Abstract
Plakanalyser fortsat en af de mest præcise metoder til direkte kvantificering af smitsomme vironer og antivirale stoffer gennem optællingen af diskrete plaques (infektiøse enheder og cellulære døde zoner) i cellekultur. Her demonstrerer vi, hvordan du udfører en grundlæggende plaque assay, samt hvordan forskellige overlays og teknikker kan påvirke plak dannelse og produktion. Typisk faste eller halvfaste overlay substrater, såsom agarose eller carboxymethylcellulose, er blevet anvendt til at begrænse viral spredning, forebyggelse vilkårlig infektion gennem det flydende vækstmedium. Immobiliserede overlays begrænse cellulær infektion til det umiddelbart omgivende monolag, tillade dannelsen af diskrete countable foci og efterfølgende plaquedannelse. For at overvinde de vanskeligheder, der er forbundet med brug af traditionelle overlejringer, har en ny flydende overlay udnytte mikrokrystallinsk cellulose og natriumcarboxymethylcellulose i stigende grad blevet anvendt som en erstatning i standardplaque assay. Flydende overlay plaque assays let kan udføres i enten standard 6 eller 12 brønde pladeformater pr traditionelle teknikker og kræver ikke særligt udstyr. På grund af dets flydende tilstand og efterfølgende let påføring og fjernelse kan mikrokultur pladeformater alternativt anvendes som en hurtig, præcis og high throughput alternativ til større skala virale titreringer. Anvendelse af en ikke-opvarmet tyktflydende væske polymer giver mulighed for at strømline arbejdet, sparer reagenser, inkubator plads, og øger driftssikkerheden, når de anvendes i traditionelle eller høje inddæmning labs som ingen reagens opvarmning eller glasvarer er nødvendige. Flydende overlejringer kan også vise sig mere følsomme end traditionelle overlays for visse varmefølsomme vira.
Introduction
Den nøjagtige isolation og kvantificering af levedygtige virale prøver har konsekvent været en igangværende forskning mål i virologi. Det var ikke før fremkomsten af plaqueanalyse i 1952, at et middel til både kvantitativt og kvalitativt beregne dyr virustitere blev først udviklet 1,2. Denne teknik blev først tilpasset og modificeret fra fag-assays, som tidligere var blevet anvendt til at beregne titre af lager bakteriofager i plantebiologi 1,2. Mens alternative midler til viral kvantificering siden er blevet udviklet og tilpasset, såsom immunoassays, fluorescens og transmissionselektronmikroskopi, afstemmelige resistive puls sensing (TRP), flowcytometri, rekombinante reportersystemer, og kvantitativ revers transkription-polymerase-kædereaktion (QRT-PCR) disse metoder mislykkes at identificere og kvantificere replikationskompetente vironer 1,3. Mens fremskridt i teknologier og teknikker fortsætter med at forfine og ændre landskabet; plaque assays udgør fortsat guldstandarden i fastlæggelsen virale koncentrationer for smitsomme lytiske vironer 1,4.
Under en plaque assay et konfluent monolag af værtsceller inficeret med en lytisk virus af en ukendt koncentration, der er seriefortyndet på en tælleligt interval, typisk mellem 5-100 virioner. Inficerede monolag dækkes derefter med en immobiliserende daeksubstratet at forhindre virusinfektion fra flæng spredes gennem enten mekaniske eller convectional strømning af det flydende medium under viral propagering. Mens faste eller halvfaste overlays såsom agarose, methylcellulose eller carboxymethylcellulose (CMC) traditionelt har været anvendt, har flydende overlays blevet et stadig mere attraktivt alternativ med udvikling af nye flydende overlays såsom Avicel 5- 7. Plakanalyser anvender flydende versus traditionelle overlays har flere fordele som overlejring kan være applIED ved stuetemperatur, og anvendelse og fjernelse er betydeligt lettere. Som likvide overlays ikke kræver opvarmning, kan sarte og varmefølsomme virus også være enklere at plak.
Efter den første infektion og anvendelsen af immobiliserende overlay, individuelle plaques, eller zoner af celledød, vil begynde at udvikle sig som viral infektion og replikation er begrænset til det omgivende monolag. Inficerede celler vil fortsætte replikation-lysis-infektion cyklus, yderligere at smitten breder sig, hvilket resulterer i stadig mere adskilte og diskrete plaques. Afhængigt af den virale vækst kinetik og anvendte værtscelle, vil en synlig plak normalt dannes inden 2-14 dage. Cellulære monolag kan derefter tælles med en standard lysfelt mikroskop, eller mere typisk fast og modfarvet med neutral rød eller krystal voldelig med henblik på let identificere plaques med det blotte øje. Der er en bred vifte af plak counter pletter, som hver især tilbyder thEIR særlige fordele og ulemper. Crystal violet tilsættes typisk ved punktet for indsamling og efter fiksering / fjernelse af overlay, hvilket giver en hurtig og tydelig counter plet, som muliggør identifikation af meget små plaques når blandet morfologi er til stede. Neutral rød har den fordel, tidlig anvendelse og konstant kontakt med overlay, der giver mulighed for direkte overvågning af udviklingen af plaque dannelse, hvilket er særligt nyttigt, når der arbejdes med en ukendt virus eller replikation kinetik. Vi har dog fundet, at farvningen er typisk ikke så tydelig, når du bruger neutral rød. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) giver adskillige fordele, da det gule farvestof pletter levende celler mørkeblå og virale plaques kan tælles uden fjernelse af overlay som med neutral rød. Høj kontrast mellem levende og døde celler, der ligger i MTT tillader også påvisning af små plaques på et tidligere tidspunkt efter infektion, Skønt opbevaring stadig ville kræve fjernelse af overlay 8. Som krystalviolet blot kan foretages i en opløsning af vand og alkohol, og tilvejebringer en høj grad af følsomhed for blandet plakmorfologi, har vi valgt det som en foretrukken og forenklet counter pletten for den protokol vist, vi udnytter flere familier af godt karakteriserede vira.
Efter fiksering og farvning af inficerede cellulære monolag er plaques tælles med henblik på at titrere virale stock prøver i form af plaque-dannende enheder (pfu) per milliliter. En log drop skal bemærkes mellem serielle fortyndinger, og afhængig af pladestørrelse mellem 5-100 plaques talt, med en negativ kontrol anvendes som reference. Statistisk prøver vil variere med 10% for hver 100 plaques tælles, når man sammenligner prøve replikater 3. Fordelen ved anvendelse af plaque-assays til at bestemme virustitere ligger i deres evne til at kvantificere det faktiske antal af infektiøse viruspartikler wnden for prøven. Som flere virioner potentielt kan inficere en enkelt celle, er terminologien enheder versus vironer anvendes under plak titreringer 1,2.
Plakmorfologi kan variere voldsomt under forskellige vækstbetingelser og mellem virale arter. Plaquestørrelse, klarhed, definition af grænserne og distribution bør alle være bemærkes, da de kan give værdifulde oplysninger om vækst- og virulensfaktorer af den pågældende virus.
Grundlæggende plaque assay principper kan også tilpasses og modificeres på en række forskellige måder, såsom ved anvendelse af fokusdannende assays (FFA'ere). FFAs ikke stole på cellelyse og kontrastfarvning at opdage plak dannelse, men snarere ansætte immunfarvning teknikker til direkte at detektere intracellulære virale proteiner via mærkede antistoffer. Øget følsomhed, nedsat inkubationstider efter infektion, og vigtigst evnen til at kvantificere ikke-lytiske virus er alle adskiltfordele, når ansætte FFAs. Mens udbredte, de kritiske begrænsende faktorer i FFA versus en traditionel plaque assay ligger i behovet for egnede antistoffer og evnen til kun at probe for virale proteinunderenheder versus faktiske infektiøse vironer 4.
Med henblik på denne undersøgelse vil vi begrænse vores diskussion til klassiske plakanalyser og beskrive brugen af traditionelle faste og halvfaste overlays (agarose og CMC), sammen med nye flydende mikrokrystallinsk cellulose overlejringer.
Protocol
1. Fremstilling af celler og reagenser
- Dagen før assayet plade passende værtsceller til den pågældende virus (tabel 1 og 2) ved 90 - 100% sammenflydning.
- Forbered fastsættelse opløsning af 10% formaldehyd i dH 2 O. I eksempel blande 5,56 ml 36% formaldehyd lager med 14,44 ml destilleret H2O (dH2O).
BEMÆRK: Brug passende sikker håndtering praksis og ventilation, når du bruger formaldehyd. - Forbered krystalviolet plet: 1% krystalviolet (CV) i 20% ethanol og dH 2 O.
- Forbered 2x plak medier (celletype afhængig på 2x koncentration, se tabel 2). Foretage anvendelse af et 0,2 um filter, hvis eventuelle reagenser er ikke sterile.
- Fremstilling af immobilisering overlays (tabel 3)
- For flydende overlejringer, lave en steril 2,4% opløsning af Avicel i dH 2 O. At forhindre sammenklumpning tilføje pulveret til en kolbe indeholdende vand thved hurtigt at blande med en omrører, hæld Avicel langsomt og omrøres hurtigt ved stuetemperatur (RT). Når opløsningen bliver for tyktflydende til en omrører til at homogenisere, skifte til en kolbe shaker for> 30 min med kraftig omrøring for at sikre jævn homogenisering.
BEMÆRK: Stamopløsninger kan ske ved lavere koncentrationer, men løsningerne kan adskille og bliver nødt til at blive remixet for at sikre homogenisering. Arbejdsopløsninger Avicel kan anvendes i intervallet fra 0,6 til 3%. - Efter homogenisering autoklaveres opløsningen og opbevares forseglet ved stuetemperatur.
- For agarose og carboxymethylcellulose (CMC) overlejringer fremstille en stamopløsning i dH 2 O 2% CMC eller 0,6% agarose. Bland med en omrørerstav og autoklave eller mikrobølge at bringe i opløsning.
- For flydende overlejringer, lave en steril 2,4% opløsning af Avicel i dH 2 O. At forhindre sammenklumpning tilføje pulveret til en kolbe indeholdende vand thved hurtigt at blande med en omrører, hæld Avicel langsomt og omrøres hurtigt ved stuetemperatur (RT). Når opløsningen bliver for tyktflydende til en omrører til at homogenisere, skifte til en kolbe shaker for> 30 min med kraftig omrøring for at sikre jævn homogenisering.
2. fortyndinger og Infektioner
- Dagen efter plating, visuelt kontrollere confluency og levedygtigheden af cellerne før analysen startes. Sikre standard cellulær morfologi and a ~ 90% sammenflydende monolag er til stede.
- Udfør en tidobbelt seriel fortynding af infektiøse prøver. Brug cellulære vækstmedier for viral propagering som fortyndingsmiddel (tabel 2). Varier antallet af fortyndinger nødvendige baseret på den forventede titer af den pågældende virus, og brug altid en ikke-inficerede kontrolprøve til selvstændigt at sikre cellulær levedygtighed og støtte i plak identifikation.
- Fra serielle fortyndinger, inficere cellerne i 45 min til 1 time (tabel 1). Anvender et passende volumen af inokulum til dækning af celler, samtidig med at mængden så lavt som muligt for at maksimere viral kontakt med monolaget (tabel 4). Vip forsigtigt plader hver 20 min for at sikre en jævn dækning og forhindre cellulære monolag fra tørring.
- Efter infektion overlejre et passende volumen af immobilisering medium direkte til inoculums i brønden (tabel 2) ved anvendelse af en 1: 1 blanding af 2x plaque medier og immobilizing overlay valg (CMC, agarose eller Avicel). Vip forsigtigt at blande.
- For flydende overlays blandes 1: 1 med varmede 2x plaque medier og 1,2-2,4% RT lager Avicel at få en brugsopløsning på 0,6-1,2% Avicel daeksubstratet.
- For en agarose overlay, anvendes en 1: 1 blanding af warmed 2x plaque medier og en stamopløsning af opvarmet 0,6% agarose, sted i et 56 ° C vandbad i 30 minutter til at ækvilibrere temperaturen opnå en endelig agarose / overlay koncentration på 0,3 %.
- CMC fremstilles en 2% stamopløsning og behandles som beskrevet for agarose overlay.
- Ved anvendelsen af overlay til monolaget, altid i ligevægt varm agarose eller CMC i et 56 ° C varmt vand for at forhindre beskadigelse monolaget. Kontroller, at opløsningen er varm, men ikke varm at røre for at forhindre celledød og reducerede virustitere. De fleste agarose overlejringer vil begynde at størkne under 42 ° C, arbejde hurtigt og / eller forberede små partier for at forhindre størkning mens håndtering.
- Efter tilsætning af overlay, inkuberes pladerne til at producere forskellige plaques, der klart tælleligt. Plakdannelse kan tage 2-14 dage afhængigt af virus, der analyseres, tabel 1.
BEMÆRK: Når flydende overlejrede plader er placeret i inkubatoren ikke flytte dem. Bevægelse af de flydende overlays under inkubationsperioden vil resultere i udtværede plaques. Agarose og CMC overlays er halvfast og kan flyttes eller kontrolleres regelmæssigt under et lysmikroskop for at overvåge udviklingen af plaque.
3. Fastsættelse og farvning af celler
- At fikseres cellerne, hæld eller aspireres Avicel overlay og reparere celler ved anvendelse af 10% formaldehydopløsning i 30 minutter til natten over (<1 ml per brønd i en 6-brønds plade).
- For agarose eller CMC direkte tilføje formaldehyd løsning på overlay i 1 time til natten over.
BEMÆRK: Prøver kan opbevares i længere tid i fiksativ forudsat at det ikkeikke fordampe og tørre ud, da dette kan forvride monolaget.
- For agarose eller CMC direkte tilføje formaldehyd løsning på overlay i 1 time til natten over.
- Før farvning og efter fiksering, kasseres formaldehyd og fjerne halvfaste propper til agarose og CMC med enten rindende vand eller manuelt med en spatel. Skyl Avicel plaques med vand for at fjerne resterende overlay / fiksativ før farvning.
- Til farvning dække cellerne med en minimal mængde af krystalviolet opløsning for ~ 15 min. Rock plader hvis det er nødvendigt for at sikre en jævn dækning.
- Forsigtigt vaske krystalviolet pletten med vand. Når fikseret, farvet og tørret, opbevares plaques på ubestemt tid for fremtidig analyse.
4. Bestemmelse af virale titere
- Tæl plaques i hver brønd, idet gennemsnittet for eventuelle tekniske gentagelser af den samme fortynding. For store pladeformater, rabat brønde med færre end 5 eller større end 100 plaques. Vær opmærksom på plak størrelse og morfologi. Den negative kontrol bør have et ensartet monolag ogkan bruges som reference kontrol.
- Bestemme den virale titer af bestanden prøven ved at tage det gennemsnitlige antal plaques for en fortynding, og den inverse af den totale fortyndingsfaktor.
NOTE: Som et eksempel, 30 og 32 plaques talt for replikater af 1 x 10 -7 fortynding [31 (gennemsnit) / 10 -7 (fortynding) x 0,4 ml (inoculum)] vil give en titer på 7,75 x 10 8 pfu / ml.
Representative Results
Evne plakanalyser præcist at vurdere virustitere afhængig af en række faktorer: passende valg værtscelle, ordentlige medier og vækstbetingelser for cellulær og viral levedygtighed, immobiliseret viral formering, og en nøjagtig bestemmelse af den virale inkubationstid for at give tilstrækkelig tid til særskilt og countable plakdannelse.
Til denne undersøgelse blev virus fra tre repræsentative familier valgt at demonstrere forskelle i: overlay udvælgelse, inkubationsperioder og plakmorfologi tværs forskellige prøvetyper. Venezuelansk Equine Encephalitis (VEEV) blev valgt som et (+) ssRNA viral model, som kan forårsage betydelig sygdom hos heste og mennesker og repræsenterer Togaviridae familien. Influenza B Taiwan stamme, en segmenteret (-) ssRNA virus primært inficerer mennesker, repræsenterer Orthomyxoviridae familie. Rift Valley fever virus (RVFV), en (-) ssRNA leddyr født virus primært inficerer leddyrdrøvtyggere og mennesker, blev valgt som repræsentant for Bunyaviridae familien.
For RVFV (figur 1), blev titre bestemt ud fra en stamopløsning af en rekombinant levende svækket stamme af MP12 RVFV i en 12 brønds plade format udnytte CMC, agarose eller Avicel overlays som blev inkuberet side-by-side for 72 timer efter infektion (HPI). En repræsentativ plade viser fortyndinger i området fra 10 -4 til 10 -7 kan ses i Panel A. Plaques hjælp af CMC og agarose overlays viste små, klare og tydelige plaques med en veldefineret cirkulær grænse. Plaques med et flydende overlay var lidt mere rigelige og større i forhold til agarose og CMC plaques, og forudsat en mindre tydelig grænse. Virale titere blev sammenlignet i panel B med alle de overlays udfører sammenligneligt.
For at få et klarere visuel sammenligning mellem overlays til MP12 sammen med en større stikprøve for at bestemme reproduclitet, blev en 6-brønds plade også afprøves i tre eksemplarer (figur 2). I 6-brønds plade format, anvendelse af en CMC overlay viste mindre plaques end enten agarose eller flydende belægninger, som var sammenlignelig i størrelse til hinanden. Mens virustitere var ens mellem alle tre overlays (Panel D), plaques dannet i agarose og flydende overlays viste sig lettere at tælle på grund af deres øgede størrelse.
I modsætning til RVFV, VEEV titere og plakmorfologi blandt de forskellige overlays varierede markant (figur 3A). Plaques dannet i CMC overlejringer viste en klar og tydelig morfologi ved brug af en 12 brønds plade format, på bekostning af plak størrelse og følsomhed (Panel B). I modsætning til CMC, anvendelse af agarose og flydende overlays resulterede i signifikant større plaques, hvilket indikerer lavere viral hæmning og forøget følsomhed over for VEEV replikation. Dette blev allerede bekræftet, da der udelukkende sammenligner agarose versus CMC i apaper publiceret af Juarez et al. 4. Mens agarose og flydende overlays produceret større plaques end CMC, havde plaques dårligt definerede grænser og var vanskelige at tælle i en 12-brønds format med flydende overlays leverer den største grænse diffusion. Når plaques blev trialed i plader med 6 brønde (Figur 4), jo større 6 brøndsformatet negeret spørgsmålet om åbenlyst store plaques, der var vanskeligt at skelne i 12 brøndsformat med agarose og flydende overlays beviser overlegen i forhold til CMC overlejringer i form af plak definition og nænsomt (figur 4D).
I sammenligning med RVFV eller VEEV, influenza giver flere unikke udfordringer, når plaquing, såsom kravet om en ekstern protease. Følsomheden af influenzavirus til forskellige overlay markeringer er også blevet godt dokumenteret i fortiden som væsentlige ændringer er blevet bemærket, når ændringer som mindre som forskellige mærker af agarose have væreen brugt 9.
Interessant for influenza B Taiwan stamme, anvendelsen af CMC som en overlejring resulterede i markant mindre plaques, der var vanskelige at tælle og viste sig vanskeligt pålideligt score (figur 5A). Anvendelsen af en agarose overlay giver de bedste plaques (Panel C), og resulterede i en mørkere baggrund plet (sandsynligvis på grund af øget monolag levedygtighed), og viste klarere og skarpere plaques i direkte sammenligning med anvendelsen af den flydende overlay (Panel B ).
En klar fordel ved flydende polymerer end faste og halvfaste belægninger, såsom agarose og CMC, ligger i let fjernelse og anvendelse. Halvfaste overlays kræver opvarmning, og størkning kan bevise problematisk, når håndtering og fjernelse. For at udnytte disse fordele, og for at afgøre det praktiske i at udnytte Avicel i en high-throughput måde for RVFV blev en plade med 96 brønde format trialed ved varierende overlay Concentrations (figur 6). For RVFV MP-12, blev fortyndinger udført i fire eksemplarer på både 0,6 og 1,2% slutkoncentrationer Avicel. Overlay ansøgning og fjernelse bevist enkel, med ingen tydelig forskel mellem replikater eller mellem koncentrationer konstaterede, der påviser en høj grad af reproducerbarhed. Når lave, plaques var tydelig og countable med det blotte øje, at demonstrere gennemførligheden af at udnytte flydende overlejringer i en high throughput måde for RVFV.
Figur 1:. RVFV plaque overlay sammenligninger anvender plader med 12 brønde Veros blev udpladet ved 2,5 x 10 5 celler i plader med 12 brønde og inficeret med 200 pi under anvendelse af samme seriefortyndet startende prøve af MP12. Efter infektion 1,5 ml overlays på 0,3% agarose, 0,6% Avicel, eller 1% CMC (endelig concentrations), blev anvendt med henblik på direkte at sammenligne de overlejringer, som blev påvist i Panel A. Plaks talt og titreret i Panel B.
Figur 2:. RVFV plaque overlay sammenligninger anvender plader med 6 brønde Veros blev udpladet ved 5 x 10 5 celler i plader med 6 brønde og inficeret med 400 ul under anvendelse af samme seriefortyndet startende prøve af MP12. Tre ml overlays på 0,3% agarose, 0,6% Avicel eller 1% CMC, blev anvendt med henblik på direkte at sammenligne overlejringerne som demonstreret i panel A, B og C. separate eksperimenter udført på samme måde som beskrevet for Paneler AC, med plaques talt og titreret i Panel D (N = 3).
Figur 3: <strong> VEEV plaque overlay sammenligninger anvender plader med 12 brønde. Veros blev udpladet ved 2,5 x 10 5 celler i plader med 12 brønde og inficeret med 200 pi under anvendelse af samme seriefortyndet startende prøve af VEEV TC-83 vaccinestamme. Efter infektion 1,5 ml overlays på 0,3% agarose, 0,6% Avicel, eller 1% CMC, blev anvendt med henblik på direkte at sammenligne overlejringerne som demonstreret i panel A. Plaques blev talt og titreret i Panel B.
Figur 4:. V EEV plaque overlay sammenligninger anvender plader med 6 brønde Veros blev udpladet ved 5 x 10 5 celler i plader med 6 brønde og inficeret med 400 ul under anvendelse af samme seriefortyndet startende prøve af VEEV TC-83. Efter infektion, 3 ml overlays på 0,3% agarose, 0,6% Avicel, eller en 1% CMC, blev anvendt med henblik på direkte at sammenligne de overlejringer som påvisti panel A, B og C. separate forsøg udført på samme måde som beskrevet for panel A - C, med plaques tælles og titrerede i Panel D (N = 3).
Figur 5: Influenza plaque overlay sammenligninger MDCK-celler blev udpladet med 5 x 10 5 celler i plader med 6 brønde og inficeret med 400 pi inoculum anvender samme seriefortyndet startende prøve af Influenza B Taiwan.. Nr føtalt bovint serum (FBS) blev anvendt i medierne eller overlæg vækst, som FBS kan hæmme Influenza formering gennem hæmning af visse proteaser, som er nødvendige for viral fusion. TPCK-trypsin blev tilsat til alle de overlays før anvendelse for at lette viral fusion og indgang med værtscellerne. Efter infektion blev 3 ml overlays på 0,3% agarose, 0,6% Avicel eller 1% CMC anvendes for direkte at sammenligneoverlejringerne som påvist i panel A, B og C. separate eksperimenter blev udført på samme måde som beskrevet i panel A - C, med plaques tælles og titrerede i Panel D (N = 3). Mens en gennemsnitlig blev taget for CMC plaques de viste sig vanskeligt pålideligt tæller som de demonstrerede diffuse grænser og meget lille plakette størrelser.
Figur 6:. High throughput plaque overlays En 96-brønds plade af Veros udpladet ved 3 x 10 4 celler per brønd, blev inficeret med 50 pi af inoculum anvender samme seriefortyndet startende prøve af RVFV MP12 i 1 time i fire eksemplarer. For overlays, blev 0,6 og 1,2% slutkoncentrationer Avicel afprøves for at bestemme gennemførligheden og reproducerbarhed udnytte flydende overlejringer i en high-throughput måde, panel A og B.
| RVFV | VEEV | Influenza B | |
| Celletype | Vero | Vero | MDCK |
| Infektion periode | 1 time | 1 time | 45 min |
| Inkubationstid | Tre dage | 2 dage | Tre dage |
Tabel 1: plaqueanalyse Podning Betingelser og celletyper
| RVFV | VEEV | Influenza B | |
| Celletype | Vero | Vero | MDCK |
| Vækst Type | DMEM 1 | DMEM 1 | DMEM 2 |
| Plaque Media | 2xEMEM A | 2xEMEM A | 2xEMEM B |
1. Dulbeccos Modified Eagle Medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% L-glutamin, 1% Penicllin / Streptomycin.
2. Dulbeccos Modified Eagle Medium suppleret med 1% L-glutamin, 1% Penicllin / streptomycin, 0,2% bovint serumalbumin, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml.
A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) suppleret med 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 1% natriumpyruvat (5 ml), 1% L-glutamin (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml).
B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) suppleret med 0,2% bovint serumalbumin, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, trypsin-TPCK *
* Lige før forberedelse, tilsæt 1 pi hver 25ml 2 ug / ml bestand af TPCK-trypsin til portionen, du vil bruge til at blande med agarose for plaques.
Tabel 2: Plaque og Viral / Cellular Vækst Medias
| RVFV | VEEV | Influenza B | |
| Celletype | Vero | Vero | MDCK |
| Infektion periode | 1 time | 1 time | 45 min |
| Inkubationstid | Tre dage | 2 dage | Tre dage |
Overlay løsninger vil ikke udløber, når gjort så længe sterilitet opretholdes.
Tabel 3: Overlays Stock
| 6 brønde | 12 godt | 96 brønde | |
| # Af celler / brønd | 5 x 10 5 | 2,5 x 10 5 | 3 x 10 4 |
| Volumen af innoculum (pl) | 400 | 200 | 50 |
| volumen overlay (ml) | 3 | 1.5 | 0.100 |
Tabel 4: pladeformater
Discussion
Den mest afgørende faktor for en vellykket plakassay ligger i optimering af protokollen for den særlige viral kultur pågældende som betingelser kan variere betydeligt. Vigtige punkter at tage i betragtning: vært cellulær forenelighed med den pågældende virus, passende virale vækstbetingelser, tilstrækkelig fortynding intervaller for klart at skelne plaques, og korrekt overlay udvælgelse og farvning for celler og virus pågældende.
Mens VEEV og RVFV både vokse under meget lignende betingelser anvender mange af de samme vært celletyper varierer forskelle i plakmorfologi og vækstkinetik betydeligt. Ved anvendelse af Vero-celler for plaque assays, som traditionelt er blevet anvendt som en formering og indikator cellelinie til hæmoragisk feber virus og alphavira, VEEV typisk vokser til højere titre end RVFV og demonstrerer øget replikation kinetik, udvikling af store ensartede plaques på 48 hpi 4, 10-12. I modsætning til VEEV, RVFV kræver 72 hpi og viser plaques, som typisk er meget mindre og variabel i størrelse.
I modsætning til RVFV og VEEV, influenzavirus er meget værtscelle specifik og kan være vanskeligt at udbrede sig gennem vævskultur. For influenza virus, viral indgang og fusion normalt indledt af binding af celleoverfladereceptor med det virale glycoprotein hamagglutinin (HA), der medierer optagelse i målcellen ved binding med værtscellens α-sialinsyre overflade receptor. HA er en trimer glycoprotein der er til stede i kuvert membranen af alle Influenzavirus og kræver spaltning i subunits HA1 og HA2 af en særlig værtscelle protease. For yderligere at komplicere sagen, kan disse spaltningssteder ofte varierer mellem virusstammer 13. Som udtryk for proteaser stand til at spalte HA er begrænset til specifikke væv, proteaser are ofte tilsat cellekulturmediet for at lette viral fusion og indgang i den valgte værtscelle 13. TPCK-trypsin er et eksempel på et almindeligt anvendt protease, der anvendes i cellekultur med både MDCK og Vero-celler: lette multi-cyklus-replikation (i mangel af trypsin inaktiverer serum) gennem den proteolytiske aktivering af viral HA 14,15.
Som påvist i denne undersøgelse, og andre, kan forskelle i virale livscyklus påvirke overlay markeringer, pladeformater og indsamling gange, med betydelige afvigelser mellem forskellige klasser og arter af virus. I vores undersøgelse, agarose overlays vist tydeligere plaques ved højere titre end enten CMC eller flydende overlays for både RVFV og Influenza B virus, styrke dens anvendelighed blandt en bred vifte af vira og celletyper. Ved hjælp af en lav endelig koncentration af agarose i høj grad hjulpet med at fjerne de faste stik og forenklet farvning. CMC generelt vist poorest effektivitet som et overlay for alle tre testede vira og produceres meget små og utydelige plaques for influenza B virus. Selv om den samlede CMC vist de mindst ønskelige egenskaber, dets anvendelse i hurtigt voksende og ekstremt virulente vira kan vise sig fordelagtig, da det synes at reducere plak størrelse med kun en minimal reduktion i titer. Den flydende overlay viste sig at være den mest alsidige, at det var meget let at fremstille, øget brugervenlighed og var sammenlignelig med agarose tværs af alle de udvalgte vira. I en højere throughput 96-brønds plade-format, påføring og fjernelse blev ikke hæmmet på grund af størkning, som med traditionelle overlays, og forudsat nøjagtige og konsekvente resultater. En overvejelse, når anvendelse af flydende overlæg ligger i den uigennemsigtige farve og manglende evne til at overvåge plakdannelse da pladerne ikke kan flyttes, før det punkt, indsamling, begrænse denne tilpasning til vira med tidligere karakteriserede replikation kinetik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2x EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 °C |
| MEM 100x | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
References
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
