Abstract
Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van acute hersenen plakjes. Deze procedure is een essentieel element voor elektrofysiologische patch-clamp experimenten die in sterke mate de kwaliteit van de resultaten. Het is aangetoond dat het weglaten van de koelstap tijdens het snijden procedure voordelig verkrijgen gezonde segmenten en cellen, vooral dan wanneer het zeer myeline hersenstructuren van volwassen dieren. Hoewel het precieze mechanisme waarbij verhoogde temperatuur ondersteunt neurale gezondheid kan alleen worden gespeculeerd, is het logisch dat, waar mogelijk, de temperatuur waarbij het snijden wordt uitgevoerd moet dicht bij fysiologische omstandigheden voor temperatuur gerelateerde artefacten te voorkomen. Een ander belangrijk voordeel van deze methode is de eenvoud van de procedure en derhalve de korte bereidingstijd. In de aangetoonde werkwijze volwassen muizen worden gebruikt, maar dezelfde procedure kan worden toegepast jongere muizen en ratten. Ook de volgende patch clamp experiment wordt uitgevoerd op horizontale cerebellaire segmenten, maar dezelfde procedure kan ook worden gebruikt in andere vlakken en andere posterieure gebieden van de hersenen.
Introduction
Doel van de gepresenteerde methode is om hoogwaardige acute hersencoupes verkrijgen voor in vitro elektrofysiologische experimenten, zeker bij volwassenen of oudere dieren.
De acute brain slicing methode, zoals beschreven door Skrede en Westgaard 1 in twee elegante zinnen, is uitgegroeid tot een van de fundamenten van de moderne neurowetenschappen onderzoek en wordt gebruikt in talloze variaties wereldwijd. De kwaliteit van de segmenten wordt weerspiegeld in aantal levende neuronen per segment, de periode gedurende welke de cellen behouden hun elektrofysiologische en morfologische eigenschappen en de integriteit van het weefsel. Bovendien is de maximale stabiele opnames afhankelijk van de kwaliteit van de segmenten. Aldus langs de decennia de oorspronkelijke snijden methode is verder ontwikkeld door afzonderlijke onderzoeksgroepen plak herstel verbeteren na het snijden 2-10, vaak door complexe veranderingen van de samenstelling van het snijden or recovery oplossingen (zoals het toevoegen ascorbaat, thioureum of H 2 O 2) en intra-cardiale pre-perfusie van de dieren met gekoelde fysiologische oplossingen.
Zoals onlangs aangetoond 11, fysiologische temperatuur tijdens snijden lijkt gunstiger dan afkoelen tot neuronale gezondheid zijn; de verbetering is het meest opvallend bij het werken met volwassen (2-8 maand) knaagdieren. Het vermijden dramatische veranderingen temperatuur staat artefacten vanwege temperatuurafhankelijke processen in de cellen, zoals plasticiteit 13 en ionkanalen kinetiek 13,14. Dergelijke veranderingen kunnen membraan spanning en intracellulaire calcium signalering, spike drempel beïnvloeden, en spike vorm.
De "hot" acute slice voorbereiding hier gepresenteerde methode is een algemene procedure voor het verkrijgen van hoogwaardige acute hersenen plakjes vanaf elke regio hersenen, waaronder de kleine hersenen, de cortex en de hippocampus, hersenstamkernen 16 </ Sup> en de bulbus olfactorius, zowel in ratten en muizen.
Met name de fysiologische temperatuur slicing procedure vereist dat het snijmes trilt bijna perfect horizontaal en is zonder enige structurele defecten. Zulke precisie is misschien niet haalbaar met oudere snijmachine modellen zijn; in dergelijke gevallen raadzaam uitvoeren van de slice preparaat ijskoude omstandigheden als lage temperaturen lijkt het weefsel beter bestand tegen mechanische beschadiging, zelfs indien de kosten van metabole afwijkingen maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in dit protocol beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Hebrew University's Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van de oplossingen en tools voor het snijden
- Bereid 1 L standaard fysiologische oplossing (SPS) die de in tabel 1 beschreven ionen.
- Bereid een voorraadoplossing van de zouten op 10 maal de eindconcentratie vooraf een opslag glazen fles gevuld met 1000 ml gedeïoniseerd water (geleidbaarheid van 0,055 mS / cm). Zouten (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, en MgSO4) toe te voegen, en roer tot het volledig is opgelost. Bewaar de stockoplossing in 4 ° C.
- De uiteindelijke oplossing SPS op de dag van het experiment. Voeg 100 ml van de stockoplossing aan 700 ml gezuiverd water, los de glucose (3,6 g) en NaHCO3 (2,18 g) met magnetische roerstaaf en voeg vervolgens gezuiverd water tot 1 L.
- Equilibreer de solutidoor vergassing met 95% O2 / 5% CO2 gedurende ~ 20 minuten. Daarna, voeg 2 ml van 1 M CaCl2-oplossing.
- Monteer de volgende instrumenten (Figuur 1).
- Bereid grote schaar of ander gereedschap voor onthoofding, kleine chirurgische schaar voor het openen van de schedel, fijne punt tang voor het heffen van de schedel naar de hersenen bloot te leggen, scalpel met mes voor het ontleden van het gewenste deel van de hersenen om te worden gesneden en een kleine spatel voor het manipuleren van de ontleed hersendelen.
- Breng in kleine stukjes filtreerpapier voor het verwijderen van overtollige vloeistof van de hersenen, twee kleine petrischalen voor de hersenen ontleed in twee glazen 500 ml bekers voor met warm gezuiverd water en SPS en cyanoacrylaat lijm voor het lijmen van de hersenen naar de slicing podium.
- Bereid een kleine borstel voor het afhandelen van de plakken tijdens het snijden en een brede mond glazen Pasteur pipet voor het verplaatsen van de segmenten van de slicing bad aan het herstel chamber. Ontsmet de tools om de groei van bacteriën in de warme slice baden te voorkomen. Verder gebruik schone laboratorium handschoenen.
- Bereid een ondergedompeld slice recovery kamer zoals beschreven door Gibb en Edwards 15. Continu gas de SPS met 95% O2 / 5% CO2 en laten 36 ° C. Zorg ervoor dat de vergassing niet tot kleine bellen gevangen in het bad dat schijfjes kunnen beschadigen.
- Warm ~ 300 ml SPS tot 36 ° C op een verwarmingsplaat met magneetroerder of in een waterbad. Als een verwarmingsplaat wordt gebruikt, zorgen de oplossing tegen oververhitting, wat kan leiden tot precipitatie ion voorkomen. Indien namelijk warme nieuwe SPS plaats van koelen van het oude.
- Breng ~ 500 ml gezuiverd water aan de kook met behulp van een elektrische waterkoker en, in een bekerglas, combineer 300 ml van het met koud water om iets warmer water te verkrijgen dan het snijden temperatuur. Gebruik deze opgewarmd gezuiverd water tijdens de onthoofding en gebruik de Remaining van het gekookte water later voor het handhaven van de fysiologische temperatuur van de slicing bad.
- Verdoven de muis door het injecteren van 0,1 ml van pentobarbital (60 mg / ml) intraperitoneaal. Na een paar minuten controleren of het dier niet reageert op sterke teen of staart knijpt het ontbreken van gevoel vast te stellen.
2. Het ontleden van de hersenen
- Snel onthoofden de muis door het snijden van de hals met de grote schaar in de buurt van de achterkant van de schedel, en laat het hoofd vallen in het bekerglas met warm gezuiverd water af te spoelen overtollige bloed.
- Expose het foramen magnum in de schedel onder de nekspieren en de huid, eventueel verwijderen van meer van de hals met de kleine schaar.
- Trek de huid op de bovenkant van de schedel kunnen duidelijk de schedel hechtingen om geleidingsopening van de schedel.
- Snijd de schedel geopend door het invoegen van de onderste punt van de kleine schaar door het foramen magnum en onmiddellijk draaien ze in de richting vande laterale zijde. Voorzichtig snijden langs de laterale rand van de pariëtale bot tot een locatie achter de ogen en de frontoparietal hechtdraad; Vervolgens schakelt naar het midden van de schedel en dwars door de middellijn aan de andere kant van de schedel (zie groene stippellijn in figuur 2A).
- Met behulp van fijne punt tang, til de schedel van de frontoparietal hoek en trek het schuin naar boven en zijwaarts naar de hersenen bloot te leggen (zie de gele gestippelde pijl in figuur 2A). Zorg ervoor dat de schedel niet is verbonden aan een bot of de huid van het hoofd, zodat de hersenen op zijn plaats blijft wanneer de schedel wordt opgeheven. In het geval dat de hersenen in beweging is met de schedel, gebruik maken van de kleine schaar om elke bindweefsel tussen de schedel en de hersenen te verwijderen.
- Wanneer de hersenen wordt blootgesteld, staan niet toe dat de hersenen te droog zijn. Zo voert u de volgende stappen terwijl de schedel en de hersenen in een petrischaal gevuld met opgewarmd, vergast SPS.
- Trek het deel van de hersenen voor eXperiment van de rest van de hersenen met behulp van een scalpel en een spatel. Bij gebruik van het cerebellum, los van de voorhersenen van een snede door de middenhersenen en pons (langs rode lijnen in figuren 2B-D) en het verplaatsen naar een kleine petrischaal die vers bevat vergast SPS.
- Verwijder de hersenstam een rechte en brede basis voor het lijmen van de hersenen snijstadium snijden wanneer het cerebellum in horizontaal vlak vormen. Kort plaats het cerebellum op een nat stuk filterpapier, zodat de kant die werd gesneden uit de voorhersenen naar beneden is gericht.
- Snijd de hersenstam met een scalpel om de basis te vormen (zoals aangegeven met de blauwe lijn in figuur 2B), en de terugkeer van de kleine hersenen naar de bedrijfstoeslagregeling. Wanneer andere vlakken van het snijden zijn nodig, trim het cerebellum blok dienovereenkomstig (blauwe lijnen in de figuren 2C & D).
3. Het snijden van de hersenen
- Bereid de cutting fase door na te gaan dat het is dry, voor het aanbrengen van een kleine druppel superlijm in het midden van het podium.
- Til de hersenen blok van de SPS met een spatel met de juiste kant naar boven en verwijder de overtollige vloeistof uit de hersenen met behulp van kleine stukjes filtreerpapier. Dan, met een enkele beweging, schuift u de hersenen van de spatel op de druppel lijm op het podium.
- De hersenen uitdrogen en de lijm worden uitgevoerd op de zijden van het weefsel te voorkomen, enkele druppels van SPS met een Pasteur pipet en plaats het uitsnijden in de ruimte snijden. Lijn de hersenen blokkeren, zodat de regio's van belang (bijvoorbeeld, cerebellaire schors) worden geconfronteerd met het mes en zal dus worden onderworpen aan minste hoeveelheid mechanische druk voordat het wordt gesneden.
- Snijd elk plakje volgens de instructies van de fabrikant onder voortdurend vergassen de SPS in de snijkamer en de temperatuur op 34-37 ° C. Houd de temperatuur van de maaikamer op deze afstand door het vullen van de externeal kamer van de snijmachine met verwarmd gezuiverd water en het vervangen van het water wanneer de temperatuur te laag wordt.
OPMERKING: Het snijden parameters moet proefondervindelijk worden gevonden voor elk type weefsel en neuronen die worden onderzocht. Bij het Campden SMZ 700 slicer met keramische bladen en cerebellaire Golgi elementen altijd 0,75 mm trillingsamplitude bij 65 Hz en voortbewegingssnelheid van 0,05 mm / sec; voor nucleaire cerebellaire neuronen hogere amplitude en frequentie (1 mm en 90 Hz, respectievelijk) en langzamere snelheid toevoer (0,01-0,02 mm / sec) aanbevolen. Voor zowel Golgi en cerebellaire nucleaire neuronen, moet plakdikte zijn 300 micrometer. - Tijdens het snijden, niet toestaan dat de schijfjes op te vouwen op zichzelf. Voorkom dit door ze zachtjes ondersteunen met een zachte borstel, bij voorkeur het aanraken van het schijfje alleen in regio's die niet van belang zijn voor het experiment. Zorg ervoor om te voorkomen dat de borstel uit het aanraken van de vibratome mes; vooral bij de keramische bladen, zelfs een licht contactkan het mes beschadigen.
- Beweeg elke plak van de slicing kamer naar een herstel / nerkamer behulp van een brede mond, brand gepolijst glas Pasteur pipet.
- Laat de plakjes rusten in de kamer gedurende ten minste 1 uur voor de proef begon. Dit maakt afbraak van beschadigde of stervende weefsels en cellen en derhalve resulteert in een schonere slice oppervlak. Tijdens het eerste uur, houdt de temperatuur van de SPS in de kamer in het gebied van 34-36 ° C; ervoor te zorgen dat de schijfjes niet worden aangeraakt door luchtbellen die de schijfjes kunnen beschadigen of ze zweven.
4. Experiment
- Na 1 uur, laat het herstel kamertemperatuur afkoelen tot kamertemperatuur (17-25 ° C).
Opmerking: Dit zou de periode waarin de plakjes kunnen worden gebruikt door het vertragen van de groei van bacteriën en cellulair metabolisme verlengen. Deze periode is afhankelijk van het gebied in de hersenen en het type cel. Zo kunnen bepaalde typen Golgi cellen gevonden in gezonde segmenten zijn8 uur na het snijden, terwijl andere soorten laatste slechts 6 uur. - Na 1 uur is verstreken vanaf het in plakken snijden, gebruik maken van de schijfjes van verschillende elektrofysiologische experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plakjes bereid op de beschreven wijze kan worden gebruikt voor verschillende elektrofysiologische en optogenetic experimenten. In figuur 3A en 3C tonen wij een representatief voorbeeld van een horizontale cerebellaire slice en coronale cerebrale corticale plak respectievelijk bekeken onder differentiële interferentie (DIC) optiek. In de cerebellaire slice, kan verschillende soorten cerebellaire neuronen gemakkelijk herkend worden door hun locatie en mobiele vorm van het lichaam, waardoor gerichte elektrofysiologische opnames. In Figuur 3B en 3D, bijvoorbeeld sporen van whole-cell patch-clamp opnamen in stroomtang modus uit een spontaan actieve cerebellaire Golgicel en corticale piramidale cel worden weergegeven. Verdere voorbeelden van de kwaliteit van elektrofysiologische en optogenetic opnamen verkregen uit heet gesneden hersenen te vinden in Huang en Uusisaari 11 en Lefler et al. 16.
| concentratie [MM] | Gewicht (g / l) | |
| NaCl | 124 | 72.5 |
| KCl | 3 | 2.23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1,63 |
| MgSO4 * 6H 2 O | 1.9 | 4.3 |
| Glucose | 20 | 3.6 |
| NaHCO3 | 26 | 2.18 |
| CaCl2 | 2 | 1.109 |
Tabel 1. Samenstelling van de standaard fysiologische oplossing.
Figuur 1. Regeling van de gereedschappen. 1. Grote schaar, 2. Kleine chirurgische schaar, 3. Scalpel met mes # 11, 4. Fine tip pincet, 5. Kleine spatel, 6. Kleine petrischaaltjes, 7. Glazen beker voor gedemineraliseerd water, 8. Glazen beker voor opgewarmd Gassed fysiologische oplossing, 9. Super lijm, 10. dun penseeltje, 11. Pasteur pipet, 12. Kleine spuit, 13. Pentobarbital, 14. Filter papers, 15. Cutting podium.
. Figuur 2. Schematische weergave van de schedel en de hersenen dissectie (A) tekening die de opening van de schedel de hersenen bloot (B - D). Schematische tekeningen waarin de vlakken van het snijden van de hersenen van de drie grote vlakken snijden. De blauwe lijn geeft het vliegtuig waarop de hersenen zullen worden gelijmd.
Figuur 3. Representatieve resultaten van de methode. (A) een horizontale cerebellaire slice obtained met de bewezen methode. De drie belangrijkste lagen van de cerebellaire cortex (korrel cellaag, GC laag; Purkinje laag PN laag moleculaire laag ML) als witte stof (WM) zijn aangegeven. Een patch-clamp electrode is schematisch getekend op een Golgicel (GOC) (schaal bar: 40 pm). (B) bijvoorbeeld het opnemen van de Golgicel afgebeeld in A. De opname wordt verkregen met een patch-clamp electrode in current-clamp mode. (In zwart: vertegenwoordiger spoor van de zes grijze sporen). (C) een coronale cerebrale cortex slice verkregen met de bewezen methode. Corticale piramidale cellen worden getoond samen met een schematische tekening van een patch-clamp electrode. (D) bijvoorbeeld patch clamp opnamen, in stroomtang modus, van de piramidale cel weergegeven in (C). Klik hier voor een grotere versie van deze foto figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We tonen een werkwijze voor het bereiden van acute hersencoupes van muizen in fysiologische plaats ijskoude temperatuur.
Aangetoond is 11 dat de kwaliteit van de verkregen schijfjes warm blijft superieur vergeleken met die bereid met koude omstandigheden, mits de snijmachine mes heeft minimale verticale trillingen. Slicing in fysiologische temperatuur kunnen fysiologische artefacten veroorzaakt door de lage temperatuur, zoals die met betrekking tot veranderingen in de metabole processen 17-19 dat zich uit in afwijkingen van eencellige evenals netwerk gedrag te voorkomen. Bovendien, ook al is het snijden procedure duidelijk moet worden ingevuld, zonder onnodige vertraging, is er geen reden tot haast met het snijden (zoals het is als het snijden in ijskoude omstandigheden om te snijden afmaken voordat oplossingen te warm worden, en om het te voorkomen schade als gevolg van langdurige bevriezing van het weefsel). Zo kan langzamer snijsnelheden onsed. Dit kan nuttig zijn in geval van het snijden van zeer delicate structuren zijn. Laatste weglaten de koelstap van zowel de oplossingen en de hersenen vermindert de hoeveelheid tijd vereist voor de procedure en de complexiteit. Het afkoelen van de oplossing ijskoude temperatuur vereist ongeveer 40 min meer dan de opwarming van de oplossing tot fysiologische temperatuur, waardoor meer tijd voor het experiment zelf.
Aangetoond is 20 dat de intensiteit van fluorescentie in corticale neuronen in GAD67-GFP muizen sterker bij het onderzoek plakjes gesneden 20 ° C vergeleken met die gesneden 0 ° C. Dit ondersteunt verder het idee dat het snijden in de ijskoude temperatuur oefent een schadelijke invloed op de levensvatbaarheid van neuronen. Anderzijds, in hetzelfde papier werd aangetoond dat de dichtheid van fluorescente neuronen in plakjes verkregen bij 37 ° C vergeleken met die snijden bij 20 ° C werd verlaagd. De controverse over de resultaten zou kunnen arise van het feit dat de z-afbuiging niet werd onder overwegingen. Zoals hierboven vermeld, de z-afbuiging heeft een sterke invloed op het weefsel kwaliteit bij het snijden in fysiologische temperatuur, naast de kwaliteit van het blad en de snelheid en andere instellingen van de snijmachine.
Een van de cruciale onderdelen van de procedure omvat fine-tuning van de snijmachine mes alvorens te snijden. Anders dan bij gebruik ijskoude oplossingen waarbij het snijden waarschijnlijke betreft zowel horizontaal zagen als verticale "kraken" van de stijve lipidemembranen, onder fysiologische omstandigheden elke beweging van de snijmachine mes in de z-richting zal de schade weefsel. Om dit te minimaliseren, dient het blad zo hard en recht mogelijk zijn; in onze ervaring, conventionele scheermesjes te veel onvolkomenheden om bruikbaar te zijn. Hoogwaardig roestvrij stalen messen, speciaal ontworpen voor vibratome gebruik zijn beter, maar voor de beste resultaten raden we single-afgeschuind ceramic messen. Verder raden we besteden veel tijd voor een perfect horizontale uitlijning van de bladen, omdat dit een directe invloed op slice kwaliteit. We gebruiken Campden 700SMZ slicer dat afstemming van het blad aanpassing toestaat zodat de trilling in het z-vlak kleiner is dan 0,5 urn. Inderdaad, de meest cruciale beperking van de hete slicing methode is de afhankelijkheid van de snijmachine mes kwaliteit en stabiliteit. Als deze eisen niet kan worden voldaan, is het raadzaam om de traditionele ijskoude cutting methode te gebruiken in plaats, ondanks de nadelen in het snijden in ijskoude oplossing zoals wisselende osmolariteit van het zijn gedeeltelijk bevroren.
De werkwijze aangetoond wordt gebruikt om horizontale segmenten van het cerebellum verkrijgen; met eenvoudige aanpassingen dezelfde methode kan worden gebruikt om plakken krijgen ofwel de coronale of sagittale vlak van veel andere gebieden van de voor- - of middenhersenen en de hersenstam. Voor segmenten van de voorste delen van de voorhersenen en olfactory systeem, moet de schedel meer anterieure worden gesneden om beschadiging van deze onderdelen voorkomen. We doelbewust houden de werkwijze zo eenvoudig en kort mogelijk zijn en pre-perfusie van de dieren hanteren, noch wij alle componenten in de fysiologische oplossing voor het snijden vervangen. Hierdoor kan de werkwijze worden aangepast aan de specifieke neuronale subtype plaats. Het is waarschijnlijk dat wijzigingen van de snij oplossingen (zoals beschreven in de referenties in de inleiding) verder kan verbeteren de levensvatbaarheid van segmenten en robuustheid van de resultaten. In het algemeen moet de werkwijze verenigbaar met de meeste andere voorkomende fysiologische oplossingen gebruikt voor elektrofysiologische opname zijn.
In de hier getoonde werkwijze worden plakjes 300 pm dik. De optimale plakdikte afhankelijk van de gesneden hersengebied en de cellen van belang. Voor netwerk integriteit overwegingen dient de plakjes niet dunner zijn dan 250 urn, en vanwege diffusiebeperkingen de upper limiet van de slice dikte is ~ 400-450 micrometer.
Een kritische stap in deze werkwijze betreft het lijmen van de hersenen om het uitsnijden, omdat zelfs kleine instabiliteit in het weefsel kan ongelijkmatig of onbruikbaar segmenten. Daarom moet ervoor worden genomen om ervoor te zorgen dat de hersenen oppervlak heeft geen overtollige SPS wanneer het wordt neergelaten op de lijm druppel; Ook wordt te veel lijm resulteren in de hersenen liggen ongelijkmatig op het podium en eventueel loskomen van het podium tijdens snijden. Ook kan overtollige lijm kruipen op het weefsel en zijkanten, naast invoering inhomogeniteit in de plakken, kan het zaagblad beschadigd.
Er zijn een paar problemen die kunnen rijzen bij het wisselen van het snijden protocol uit het ijskoude methode om de gedemonstreerde hete methode. Eén van de problemen is het verschijnen van bacteriën in de plakjes. Om deze reden is het belangrijk om de gereedschappen, de kamer, en het snijden bad met ethanol voor de ingreep te desinfecteren. Ook draaienoff het verwarmingssysteem in het herstel bad na 1 uur vertraagt de groei van bacteriën.
Tenslotte moet worden benadrukt dat de verbeterde gezondheid van de neuronen in plakken gesneden in fysiologische temperatuur ook kan leiden tot veranderingen in hun intrinsieke eigenschappen. Daarom is het raadzaam om een eerste vergelijking van de verkregen schijfjes met zowel koude als warme methoden resultaten voeren, vooral als de experimenten van een langere project eerdere werk gedaan met behulp van koude methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
