Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kwantificering van Orofacial Phenotypes in Published: November 6, 2014 doi: 10.3791/52062
Automatic Translation
1, 1
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

Summary

Werkwijze voor het orofaciale grootte en vorm van Xenopus laevis embryo kwantificeren ontwikkeld. In dit protocol worden metingen traditionele formaat gecombineerd met geometrische morfometrie te zorgen voor meer geavanceerde analyses van orofaciale ontwikkeling en defecten.

Abstract

Xenopus is uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor het ontleden van de mechanismen die craniofaciale ontwikkeling en defecten. Een methode om orofacial ontwikkeling te kwantificeren zal zorgen voor meer grondige analyse van orofaciale fenotypes bij intrekking met stoffen die genetisch of moleculair kunnen manipuleren genexpressie of eiwit functie. Met tweedimensionale afbeeldingen van de embryonale koppen worden traditionele size-afmetingen zoals orofaciale breedte, hoogte en gebied- gemeten. Daarnaast wordt een ronding maat voor de embryonale mondopening gebruikt om de vorm van de mond beschreven. Geometrische morfometrie van deze tweedimensionale beelden wordt ook uitgevoerd om een ​​meer verfijnde weergave van veranderingen in de vorm van de orofaciale regio. Plaatsen zijn toegewezen aan specifieke punten in het orofaciale gebied en coördinaten worden gecreëerd. Een principle component analyse wordt gebruikt om de mijlpaal coördinaten principe componenten die vervolgens discrimineren de behandeling te verminderengroepen. Deze resultaten worden weergegeven als een scatterplot waarin individuen met gelijkaardige orofacial vormen samen te clusteren. Het is ook nuttig om een ​​discriminantfunctieanalyse die statistisch vergelijkt de posities van de herkenningspunten tussen twee behandelingsgroepen voeren. Deze analyse wordt op een transformatie rooster waar positieveranderingen landmark worden beschouwd als vectoren. Een raster wordt over deze vectoren zodat een kromtrekken patroon wordt weergegeven om aan te geven waar de belangrijke posities mijlpaal zijn veranderd. Vormveranderingen in de discriminantfunctieanalyse zijn gebaseerd op een statistische maat, en derhalve kan worden geëvalueerd door een p-waarde. Deze analyse is eenvoudig en toegankelijk is, is er slechts een stereoscoop en freeware software, en zal dus een waardevol onderzoek en onderwijs resource zijn.

Introduction

Een van de meest voorkomende en verwoestende types van menselijke aangeboren afwijkingen zijn degenen die de mond en het gezicht, zoals orofaciale schisis 1. Kinderen met misvormde orofaciale structuren ondergaan meerdere operaties gedurende hun leven en worstelen met het gezicht misvormingen, spraak, gehoor en eetproblemen. Daarom is het faciliteren van nieuw onderzoek in cranio- en orofaciale ontwikkeling is van cruciaal belang voor de preventie en behandeling van deze vormen van aangeboren afwijkingen bij de mens. Xenopus laevis heeft ontpopt als een nieuw instrument voor het ontleden van de mechanismen die craniofaciale ontwikkeling (enkele voorbeelden zijn 2,3,4 -11). Daarom kan een kwantitatieve methode om de grootte en vorm verandert analyseren tijdens de ontwikkeling van het hoofd en gezicht van deze soort zeer krachtig 3.

Hier presenteren we een dergelijke werkwijze; een combinatie van traditionele grootte metingen met geometrische morfometrie aangepast van een Xenopus studie 12 13-15. Het doel van dit protocol is om onderzoekers aan het gezicht grootte en vormen te kwantificeren om onderscheid te maken tussen verschillende orofacial fenotypes tijdens normale en abnormale ontwikkeling. Deze analyse maakt het mogelijk voor een betere differentiatie tussen subtiele craniofaciale defecten, zoals die welke voortvloeien uit synergetische effecten van genen en / of omgevingsfactoren. Daarnaast kan dit kwantificeringsmethode ook zelfs lichte verbetering of redden van een orofacial defect onthullen. Dit maakt het een handige gids bij het analyseren van potentiële therapieën dan ook.

De combinatie gezichts metingen en geometrische morfometrie dat wij hier presenteren maakt een bredere statistische analyse van zowel de grootte en vorm van het orofaciale gebied dan de huidige protocollen die grotendeels gebruik slechts één of de ander 15-18. Verder presenteren we een eenvoudige manier om zowel de mediale en laterale gebieden van beoordelenhet gezicht zonder dat geavanceerde driedimensionale beeldvormende apparatuur die wordt gebruikt in de huidige studies 13,19.

We tonen dit protocol op Xenopus laevis embryo's die behandeld worden met een retinolzuurreceptor remmer dat abnormale orofacial ontwikkeling en een mediaan gespleten gehemelte 2,3 induceert. Kwantificering van de afmetingen en vorm van het orofaciale gebied in deze embryo heeft wijzigingen in de midface die analoog aan mensen met gelijke palatinale kloven en muismodellen 20,21 geopenbaard. Echter, dit protocol worden gebruikt om de effecten van andere verbindingen op orofaciale ontwikkeling zoals natuurlijke stoffen, herbiciden of eiwitten zoals groeifactoren beoordelen. Verder, orofaciale grootte en vorm verandert als gevolg van verstoring van de genexpressie via verlies of overexpressie-experimenten (met behulp van antisense morpholinos of Crispers / Talens) kan ook worden gekwantificeerd met behulp van dit protocol. Tenslotte, deze methode specificatie ontwikkelden welly om Xenopus morfologie beoordelen; echter gemakkelijk aangepast voor analyse van alle gewervelde. Andere toepassingen kunnen ook met behulp van dit protocol voor het vergelijken van nauw verwante soorten voor evolutionaire of ecologische studies. Terwijl het voorbeeld dat we hier bieden maakt gebruik van dit protocol om de analyse van het orofaciale gebied te beschrijven, kan het gemakkelijk worden aangepast voor de analyse van andere regio's, organen, of structuren.

Dit orofaciale kwantificering protocol zal een waardevolle bron voor de onderzoeksgemeenschap, evenals een uitstekend leermiddel voor studenten als een video-demonstratie geworden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten uitgevoerd met behulp van Xenopus laevis werden goedgekeurd door IACUC (protocol # AD20261).

1. Voorbereiding Reagentia en benodigde materialen

  1. Reagentia:
    1. Maak 1 L van 10x MBS (Gewijzigd Barth's Saline) oplossing 22. Voeg NaCl (880 mM), KCl (10 mM), MgSO 4 (10 mM), HEPES (50 mM, pH 7.8) en NaHCO3 (25 mM) tot 1 liter gedestilleerd water. Stel de pH tot 7,8 met NaOH.
    2. Voeg 1 l 1x MBS door verdunning 100 ml 10x MBS-oplossing in 900 ml gedestilleerd water. Voeg 0,7 ml van 1 M CaCl2-oplossing.
    3. Maak 1 L van 0,1 x MBS door verdunning van 100 ml 1 x MBS-oplossing in 900 ml gedestilleerd water. Tot 1 L van 0,1x MBS oplossing, voeg 1 ml van 10 mg / ml gentamicine oplossing voor gebruik in embryo cultuur.
    4. Voeg hoog zoutgehalte MBS door oplossen 4 ml van 5 M NaCl in 100 ml van 10x MBS. Voeg vervolgens gedestilleerd water totdat het totale volume is 1 L.
    5. Voeg 70% ethanol door verdunning 100% ethanol tot 70% ethanol met gedistilleerd water.
    6. Maak BMS-543 door het opstellen van een 10 mM voorraad oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO).
    7. Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) door toevoeging van 4 g paraformaldehyde poeder aan 50 ml gedestilleerd water. Verwarm op een hete plaat bij ongeveer 65 ° C, waarna voeg 5 M NaOH druppelsgewijs tot oplossing verdwijnt.
      1. Zodra de oplossing wist, haal van het vuur en voeg 50 ml 2x PBS en 100 ul Tween-20. Laat afkoelen tot kamertemperatuur op ijs. Stel de pH tussen 7,2 en 7,5 met behulp van HCl.
    8. Voeg een fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween (PBT) door het oplossen van 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4 in 800 ml gedestilleerd water. Met behulp van HCl, breng de pH op 7,4. Voeg 2 ml Tween-20. Pas uiteindelijke volume met gedestilleerd water op gelijke 1 L.
    9. Maak een cysteïne-oplossing door het oplossen van 1 g van cysteïne in 50 ml gedestilleerd water of 0.1x MBS. Voeg 1,5 ml van 5 M NaOH eennd breng de pH op 7,8.
    10. Maak een 10% benzocaïne voorraad oplossing door het toevoegen van 10 g Benzocaine poeder tot 100 ml 100% EtOH. Voor euthanasie van de volwassen mannen en embryo's klaar voor fixatie, te verdunnen tot een 0,05% oplossing.
    11. Wordt testes opslagoplossing door toevoeging van 1 ml kalfsserum 9 ml buffer L15.
  2. Juiste gereedschappen en apparatuur:
    1. Het verkrijgen van de in de tabel van materialen en apparatuur vermeld apparatuur, weergegeven in figuur 1.
    2. Wijzigen van een pipet tool. Plaats de punt van een glazen Pasteur pipet in een vlam van een Bunsen brander. Draai de pipet tip tot het smelt en vormt een afgerond verzegelde einde.
    3. Plat boetseerklei in de bodem van een plastic petrischaal, gladstrijken van de gehele plaat bestrijken (elke grootte kan worden gebruikt) (Figuur 1Aiv).
      1. Druk lichtjes op een straight teasing naald in de klei beklede schaal op een hoek van 45 °. Houd de naald daar, en langzaam de Petrischotel horizontaal naar een depressieve lijn (figuur 1Bi) te creëren. Herhaal dit voor het gewenste aantal rijen.
      2. Gebruik een glazen pipet tool ondiepe, cirkelvormige indrukkingen maken in elke rij van de klei beklede gerecht embryo koppen (figuur 1Bii) en steun plaatst de organisatie van de embryo tijdens het fotograferen.
      3. Voor fotografie, vul schotel met PBT (Figuur 1Biii). Tussen toepassingen, grondig de schotel en klei oppervlak met steriel water, gevolgd door 70% ethanol.

2. Xenopus laevis Embryo Cultuur en Inhibitor Behandelingen

  1. In vitro fertilisatie en de cultuur van Xenopus eieren:
    1. Verkrijgen en cultuur Xenopus laevis embryo's met behulp van standaard gepubliceerde methoden 22,23.
    2. Kortom, euthanaseren een volwassen mannetje door onderdompeling in een 0,05% benzocaïne oplossing. Ontleden testes en winkel in testes opslag buffer. Injecterenvolwassen vrouwtjes met humaan choriongonadotrofine (HCG), het verzamelen van eieren in een hoge zout MBS, en bemesten in vitro met ontleed testes (Figuur 2A, B).
    3. Cultuur embryo in 0,1x MBS bij 15 ° C totdat de gewenste graad is bereikt (embryo's volgens de normale tabel van Xenopus laevis bij Nieuwkoop en Faber 24,25).
      1. Hier, cultuur embryo tot stadium 22 (24 uur na de bevruchting (HPF)), en verwijder de vitellinemembraan onder een stereomicroscoop gebruik van twee paar geslepen pincet. Transfer embryo met een standaard, wegwerp pipet een schone petrischaal (100 mm in diameter) met 30-40 ml 0,1x MBS.
  2. Remmer behandeling van Xenopus embryo's (in figuur 2):
    1. Vul de nodige putjes van een 24-well kweekplaat met 1 ml 0,1 x MBS met behulp van een gekalibreerde pipet-man. Bakenen de buitenkant van de put met een fijne punt te markerenER (figuur 2D, inzet). Gebruik de marker ook label de inhoud aan elk putje toegevoegd worden de 24-well kweekplaat deksel. Kopieer deze informatie op een 24-goed set-up pagina in het labjournaal.
    2. Transfer 5-10 embryo's in elk putje met een standaard, wegwerp transferpipet (figuur 2C). Plaats hetzelfde aantal embryo in elk putje.
    3. Bijvullen of verwijderen van de 0.1x MBS, zodat het niveau met de 1 ml gemarkeerde lijn (figuur 2D). Voeg de juiste hoeveelheid DMSO (zodat het uiteindelijke volume van DMSO is 1%) en voorzichtig zwenken. Wees voorzichtig niet te DMSO te dicht bij de embryo's toe te voegen, en de contactgegevens van de embryo's met het oppervlak van de buffer te voorkomen.
    4. Voeg de juiste hoeveelheid van de chemische stof aan de aangegeven putjes en voorzichtig weer te wervelen. Hier, voeg 1 ui 10 mM BMS-453 (een retinoïnezuur receptor antagonist) en 9 pl DMSO tot 1 ml 0,1x MBS.
    5. Als de chemische is lichtgevoelig, losjes wikkel de cultuur gerecht in aluminiumfolie. Cultuur embryo in een 15 ° C incubator tot het gewenste stadium. In dit voorbeeld behandelen embryo gedurende 16-18 uur.
  3. Het wassen van embryo's uit de behandeling en het opfokken tot kikkervisje fasen:
    1. Verwijder de helft tot driekwart van de oplossing met een disposable pipet overdracht. Wees voorzichtig dat u de embryo verstoren. Met behulp van een nieuwe transfer pipet, vul het goed met 0.1x MBS. Herhaal dit 3-6 keer.
    2. Transfer embryo een grote petrischaal (diameter van 150 mm) die 100 ml 0,1 x MBS met gentamicine (1 ml / l). Incubeer de embryo's bij 15 ° C totdat ze fase te bereiken 42-45 (82-100 HPF).
    3. Wijzig de 0.1x MBS oplossing met gentamicine dagelijks, en het verwijderen van dode embryo's onmiddellijk om verontreiniging of de dood van andere embryo's te voorkomen. Noteer het aantal dode embryo's in het laboratorium notebook.
  4. Vaststelling van embryo's in paraformaldehyde (PFA):
    1. Fix embryo's tussen fasen 42 en 45 (82 en 100HPF, respectievelijk) door ze in een nieuwe 24-well cultuur schotel met 1-2 ml van 0,1x MBS. Label de deksel met dezelfde informatie als de behandeling set-up zoals hierboven beschreven (paragraaf 2.2.1).
    2. Verwijder zoveel 0.1x MBS uit elk goed mogelijk, maar tegelijk het embryo gedekt en het waarborgen van minimaal contact om letsel te voorkomen. Voeg 1-2 ml van 0,05% benzocaïne oplossing in 0,1 x MBS en incubeer tot embryo's niet meer reageren op stimuli.
    3. Voeg 1-2 ml van 4% PFA. Als alternatief plaatst embryo in geëtiketteerde microcentrifugebuisjes voor fixatie, indien gewenst.
    4. Incubeer embryo in PFA gedurende 24 uur bij 4 ° C op een roterende shaker. Verwijder PFA door het uitvoeren van 3-4 wasbeurten met PBT dan een 3-5 hr periode.

3. Het fotograferen van het orofaciale gebied van Xenopus Kikkervisjes

  1. Pre-fotografie preparaat (dit is geïllustreerd in figuur 3):
    1. Vastgezet embryo in een grote petrischaal (150mm in diameter) met ongeveer 100 ml van PBT.
    2. Maak twee insnijdingen aan de kop te scheiden van het lichaam (Figuur 3A, vaste zwarte lijnen). Houd eerst de embryo met een pincet en een insnijding aan de achterste zijde van de darm met een steriele scalpel (Figuur 3B). Maak een tweede incisie aan de anterieure zijde van de darm, in de buurt van het hart, om volledig te verwijderen van het hoofd (Figuur 3C).
    3. Pipette afgehakte hoofden embryo in een met klei beklede schaal (deel 1.2.2) met behulp van een standaard, wegwerp transferpipet.
      1. Voor frontale weergaven, gebruiken twee paar tang om embryo hoofden posterior zijde omlaag te positioneren binnen de cirkelvormige depressies. Met behulp van de tang om zowel het embryo hoofd en de omringende klei, positie embryo's zodanig dat ze worden geconfronteerd met de camera en zijn niet achterlijk of aan beide zijden (Figuur 3D) gekanteld manipuleren. Duw de omringende klei rond het hoofd met behulp van een tang en / of het glaspipet tool om het hoofd vast te zetten.
      2. Voor zijdelings uitzicht, een tang om embryo hoofden te positioneren binnen het cirkelvormige depressies zodanig dat zij aan hun kant, in dezelfde richting, en zijn plat tegen de klei. Manipuleren van de embryo kop en de omringende klei zodat het cement klieren van het embryo naar beneden staan ​​onder dezelfde hoek (figuur 3E). Gebruik het getekend met de plagen naald als een gids om nauwkeurigheid te verzekeren bij het nemen van laterale metingen rijen.
  2. Het vastleggen van beelden van het kikkervisje hoofd:
    1. Fotografeer het hoofd van het kikkervisje met behulp van een dissectie microscoop met een aangesloten digitale camera en de bijbehorende camera software. Gebruik de maximale vergroting die voor alle embryo constant kan worden gehouden.
    2. Centreren embryo en gezicht ze allemaal in dezelfde richting. Maak foto's met behulp van de beste lichtomstandigheden die het mogelijk maken voor de meest nauwkeurige beeld van het orofaciale gebied. Positielichten aan overmatige schaduwen te voorkomen. Beelden opslaan als .tiff-bestanden met de hoogst mogelijke resolutie.

4. Het meten en analyseren van Facial Grootte Afmetingen in Xenopus Kikkervisjes

  1. Meet orofaciale afmetingen (samengevat in figuur 4):
    1. Bepaal het gezicht breedte. De punten worden aangeduid waar de ventrale deel van elk oog voldoet aan de periferie van het gezicht (figuur 4A, pijlen), en meet de afstand tussen deze punten (figuur 4A, rode lijn).
    2. Bepaal het gezicht hoogte. Bepaal eerst de middellijn door de afstand tussen elk oog en de berekening halverwege. Vervolgens trekken horizontale lijnen die de dorsale meeste randen van de ogen en de dorsale punt van het cement klier (figuur 4B, witte lijnen) te markeren. Op de middellijn, de afstand tussen de horizontale lijnen (figuur 4B, rode lijn).
    3. Bepaal thij orofaciale gebied. Gebruik dezelfde horizontale belijning dorsale randen van de ogen en cement klier tot gebied meetgids (Figuur 4C, witte lijnen). Hervat op het punt waar de horizontale lijnmarkering bovenkant cement klier aan de omtrek van de linkerzijde van het vlak (figuur 4Ca).
      1. Trace langs de rand van het gezicht omvat het oog tot het punt waar de horizontale lijnmarkering de top van de ogen aan de omtrek van het vlak (figuur 4CB). Blijf sporen op deze dorsale meest horizontale lijn tot het punt waar het de omtrek van de rechterkant van het vlak (figuur 4 cc).
      2. Trace omlaag langs de rand van het gezicht omvat het oog tot het punt waar de ventrale meest horizontale lijnmarkering bovenkant cement klier aan de omtrek van de rechterzijde van het vlak (figuur 4CD). Blijven traceren langs deze onderste horizontale lijn until het aan het punt waar tracing begonnen. Gebruik foto-editing software om het gebied binnen de opsporing te berekenen.
    4. Bepaal de snuit lengte. Op laterale beelden, maak een verticale lijn die de voorste van het oog markeert. Vervolgens meet de horizontale afstand tussen het voorste punt waar de grootste zijde aan dorsale rand van het cement klier de verticale lijnmarkering het voorste van het oog (figuur 4D).
    5. Bepaal de mond breedte. Meet de horizontale afstand tussen de linker en rechter punt waar de bovenste en onderste "mond" van de opening mond meet (Figuur 4E). Deze kunnen worden beschouwd als de kikker equivalent van de labiale commissuren.
    6. Bepaal de mond rondheid. Bereken mond rondheid als een inverse beeldverhouding waar (4   ×   [Area]) / (π   ×   [Hoofdas] 2 >).
      1. Gebruik de lasso in een foto-editor om de randen van de mondopening te traceren, zoals weergegeven in figuur 4F. Selecteer Analyseren op de werkbalk en kies Meet. Alternatief berekenen rondheid van de meting van de stippellijn diameter van de mondopening.
  2. Data-analyse van gezichtsuitdrukkingen afmetingen:
    1. Voer de metingen gezichts dimensies in een data analyseprogramma de behandelingsgroep vergeleken met de controle. Bepaal het gemiddelde van elke meting voor zowel de experimentele en controlegroepen om staafdiagrammen creëren. Bepaal standaarddeviatie om foutbalken maken. Voer t-test van Student statistisch vergelijken groepen.
      Opmerking: Deze gegevens kunnen zeer variabel vanwege de enigszins verschillende tarieven ontwikkelingsniveau tussen embryo.

5. Kwantitatieve Analyse van Orofacial Shape en Morfometrie

  1. Plaats bezienswaardigheden en crealandmark te coördineren bestand (getoond in figuur 5A).
    1. Kies Landmarks zodat vangen zij de vorm van de doelafbeelding en herhaaldelijk in dezelfde relatieve locatie worden geplaatst in alle monsters geanalyseerd. Als een structuur niet bestaat in alle monsters, mag u een mijlpaal op deze structuur.
      1. Hier plaatst 24 monumenten aan de midface met onderscheidende kenmerken, zoals de ogen, neusgaten en mond te vertegenwoordigen. Voor de consistentie, plaats oriëntatiepunten halverwege eerder geplaatste monumenten (bijvoorbeeld mond oriëntatiepunten, figuur 5Ai).
    2. Leg mijlpaal coördinaten en creëren "mijlpaal coördineren bestand". Open het eerste beeld van een kikkervisje vlak (bijvoorbeeld de eerste controle embryo).
      1. Selecteer het tabblad Plug-ins op de werkbalk en kies Pointpicker uit het dropdown menu. Selecteer de punten toe te voegen tabblad en plaats oriëntatiepunten in gewenste locaties als plaatsen zal verschijnen als veelkleurige kruisen (
      2. Verplaats mijlpaal locaties na plaatsing door het selecteren van de Move kruisen tool. Wanneer alle bezienswaardigheden zijn op het beeld zijn geplaatst, selecteert u de weergave Resultaten Tab op de werkbalk en kies Show (Figuur 5Aii) naar mijlpaal coördinaten weer te geven en te kopiëren naar een spreadsheet programma (figuur 5Aiii).
      3. Bij het plakken van deze coördinaten van deze eerste embryo in een spreadsheet programma, laat een lege rij boven de gegevens. In kolom B van deze lege rij (rij 1), typ "LM =" met het aantal monumenten in de steekproef. Hier voert u "LM = 24" sinds 24 monumenten zijn gemaakt (Figuur 5Aiii, rode doos).
      4. In de rij onder de datapunten, typ "ID =" met een naam identificatie van het monster. Hier in figuur 5Aiii, voer "ID = CON1" want dit is de mijlpaal data van de eerste controle embryo (figuur 5Aiii, rode pijl) te coördineren.
        5. LET OP: Het is belangrijk dat elk embryo krijgt een unieke naam in de "ID =" rij. Hier bijvoorbeeld de volgende reeks landmark coördinaten wordt de ID van "CON2" omdat het de tweede embryo in de controlegroep.
      5. Kopieer de gehele tweede en derde kolom in een tekstdocument en opslaan als een .txt bestand.
  2. Stel de morfometrische software voor gegevensanalyse (in figuur 5B).
    1. Hier selecteert u Create New Data Set in het hoofdmenu in de morfometrische softwareprogramma. Noem het bestand en van de bij de desbetreffende vakken data (bijvoorbeeld "retinoïnezuur Remming" en "Facial monumenten", respectievelijk) in het pop-up scherm (Figuur 5BI). Importeer het bestand als een TPS, en select het tekstbestand van coördinaten aan de dataset (Figuur 5BI, rode pijl) te creëren.
    2. Data alignment en Procrustes passen:
      1. Voer een Procrustes pasvorm en uitlijning. Markeer de in het tabblad Project Tree gegevens, kiest Inleidingen op de hoofdwerkbalk, en New Procrustes Fit in het dropdown menu.
      2. Kies Align door Principal Axis en selecteer Uitvoeren Procrustes Fit op de bodem van de doos (Figuur 5Bii, rode pijl). Keer terug naar de voorrondes drop-down menu, selecteer Generate covariantiematrix (figuur 5Biii), en selecteer Uitvoeren.
      3. Bekijk de correlaties van de covariantiematrix in het tabblad Resultaten.
    3. Een "classifier bestand" door aan elk monster in de op de juiste classifier variabele gegevens te onderscheiden of het behoort in de experimentele groep en de controlegroep.
      1. Label twee kolommen in een spreadsheet. Label de header van de eerste kolomn met "ID" en voer dezelfde ID's gegeven voor elk monster (bijvoorbeeld CON1, RARINHIB1, enzovoort; Figuur 5Biv). Label de kop van de tweede kolom met "behandeling" en inbreng in elke cel de behandelingsgroep die overeenkomt met de in de aangrenzende cel ID vermelde sample.
      2. Hier gebruiken "CONTROL en RAR INHIBITOR" labels als classifiers (Figuur 5Biv). Kopiëren naar een tekstbestand en sla op als een .txt bestand. Import Classifier Variabelen in de morfometrische softwareprogramma. Kies Match door Identifier, en opent u het tekstbestand (Figuur 5Bv).
  3. Maak een principale componenten analyse (PCA) scatterplot door de Variatie dropdown menu te selecteren en te kiezen Principal Component Analysis (Figuur 6AI). Selecteer vervolgens het tabblad Grafisch om drie extra tabbladen te zien: PC vorm verandert, eigenwaarden, en pc-scores (figuur 6Aii). Het tabblad PC scores geeft de bivariate belangrijkste component scatterplot van de Procrustes fit mijlpaal data (Figuur 6Aii).
    1. Wijzigen welke hoofdbestanddelen zijn uitgezet, brengen de pop-up menu in het perceel ruimte en selecteer de gewenste as om (figuur 6Aiii, rode pijl) te wijzigen.
    2. Selecteer de kleurgegevens Points gereedschap (Figuur 6Aiii). Selecteer classificatoren eerder geïmporteerd (Sectie 5.2.2) in het tweede pop-up menu dat verschijnt om de kleur van elke categorie (figuur 6Aiv) te bepalen.
    3. Bekijk de hoeveelheid variantie gevangen genomen door elk van de belangrijkste component in het tabblad Resultaten (Figuur 6AV). Export grafiek als een .bmp bestand.
  4. Maak een discriminant functie analyse (DFA) transformatie rooster in de morphometric software programma door te kiezen discriminantfunctieanalyse onder het tabblad Vergelijking (Figuur 6BI). In het pop-up menu, ervoor zorgen dat de juiste dataset is selecteerd en het soort gegevens de Procrustes-fit coördinaten.
    1. Markeer de paren te vergelijken groepen, en 1.000 permutatietests (Figuur 6Bii) draaien.
    2. Onder Graphics, bekijk de vector kaart van de coördinaten in het tabblad Vorm Difference (Figuur 6Biii). Als het beeld is omgekeerd, brengen de pop-up menu in het perceel ruimte om het schema te draaien in de juiste richting (Figuur 6Biii).
    3. De richting van vectoren weerspiegelt de vorm verschil met de eerste groep ten opzichte van de tweede, die wordt weergegeven in de discriminantfunctie menu voor het uitvoeren van de analyse (figuur 6Bii). Om de richting van de vectoren te keren, brengen de pop-up menu in het perceel ruimte en verandert het teken van de schaal factor zodat het negatief is (Figuur 6Biii, iv). De waarde van de schaal is ingesteld op een factor tien dat het beste het statistische verschillen in mijlpaal positie between de twee groepen zonder vervorming, en wordt meestal overgelaten aan de standaard (Figuur 6Biv).
    4. Ook in het pop-up menu, verandert de grafiek om een transformatie raster om de vectoren superponeren op een rooster (Figuur 6Biii, v).
    5. Geef het aantal horizontale en verticale lijnen van het raster in het pop-up menu (Figuur 6Biii, v).
    6. De grafiek te exporteren als een .bmp bestand.
    7. Bekijk de Procrustes en Mahalinobis afstanden en p-waarden onder de tab Resultaten (Figuur 6Bvi).
  5. Aanvullende morfometrische analyses die nuttig zijn voor de beoordeling van meer dan één behandelingsgroep
    1. Maak een principal component analyse transformatie net. De PC Shape Verandert tabblad toont de vector kaart van vorm verandert goed voor variantie in elk monster groep. Gebruik het pop-up menu in het tekengebied om het beeld goed te oriënteren en superponeren vectoren op een transformatie raster. Zet de schaal factorde waarde op de X-as van de PC scores grafiek die overeenkomt met de geschatte middelpunt van de controlegroep. Exporteer het beeld als een .bmp bestand.
    2. Maak een CVA scatterplot. Selecteer op het tabblad Vergelijking op de hoofdwerkbalk Canonical Variate Analyse, en markeer de classifier variabele set die eerder werd geïmporteerd (zie paragraaf 5.2.3). Selecteer 1000 iteraties voor permutatietests en selecteer Uitvoeren. Selecteer het tabblad CV scores aan de bivariate CVA scatterplot te bekijken. Dit is een kleurcode op basis van de geüploade classifiers. Verander het kleurenschema door de opvoeding van het pop-up menu in het perceel ruimte (zie paragraaf 5.3.3). Exporteren als een .bmp bestand.
    3. Maak een CVA transformatie raster. Een transformatie raster van het CVA resultaten kunnen in de vergelijking meer dan twee groepen. Onder het tabblad Graphics, kiest CV Shape Wijzigingen aan de transformatie rooster van de mijlpaal coördinaten visualiseren. Open het pop-up menu in het perceel ruimte om te veranderende richting van de vector, resultaten superponeren op een transformatie raster, en geeft u het aantal rasterlijnen. De grafiek te exporteren als een .bmp bestand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier wordt een kwantitatieve analyse van orofaciale grootte en vorm werd aangetoond vergelijken embryo's behandeld met een retinoïnezuur receptor inhibitor (RAR remmer) onbehandelde controles. Embryo's werden behandeld met een 1 uM concentratie van deze chemische remmer uit fase 24 tot 30 (26-35 HPF), uitgewassen en in stadium 42 (82 HPF) vast. Zij werden vervolgens verwerkt en geanalyseerd zoals beschreven in het protocol. De resultaten zijn oorspronkelijke gegevens, maar in overeenstemming met waarnemingen in eerdere publicaties 2,3. Controle embryo's werden behandeld met het vehikel, DMSO en normaal ontwikkeld (figuur 7Ai, ii). Embryo behandeld met een 1 uM concentratie van de RAR inhibitor konden lichte vernauwing van het gezicht, oog anomalieën en een misvormde embryonale opening die mond was driehoekig (fig 7Aiii, iv).

Eerst werden traditioneel orofaciale dimensies gemeten en worden samengevat in figuur 7B. S tatistical significantie werd bepaald door het uitvoeren van een t-toets uitgaande ongelijke variantie tussen remmer behandelde embryo en controles voor elke meting. We vonden dat zowel snuit lengte en werkbreedte waren significant verlaagd in RAR remmer behandelde embryo in vergelijking met controles (p-waarden = 0,0062 en 0,0058, respectievelijk Figuur 7Bi, ii). Terwijl gezicht hoogte en mond rondheid aanzienlijk werden verhoogd (p-waarden = 3,7772 x 10 -6, 1,4812 x 10 -7), mond breedte nam significant af (p-waarde = 2,5175 x 10 -10; Figuur 7Biii-v) .De Resultaten toonden geen significant verschil in de totale orofaciale gebied tussen de twee groepen (p-waarde = 0,3754 Figuur 7Bvi). Deze gegevens tonen aan dat verlies van retinoïnezuur signalering op een bepaald moment in ontwikkeling resulteert in een kortere snuit geringe vernauwing van de midface regio, en misvormingen van het embryonale mondopening.

nt "> Om een ​​verfijnde weergave van de vormveranderingen van de embryonale orofaciale regio in reactie op verminderde retinoinezuur signalen, we volgend benut geometrische morfometrische analyses. Na het identificeren van en het afstemmen van orofaciale oriëntatiepunten behulp morfometrische analyse software, vervolgens onderzocht we de variantie binnen elke groep via principal component analysis (PCA). Bij de eerste twee hoofdcomponenten werden uitgezet tegen elkaar RAR remmer behandelde embryo's waren duidelijk van controles aan de PC1 as (figuur 7C). Deze test toonde ook de uitschieters in de steekproef instel- geïllustreerd door twee remmer behandelde embryo die niet cluster met de rest van de groep (figuur 7C, pijlen).

Vervolgens de statistische verschillen in de vorm van het orofaciale gebied tussen RAR remmer behandelde embryo en controles werden geëvalueerd en gevisualiseerd door het uitvoeren van een discriminantfunctieanalyse (DFA). De Procrustes afstand between de twee groepen was significant verschillend (afstand = 0,2665, p-waarde <0,0001, figuur 7D), wat wijst op een verandering in de orofaciale vorm toen retinoinezuur signalering wordt verstoord. Inderdaad, grote verschuivingen in de positie van laterale monumenten in het orofaciale gebied geven een vernauwing van de gezichtsvorm betreffende de hoogte van remmer behandelde embryo's (Figuur 7D). Bovendien, de lichte buitenwaartse verschuiving in positie van de nasale oriëntatiepunten (figuur 7D, pijlen) toont de afwijking in neusgat positie in deze embryo's die in overeenstemming met verminderde uitgroei van de snuit. De verschuivingen in de bezienswaardigheden die de randen van de mondopening tonen positie verandert, dat de vorming van de opening die een driehoekige mond reflecteren definiëren in overeenstemming is met de mediaan gespleten gemeld in onze vorige studies 2,3. Naast vector verschuivingen, het kromtrekken patroon van de transformatie rooster illustreert ook vormveranderingen in de ofofacial regio. Kromtrekken in de midface regio is met de midface hypoplasie en algemene gezicht vernauwing waargenomen bij embryo's met verminderde retinoïnezuur signalen (Figuur 7D).

De resultaten van de discriminantfunctieanalyse (DFA) blijkt vormveranderingen die overeenkomt met onze kwalitatieve analyse waren, evenals onthullend aantal veranderingen die onvoldoende werden gevangen door traditionele omvangmetingen alleen. Bijvoorbeeld, terwijl het orofaciale gebied was niet significant verschillend tussen de controles en inhibitor behandelde embryo (figuur 7Bvi), de DFA transformatie rooster geopenbaard dramatische veranderingen in dit gebied in overeenstemming met het gezicht vernauwing waargenomen bij remmer behandelde embryo (figuur 7A, D). Verder, het kromtrekken patroon en landmark verschuivingen van de mondopening, in combinatie met de significante verandering we in mond ronding illustreren de misvorming van de mondopening vorm remmer behandelde embryos. Kortom, een combinatie van traditionele metingen gezichts afmetingen en geometrische morfometrische analyse toont de veranderingen in vorm en grootte van het orofaciale gebied als retinoïnezuur signalen verstoord.

Figuur 1
Figuur 1. Benodigde materialen. (A) voor gegevensanalyse. (I) 24-well plaat, (ii) standaard wegwerp pipet, (iii) Dumont # 5 tang Inox, (iv) met klei beklede petrischaal, (v) recht plagen naald, (vi) glazen pipet tool, (vii ) steriele, wegwerp scalpel. (B) Voorbereiding van de klei beklede schaal. (I) Directe plagen naald wordt gebruikt om horizontale lijnen in de klei trekken. (Ii) Een glazen pipet tool wordt gebruikt om circulaire depressies langs elke rij te maken. (Iii) De schaal is gevuld met PBT voor beeldvorming.

page = "always"> Figuur 2
Figuur 2. In vitro fertilisatie en de cultuur van Xenopus eieren. (A) Na HCG injectie volwassen Xenopus laevis vrouwtjes geïnduceerd om eieren te leggen. (B) eieren worden verzameld hoog zoutgehalte MBS, bemest met testes geëxtraheerd uit een mannelijk en gekweekt met standaardmethoden. (C) Embryo's worden overgebracht naar een 24-putjes bevattende 0,1 x MBS met een standaard, wegwerpbare pipet. (D) een gekalibreerde pipet mens wordt gebruikt voor het meten 1 ml in een lege put en een marker wordt gebruikt om dit niveau bakenen op de buitenzijde van alle putjes bevattende embryo (inzet). 0.1x MBS wordt dan toegevoegd of weggehaald, zodat het niveau van deze markering.

highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3. Voorbereiding van embryo koppen voor beeldvorming. (A) Schematische weergave van de twee incisies nodig zijn om hoofden, stevige zwarte lijnen te verwijderen. Schaal bar = 400 urn. (B) De eerste incisie wordt gemaakt aan het achterste uiteinde van de darm aan de staart en vrijgeven druk van de scalpel verwijderen. Schaal bar = 400 urn. (C) De tweede insnijding wordt gemaakt aan het voorste uiteinde van de darm, in het hart, volledig scheiden van de weg. Schaal bar = 400 pm. (D) Frontale uitzicht op rij van embryo hoofden gepositioneerd in klei. Schaal bar = 650 micrometer. (E) een zijdelings uitzicht op rij van embryo hoofden positie in klei. Schaal bar = 500 micrometer cg: cement klier.

Figuur 4
Figuur 4. Traditionele grootte metingen van orofaciale afmetingen. (A) Gezicht breedte. Pijlen geven de punten waar het ventrale deel van het oog aan de omtrek van het gezicht. Rode lijn is het gezicht breedte, gemeten als de afstand tussen deze punten. Schaal bar = 210 uM. (B) Gezicht Hoogte. Witte lijnen zijn gidsen op de dorsale rand van de ogen en de dorsale rand van het cement klier getrokken voorafgaand aan de meting. Rode lijn is de gezichtshoogte, gemeten als de afstand tussen deze twee geleiders aan de middellijn van het gezicht. Schaal bar = 210 uM. (C) Orofacial gebied. Witte lijnen zijn gidsen getekend voorafgaand aan de meting. (A) punt waar de onderste geleider aan de ventrale rand van het linkeroog. Rode lijn toont de tracing rond het linkeroog. (B) punt waar de dorsale rand van het oog aan de top gids. Blauwe lijn geeft de dorsale grens van orofaciale gebied, getraceerd langs de bovenkant gids bij de dorsale rand van de ogen. (C) Punt, waar de top gids voldoet aan de juiste gezichtsbehandeling periferie. Groene lijn showshet traceren rondom het rechteroog. (D) punt waar de ventrale rand van het rechter oog voldoet aan de onderkant gids. Gele lijn toont ventrale grens van orofaciale gebied, getraceerd langs de onderkant gids bij de dorsale rand van het cement klier. Schaal bar = 210 uM. (D) snuit lengte. Witte lijn is de voorste rand van het oog en wordt getekend als een gids voor de meting. Rode lijn snuit lengte, gemeten vanaf de lijn naar het punt waar de dorsale rand van het cement klier aan de laterale rand van het gezicht. Schaal bar = 300 uM. (E) Mouth breedte. Arrows zijn de punten waar de dorsale en ventrale lippen elkaar ontmoeten. De rode lijn is de mond breedte, gemeten als de afstand tussen deze twee punten. Schaal bar = 200 uM. (F) Mouth rondheid. De omtrek van de mondopening wordt opgespoord en rood weergegeven. cg: cement klier. Schaal bar = 200 uM.

"Figuur Figuur 5. Het vastleggen van bezienswaardigheden en voorrondes voor geometrische morfometrische analyse. (A) met behulp van foto-editing software en een spreadsheet programma om bezienswaardigheden en capture coördinaten plaatsen. (I) Veelkleurige kruisen zijn de blikvangers op de afbeelding geplaatst met behulp van de punten toevoegen-gereedschap in ImageJ aan de vorm van de orofaciale regio vertegenwoordigen. (Ii) Landmark gegevens worden weergegeven met behulp van de display Resultaten Tool. (Iii) Landmark gegevens worden gekopieerd en geplakt in een spreadsheet. Boven de tweede kolom is een header identificeren van het aantal monumenten en aangeduid met "LM = 24" (rode doos). Onder de tweede kolom van de gegevens, wordt het monster krijgt een unieke naam en aangeduid met "ID = CON1" (rode pijl). Dit wordt herhaald voor alle beelden in een sample set en de data wordt opgeslagen als een tekstbestand. (B) Voorlopige data-analyse in een geometrische morphometric softwzijn programma. (I) De tekst bestand gemaakt in de foto-editing software wordt geïmporteerd in de morfometrische programma, MorphoJ, als een TPS-bestand. Bestand wordt aangegeven door de rode pijl. (Ii) Landmark coördineren data is uitgelijnd door Procrustes fit door hoofdassen. Rode pijl geeft de uitvoering van de aanpassing. (Iii) Een covariantiematrix van Procrustes fit oriëntatiepunten wordt gegenereerd in het menu voorrondes. (Iv) Een classifier bestand wordt gemaakt in een spreadsheet. Kolom A en B gegeven headers "ID" en "behandeling", respectievelijk. De ID's toegekend aan elk monster in herkenningspunt het verzamelen van gegevens worden ingevoerd onder kolom A, en de behandelde groep waar elk monster behoort wordt ingevoerd in kolom B. (v) De classifier bestand wordt geïmporteerd in de morphometric programma als een variabele set classifier en Matched door Identifier voor de gekozen data set. Klik hier om een grotere versie van te bekijkendit cijfer.

Figuur 6
Figuur 6. Statistische analyse in morphometric software. (A) Principal Component Analysis (PCA) (i) PCA is geselecteerd op het tabblad Variant. (Ii) De eerste twee hoofdbestanddelen van oriëntatiepunten Procrustes worden weergegeven als een puntenwolk in het tabblad PC-scores. (Iii) Er verschijnt een pop-up menu wordt opgevoed in het perceel ruimte. Dit menu wordt gebruikt om te wijzigen welke hoofdbestanddelen zijn uitgezet tegen elkaar (rode pijl) en de datapunten (blauw gemarkeerd) te kleuren. (Iv) De datapunten zijn gekleurd volgens de classifier variabelen in het pop-up menu. (V) Percentage variantie gevangen door elk hoofdbestanddeel wordt gezien in de tab Resultaten. (B) discriminantfunctieanalyse (DFA) (i) DFA wordt gekozen uit de tab vergelijken. (ii) De dataset van Procrustes coördinaten is geselecteerd voor DFA, en de eerder geüploade classifiers worden gekozen voor het groeperen. De gewenste groepen te vergelijken gekozen en permutatietests worden uitgevoerd. (Iii) DFA resultaten worden weergegeven als een vector kaart in het tabblad Vorm Difference. Een pop-up menu in het perceel ruimte kan worden gebruikt om het beeld in de juiste richting. (Iv) Door het selecteren van het tabblad Set Scale Factor in het pop-up menu, het teken van de schaalfactor kan worden gewijzigd. (V) De vector kaart wordt gewijzigd in een transformatie rooster met het gewenste aantal rasterlijnen door te kiezen Verander het type grafiek in het pop-up menu van de vector kaart. (Vi) De Mahalanobis en Procrustes afstanden en bijbehorende p-waarden worden bekeken onder het tabblad Resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7. Orofacial analyse van controle- en RAR remde behandelde embryo. (A) (i, ii) Representatieve beelden van controles. Schaal bar = 270 urn. (Iii, iv) Embryo behandeld met een 1 uM concentratie van de RAR inhibitor, BMS-453. Schaal bar = 260 urn. (I, iii) frontaal uitzicht op. Mondopening is geschetst in rode stippen. (Ii, iv) standpunten Side. cg:. cement klier (B) Traditionele orofacial dimensies van controle (zwart) en remmer behandeld (blauw) embryo's. (I) snuit lengte in mm (ii) vlak breedte in mm (iii) gezichtshoogte, in mm (iv) mondbreedte, in mm (v) mond ronding een getal zonder eenheid vastgesteld ImageJ met de vergelijking: (4   ×   [Area]) / (π   ×   [Hoofdas] 2). (Vi) Orofacial gebied, in mm (C) Principal Component Analysis. De controles zijn in het zwart en RAR-remmer behandeld embryo's zijn in het blauw. Zwarte pijlen geven uitschieters. PC1 = 73,63%, PC2 = 9,56%. (D) discriminantfunctieanalyse tonen de Procrustes afstand en p-waarde naast een transformatie raster. Gesloten cirkel einde van vector is mijlpaal positie in RAR-remmer behandelde embryo. Het einde van de lijn van de vector is de gemarkeerde positie in de controlegroep. Zwarte pijlen geven verschuiving in nasale oriëntatiepunten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus laevis is uitgegroeid tot een nuttig instrument voor het ontleden van de ontwikkelingsbiologie mechanismen onderliggend orofaciale ontwikkeling; Er zijn nog geen protocollen beschrijven grootte en vorm veranderingen van deze regio bij kikkers. De hier beschreven methode zal een belangrijke bijdrage leveren op het gebied van orofaciale ontwikkeling te creëren door meer rigoureuze kwantificering van orofaciale fenotypes in Xenopus en andere gewervelde dieren.

De eerste, meest kritische aspect van deze protocol correcte uitvoering is het vermogen om gezicht afmetingen zowel nauwkeurig en reproduceerbaar te meten en bepalen landmark plaatsing. Daarom is het cruciaal dat embryonale kanten worden gefotografeerd onder dezelfde hoek, richting en vergroting. Bijzondere voorzichtigheid geboden om nauwkeurige metingen van de snuit lengte te verkrijgen, omdat het moeilijk is om embryo lateraal manipuleren Consistente plaatsing. Het hebben van een enkele persoon uit te voeren van alle metingen op de same dag minimaliseert dit soort fouten, terwijl het maximaliseren van de reproduceerbaarheid van de resultaten. De tweede essentiële punt waarborgen goede resultaten is de vermindering van onnodige variabiliteit, zoals verschillen in ontwikkeling of genetische achtergrond. Dit is vooral belangrijk bij de beoordeling van statistische significantie tussen subtiele gebreken. Embryo's moeten daarom op dezelfde fase bij behandeling en gefotografeerd. Bovendien moet erop worden toegezien ontwikkelingsstoornissen tarieven zijn gelijk tussen en onder de behandelingsgroepen. Om dergelijke problemen te verminderen met de variabiliteit, zorg ervoor dat alle embryo's van dezelfde ouders en zijn podium afgestemd aan het begin van het experiment. Verminderen ook externe variabiliteit zoals verschillende buffer bronnen en volumes, verschillende aantallen embryo en verdelingen in de kweekschalen (bijvoorbeeld verdringing voorkomen).

Een belangrijke stap in de beoordeling van vorm verandert door geometrische morfometrie is de alignment van mijlpaal coördineert via Procrustes fit. Door toepassing van dit wiskundig algoritme, wordt alle informatie over de grootte of de verschillen in de rotatie van het beeld verwijderd. De vervolgens gegenereerd covariantiematrix bepaalt de ongestandaardiseerde correlaties van mijlpaal coördineert onder alle embryo's in de dataset, waarop multivariate statistische technieken-zoals hoofdcomponent of discriminantfunctie analyses- kan worden uitgevoerd.

Een principale componenten analyse (PCA) vermindert een complex monster tot een kleinere set van variabelen genoemd hoofdcomponenten 26. De eerste component is goed voor de meeste variantie in de sample set, met elke volgende component goed voor de rest. Door het uitzetten van de eerste twee componenten met elkaar met behulp morfometrische software, monsters die samen het meest vergelijkbaar cluster. Op deze manier, PCA discrimineert groepen binnen een sample set, terwijl tegelijkertijd het bepalen van de variatie binnen hen. In some gevallen groepen niet duidelijk van elkaar en overlappen langs een of beide assen. In dit geval is het voordelig om andere componenten om subtiele kenmerken waardoor groepen onderscheiden onthullen uitzetten (bijvoorbeeld PC3). Dit is vooral van belang wanneer de totale variantie gelijkmatiger wordt verdeeld over de eerste paar variabelen.

De discriminant functie analyse (DFA) van Procrustes fit data bepaalt of monsters in een data set effectief in groepen worden gediscrimineerd door de continue variabelen die hen definiëren. Monsters worden daarom ingedeeld in groepen voorafgaand aan de analyse, en de variabelen worden vertaald in componenten genoemd discrimineren functies om de statistische relatie tussen de groepen 27 te bepalen. Voorafgaand aan het uitvoeren van deze analyse is het belangrijk om het aantal permutatietests geven. Deze permutatietests willekeurig de gegevens zodanig dat elke veronderstellingen over de verdeling daarvan Eliminated. Meer permutatietoets iteraties verhogen van de nauwkeurigheid van de p-waarde. Wanneer gevisualiseerd als een transformatie raster, significante veranderingen in de positie herkenningspunt tussen de groepen worden vergeleken, worden weergegeven. Verder, het kromtrekken patroon van het net onthult waar vormveranderingen optreden. Het nadeel van deze analyse is dat het alleen kan worden gebruikt voor vergelijking van twee groepen. Als er drie of meer groepen in een monster die voor vergelijking is het beter om een ​​canonieke variate analyse. Dit is vergelijkbaar met een DFA in hierdoor gegenereerde statistische p-waarde; echter, toont veranderingen in het gehele monster in aanvulling op overdrachten tussen afzonderlijke groepen binnen die set.

De belangrijkste beperking van deze orofaciale kwantificering protocol is dat het alleen kan worden toegepast op twee-dimensionale data. Onze doelstellingen voor de toekomst zijn het gebruik van een CT-scan of confocale microscopie om soortgelijke methoden voor de analyse van driedimensionale gegevens te ontwikkelen. Anderzijds,werken met tweedimensionale beelden is ook een van de sterkste punten van dit protocol. Alleen elementaire stereoscopen uitgerust met camera's nodig voor het vastleggen van beelden van de embryonale gezicht. De Openware gebruikt voor de gegevensanalyse verhoogt ook de toegankelijkheid van deze werkwijze, terwijl het verminderen van de kosten. Verder is een gevorderde kennis van sofistische imaging, statistische analyses, of het programmeren van computers niet verplicht om zinvolle en belangrijke resultaten uit de data te halen. In feite wordt deze techniek momenteel onderwezen als onderdeel van een undergraduate practicum in het departement VCU van de biologie. Dus het orofaciale kwantificering protocol hier gepresenteerde gemakkelijk te leren en toepassen in een kort tijdsbestek. Als een video weergave, zijn kritische stappen zoals het positioneren van embryo's en het navigeren in de software gemarkeerd om het protocol met succes kan worden gebruikt door zelfs ongetrainde studenten en onderzoekers te garanderen. Samengevat zal dit protocol een waardevolle bron verschaffenvoor de onderzoeksgemeenschap en als een pedagogisch instrument.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Start-up gelden aan A. Dickinson uit VCU dit werk ondersteund.

De auteurs willen Dan Nacu erkennen voor zijn artistieke talent in het maken van de schematische weergave.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Zeiss fitted with AxioCamICC1 camera
Dumont #5 Inox forceps Fine Science Tools 11251-10
Sterile, disposable scalpel Sklar 06-2015
24-well plate Fisher Scientific 087721
Standard Disposable transfer pipettes Fisher Scientific 13-711-7M
150 mm x 15 mm Petri dishes Falcon 351058
Incubators Ectotherm set to 15 °C or 20 °C
Modeling Clay Premo, or other non-toxic modeling clay in black or white
Straight teasing needle Thermo Scientific 19010
Capillary Tubing (for needles) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber, 100 mm each
Needle Puller, Model P-97 Sutter Instrument Co. Needle Puller: P-97 Flaming/ Bown micropipette puller Filament: FB300B For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide.
Pipettemen Gilson F144802, F123600, F123602
BMS-453 Tocris 3409
DMSO American Bioanalytical AB00435-01000
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich 158127
Petri dishes Falcom 353003, 351058 100 mm diameter and 150 mm in diameter
100% Ethanol VWR 89125-170

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

Tags

Developmental Biology Orofacial kwantificering geometrische morfometrie, Orofaciale ontwikkeling orofaciale afwijkingen van vorm verandert gezichtsbehandeling afmetingen
Kwantificering van Orofacial Phenotypes in<em&gt; Xenopus</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kennedy, A. E., Dickinson, A. J.… More

Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus. J. Vis. Exp. (93), e52062, doi:10.3791/52062 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter