，如胚胎定位和导航软件被高亮显示，以保证能够通过即使未经训练的学生和研究人员成功地利用该协议。总之，本协议将提供一种有价值的资源为研究界和作为教学工具。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
启动资金来自VCU A·迪金森支持这项工作。
作者要感谢丹Nacu为他的艺术天分在创建示意图。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | Zeiss | fitted with AxioCamICC1 camera | |
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Sterile, disposable scalpel | Sklar | 06-2015 | |
| 24-well plate | Fisher Scientific | 087721 | |
| Standard Disposable transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 150 mm x 15 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| Incubators | Ectotherm | set to 15 °C or 20 °C | |
| Modeling Clay | Premo, or other non-toxic modeling clay | in black or white | |
| Straight teasing needle | Thermo Scientific | 19010 | |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each |
| Needle Puller, Model P-97 | Sutter Instrument Co. | Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B | For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Pipettemen | Gilson | F144802, F123600, F123602 | |
| BMS-453 | Tocris | 3409 | |
| DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dishes | Falcom | 353003, 351058 | 100 mm diameter and 150 mm in diameter |
| 100% Ethanol | VWR | 89125-170 |
References
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