Abstract
Nous présentons ici un protocole de préparation des tranches de cerveau de courte durée. Cette procédure est un élément essentiel pour électrophysiologiques expériences de patch-clamp qui détermine en grande partie la qualité des résultats. Il a été démontré que l'omission de l'étape de refroidissement durant la procédure de coupe est bénéfique pour obtenir des tranches et des cellules saines, en particulier lorsque des structures cérébrales fortement myélinisées provenant d'animaux adultes. Même si le mécanisme précis par lequel la température élevée favorise la santé de neurones ne peut être spéculé sur, il va de soi que, chaque fois que possible, la température à laquelle le découpage est effectué devrait être proche des conditions physiologiques pour éviter les artefacts liés à la température. Un autre avantage important de cette méthode est la simplicité de la procédure et donc le temps de préparation court. Dans la méthode illustrée souris adultes sont utilisés mais la même procédure peut être appliquée à des souris jeunes, ainsi que les rats. En outre, les cl de patch suivantsexpérience ampères est effectuée sur des tranches horizontales du cervelet, mais la même procédure peut également être utilisée dans d'autres plans, ainsi que d'autres zones postérieures du cerveau.
Introduction
Le but de la méthode présentée est d'obtenir des tranches de cerveau aigus de haute qualité pour des expériences électrophysiologiques in vitro, en particulier lors de l'utilisation adulte ou même des animaux anciens.
La méthode de découpage cerveau aiguë, comme décrit par Skrede et Westgaard 1 en deux phrases élégantes, est devenu l'un des fondements de la recherche en neurosciences modernes et est utilisé dans d'innombrables variations dans le monde entier. La qualité des tranches est reflété dans le nombre de neurones par tranche de vie, la période de temps pendant laquelle les cellules gardent leurs propriétés électrophysiologiques et morphologiques ainsi que l'intégrité du tissu. De plus, la durée maximale des enregistrements stables dépend de la qualité des tranches. Ainsi, le long des décennies, la méthode de découpage original a été développé par des groupes de recherche individuels pour améliorer la récupération de la tranche après la coupe 2-10, souvent par des modifications complexes de la composition de la coupe osolutions de récupération de r (telles que l'ajout d'ascorbate, de la thiourée ou même H 2 O 2) et de pré-perfusion intra-cardiaque de l'animal avec des solutions physiologiques refroidi.
Comme il a été récemment montré 11, température physiologique pendant le découpage semble être plus bénéfique que le refroidissement de la santé neuronale; l'amélioration est la plus frappante lorsque l'on travaille avec des adultes (2-8 mois) les rongeurs. Eviter les variations de température considérables empêche artefacts dus à des processus dépendant de la température dans les cellules, telles que la plasticité 13 et la cinétique des canaux ioniques 13,14. De tels changements pourraient influencer la tension de la membrane et de la signalisation intracellulaire de calcium, le seuil de pic, pic et forme.
La méthode "chaude" de la tranche aiguë de préparation présenté ici est une procédure générale pour obtenir des tranches de cerveau aigus de haute qualité à partir de toutes les régions du cerveau, y compris le cervelet, le cortex et l'hippocampe, le tronc cérébral noyaux 16 </ Sup>, ainsi que le bulbe olfactif, à la fois chez les rats et les souris.
En particulier, la procédure de découpe de la température physiologique nécessite que la lame de coupe vibre à peu près à l'horizontale, et est sans défaut de structure. Cette précision pourrait ne pas être réalisable avec des modèles de trancheuses âgées; dans de tels cas, nous vous recommandons d'effectuer la préparation de tranches dans des conditions de gel-froid comme la basse température semble rendre le tissu plus résistant aux dommages mécaniques, même si au prix d'aberrations métaboliques.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales décrites dans ce protocole a été approuvé par le soin des animaux de l'Université hébraïque et de l'emploi Comité.
1. Préparation des solutions et des outils pour couper
- Préparer 1 litre de solution physiologique standard (SPS) contenant des ions décrites dans le Tableau 1.
- Préparer une solution mère contenant les sels à 10 fois la concentration finale à l'avance dans une bouteille en verre de stockage rempli avec 1000 ml d'eau déminéralisée (conductance de 0,055 S / cm). Ajouter sels (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, et MgSO 4), et mélanger jusqu'à dissolution complète. Conserver la solution d'achat d'actions à 4 ° C.
- Ajouter la solution finale SPS, le jour de l'expérience. Ajouter 100 ml de la solution mère à 700 ml d'eau purifiée, dissoudre le glucose (3,6 g) et NaHCO 3 (2,18 g) en utilisant une barre d'agitation magnétique, puis ajouter de l'eau purifiée jusqu'à 1 L.
- Equilibrer les solutipar gazage avec 95% O 2/5% CO 2 pendant environ 20 min. Après cela, ajouter 2 ml de solution M CaCl 2 1.
- Assembler les outils suivants (figure 1).
- Préparez grands ciseaux ou un autre outil de décapitation, de petits ciseaux chirurgicaux pour l'ouverture du crâne, une pince à pointe fine pour soulever le crâne d'exposer le cerveau, un scalpel avec lame pour disséquer la partie souhaitée du cerveau à être tranchés et une petite spatule pour manipuler la parties du cerveau disséqués.
- En outre, la préparation de petits morceaux de papier filtre pour éliminer l'excès de liquide dans le cerveau, deux petites boîtes de Pétri pour le cerveau pour être disséqués dans deux verre de 500 ml béchers pour contenant de l'eau chauffée purifié et SPS, et de la colle cyanoacrylate pour le collage du cerveau à la étape de tranchage.
- Préparer une petite brosse pour la manipulation des tranches pendant le découpage et une pipette Pasteur en verre à large ouverture pour déplacer les tranches du bain de tranchage de la cha de récupérationmbre. Désinfecter les outils nécessaires pour empêcher la croissance des bactéries dans des bains chauds de tranche. En outre, utiliser des gants de laboratoire propres.
- Préparer une chambre de récupération de tranche submergé tel que décrit par Gibb et Edwards 15. De gaz sans interruption du SPS dans avec 95% O 2/5% de CO 2 et de garder à 36 ° C. Assurez-vous que le dégagement gazeux ne conduit pas à des petites bulles emprisonnées dans le bain qui pourrait endommager les tranches.
- Chaud ~ 300 ml de la SPS à 36 ° C sur une plaque chauffante avec agitateur magnétique ou dans un bain d'eau. Si une plaque de chauffage est utilisé, prendre soin d'éviter la solution de surchauffe, ce qui peut entraîner des précipitations d'ions. Dans le cas où il se produit, SPS frais chaudes au lieu du refroidissement de l'ancien.
- Apportez ~ 500 ml d'eau purifiée à ébullition à l'aide d'une bouilloire électrique et, dans un bécher, mélanger 300 ml d'eau froide avec à obtenir de l'eau légèrement plus chaude que la température de tranchage. Utilisez cette réchauffé l'eau purifiée au cours de la décapitation et utiliser le Remaition de l'eau bouillante par la suite pour maintenir la température physiologique du bain de tranchage.
- Anesthésier les souris par injection de 0,1 ml de pentobarbital (60 mg / ml) par voie intrapéritonéale. Après quelques minutes, vérifier que l'animal ne répond pas aux pieds ou de la queue pincées fortes pour vérifier l'absence de sensation.
2. Dissection du cerveau
- Décapiter la souris rapidement en coupant le cou avec les grands ciseaux près de l'arrière du crâne, et laissez la tête tomber dans le bécher avec réchauffé l'eau purifiée pour se rincer l'excès de sang.
- Exposer le foramen magnum dans le crâne dans les muscles du cou et de la peau, peut-être la suppression de plus de la nuque avec les petits ciseaux.
- Tirez la peau sur le dessus du crâne pour être en mesure de voir clairement les sutures du crâne afin de guider ouverture du crâne.
- Couper le crâne ouvert en insérant l'extrémité inférieure des petits ciseaux à travers le foramen magnum et immédiatement les tournant versle côté latéral. Couper délicatement le long du bord latéral de l'os pariétal jusqu'à un emplacement derrière les yeux et la suture fronto-pariétal; puis, se tourner vers le centre du crâne et couper à travers la ligne médiane de l'autre côté du crâne (voir la ligne verte en pointillés sur la figure 2A).
- Utiliser pince fine pointe de, soulevez le crâne de l'angle fronto-pariétal et tirez en diagonale et latéralement pour exposer le cerveau (voir flèche jaune en pointillés dans la figure 2A). Assurez-vous que le crâne est pas attachée à un os ou de la peau de la tête, de sorte que le cerveau va rester en place lorsque le crâne est levée. Dans le cas où le cerveau se déplace avec le crâne, utiliser les petits ciseaux pour enlever tout le tissu conjonctif entre le crâne et le cerveau.
- Quand le cerveau est exposé, ne permettent pas le cerveau pour être sec. Ainsi, effectuez les étapes suivantes tout en gardant le crâne et le cerveau dans une boîte de Pétri remplie de réchauffé, gazés SPS.
- Détachez la partie du cerveau utilisée pour eXperiment du reste du cerveau à l'aide d'un scalpel et d'une spatule. En cas d'utilisation du cervelet, se détacher du cerveau antérieur par une seule coupe à travers le mésencéphale et la protubérance (le long des lignes rouges dans les figures 2B-D) et le déplacer vers une petite boîte de Petri contenant fraîche, gazés SPS.
- Retirez le tronc cérébral pour former une base droite et large pour le collage du cerveau à l'étape de coupe lors du tranchage du cervelet dans le plan horizontal. Placer brièvement le cervelet sur une pièce humide de papier-filtre de sorte que le côté qui a été coupé à partir du cerveau antérieur est orientée vers le bas.
- Couper le tronc cérébral avec un scalpel pour former la base (comme indiqué par la ligne bleue dans la figure 2B), et retourner le cervelet à la SPS. Lorsque d'autres plans de coupe sont nécessaires, couper le bloc de cervelet en conséquence (lignes bleu dans les figures 2C et D).
3. Le découpage du cerveau
- Préparer la phase de coupe en vérifiant qu'il est Dry, avant d'appliquer une petite goutte de colle au milieu de la scène.
- Soulevez le bloc de cerveau de la SPS aide d'une spatule avec du bon côté, et enlever l'excès de liquide dans le cerveau à l'aide de petits morceaux de papier filtre. Puis, d'un seul mouvement, faites glisser le cerveau de la spatule sur la goutte de colle sur la scène.
- Pour éviter que le cerveau et le séchage de la colle à partir de l'exécution sur les côtés du tissu, appliquer quelques gouttes de SPS avec une pipette Pasteur et placer l'étape de découpe dans la chambre de coupe. Aligner le bloc de cerveau de sorte que les régions d'intérêt (par exemple, le cortex cérébelleux) sont confrontés à la lame et donc seront soumis à moins de pression mécanique avant d'être tranché.
- Couper chaque tranche selon les instructions du fabricant tout gazage constamment le SPS dans la chambre de coupe ainsi que le maintien de la température à 34-37 ° C. Maintenir la température de la chambre de coupe à cette gamme en remplissant le externechambre al de la trancheuse avec de l'eau purifiée chauffée et remplaçant l'eau dès que la température descend trop bas.
REMARQUE: Les paramètres de coupe doivent être expérimentalement trouvé pour chaque type de tissu et les neurones qui sont en cours d'examen. Dans le cas de la Campden SMZ 700 trancheuse à lame en céramique et des cellules de Golgi cérébelleux, utiliser 0,75 mm amplitude de vibration de 65 Hz et une vitesse de 0,05 mm / s avançant; amplitude de neurones cérébelleux supérieur nucléaires et la fréquence (1 mm et 90 Hz, respectivement) et la vitesse plus lente d'avance (0,01 à 0,02 mm / sec) est recommandé. Pour les deux Golgi et les neurones cérébelleux nucléaires, épaisseur de coupe doit être de 300 um. - Pendant le découpage, ne laissez pas les tranches de plier sur eux-mêmes. Pour éviter ceci, en les soutenant délicatement avec une brosse douce, de préférence de toucher la tranche que dans les régions qui ne sont pas d'intérêt pour l'expérience. Prenez soin d'éviter la brosse de toucher la lame de vibratome; en particulier dans le cas des lames en céramique, même un contact légerpeut endommager la lame.
- Déplacez chaque tranche de la chambre de coupe à une reprise / chambre de retenue en utilisant une large ouverture, pipette Pasteur en verre poli-le-feu.
- Laissez les tranches de repos dans la chambre pendant au moins 1 heure avant de commencer l'expérience. Cela permet à la dégradation des tissus et cellules endommagées ou mourir et se traduit par une surface de tranche propre ainsi. Au cours de la première heure, maintenir la température de la SPS dans la chambre dans la plage de 34 à 36 ° C; veiller à ce que les tranches ne sont pas touchés par les bulles d'air qui peuvent endommager les tranches ou les faire flotter.
4. Expérience
- Après 1 heure, laissez la température de la chambre de récupération refroidir à température ambiante (17-25 ° C).
Remarque: Il peut prolonger la période de temps pendant laquelle les tranches peuvent être utilisés en ralentissant la croissance des bactéries ainsi que le métabolisme cellulaire. Cette durée dépend de la région du cerveau et du type de cellule. Par exemple, certains types de cellules de Golgi se trouvent être en bonne santé dans des tranches8 heures après la coupe alors que d'autres types durer seulement 6 heures. - Après 1 heure, est passé de la découpe, utilisez les tranches de diverses expériences électrophysiologiques.
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Representative Results
Tranches préparées de la manière décrite peut être utilisée pour diverses expériences électrophysiologiques et optogénétiques. Dans la figure 3A et 3C, nous montrons un exemple représentatif d'une tranche horizontale du cervelet et du cortex cérébral une tranche coronale, respectivement, vu sous interférence différentiel (DIC) optique. Dans la tranche cérébelleuse, plusieurs types de neurones cérébelleux peuvent être facilement reconnus par leur forme et emplacement cellulaire corps, ce qui permet des enregistrements électrophysiologiques ciblées. Sur la figure 3B et 3D, par exemple des traces de cellules entières enregistrements de patch-clamp en mode de blocage de courant à partir d'une cellule de Golgi cérébelleuse spontanément actifs et les cellules pyramidales du cortex sont représentés. D'autres exemples de la qualité des enregistrements électrophysiologiques et optogénétiques obtenues à partir de cerveaux à chaud en tranches peuvent être trouvés dans Huang et Uusisaari 11 et Lefler et al., 16.
| concentration [mm] | poids (g / L) | |
| NaCl | 124 | 72,5 |
| KCl | 3 | 2.23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.63 |
| MgSO 4 * 6 H 2 O | 1,9 | 4.3 |
| Glucose | 20 | 3.6 |
| NaHCO 3 | 26 | 2.18 |
| CaCl2 | 2 | 1.109 |
Tableau 1. Composition de la solution physiologique standard.
Figure 1. Disposition des outils. 1. Grands ciseaux, 2. Les petits ciseaux chirurgicaux, 3. Scalpel avec lame n ° 11, 4. pinces fines de conseils, 5. Petite spatule, 6. petits plats de Pétri, 7. bécher en verre pour l'eau déminéralisée, 8. bécher en verre pour Gasse réchaufféd solution physiologique, 9. super colle, 10. pinceau fin, 11. pipette Pasteur, 12. Petit seringue, 13. pentobarbital, 14. Les papiers filtres, 15. étape de coupe.
. Figure 2. Représentation schématique du crâne et du cerveau dissection (A) Dessin représentant l'ouverture du crâne pour exposer le cerveau (B - D). Dessins schématiques décrivant les plans de coupe du cerveau pour les trois plans principaux de tranchage. La ligne bleue représente le plan sur lequel le cerveau sera collé sur.
Figure 3. Les résultats représentatifs de la méthode. (A) une tranche horizontale du cervelet obtained avec la méthode illustrée. Les trois principales couches du cortex cérébral (couche de granules de cellule, la couche CG, couche de neurones de Purkinje, la couche PN; couche moléculaire, ML) ainsi que de la substance blanche (WM) sont indiqués. Une électrode de patch-clamp est schématiquement dessiné sur une cellule de Golgi (GC) (barre d'échelle: 40 um). (B) par exemple l'enregistrement de la cellule de Golgi montré dans A. L'enregistrement est obtenue avec une électrode de patch-clamp en courant-clamp Mode. (En noir: trace représentant des six traces grises). (C) une tranche du cortex cérébral coronaire obtenue avec la méthode démontrée. Cellules pyramidales du cortex sont affichés avec un dessin schématique d'une électrode de patch-clamp. (D) exemple Patch clamp, en mode pince de courant, de la cellule pyramidale montré en (C). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous démontrons un procédé de préparation de coupes de cerveau de souris en aigus physiologique au lieu de la température de la glace.
Il a été démontré 11 que la qualité des tranches obtenues dans des conditions de chaleur est supérieure par rapport à ceux qui sont préparés avec des conditions de froid, à condition que la lame à trancher a un minimum de vibrations verticales. Tranchage de la température physiologique peut éviter des artefacts physiologiques causés par la basse température, tels que ceux liés aux changements dans les processus métaboliques 17-19 qui peuvent se manifester dans les aberrations de cellule unique ainsi que le comportement du réseau. En outre, même si la procédure de découpage doit évidemment être complété sans retards inutiles, il n'y a pas besoin de se dépêcher avec le découpage (comme il est quand trancher dans des conditions glacées afin de terminer la coupe avant que des solutions sont trop chaudes, et à empêcher la les dommages causés par le gel durable du tissu). Ainsi, des vitesses de coupe plus lents peuvent nous êtreéd. Ceci peut être bénéfique dans le cas de structures très délicates tranchage. Enfin, en omettant l'étape de refroidissement à la fois des solutions et du cerveau réduit considérablement la quantité de temps nécessaire pour la procédure, ainsi que leur complexité. Le refroidissement de la solution à la température de la glace nécessite environ 40 minutes de plus que le chauffage de la solution à la température physiologique, en laissant plus de temps pour l'expérience elle-même.
Il a été démontré 20 que l'intensité de fluorescence dans les neurones corticaux de souris de GAD67-GFP est plus forte lorsque l'on examine les tranches coupées en 20 ° C par rapport à ceux de coupe de 0 ° C. Voilà qui renforce l'idée que le tranchage de la température de la glace exerce une in fl uence néfaste sur la viabilité des neurones. D'autre part, dans le même document, il a été montré que la densité de neurones fluorescents a été réduite à tranchés obtenu à 37 ° C par rapport à celles coupe à 20 ° C. La controverse avec les résultats pourrait arisoi du fait que la déviation z n'a pas été prise en vertu des considérations. Comme mentionné ci-dessus, la déflexion z a une forte influence sur la qualité du tissu lors du tranchage de la température physiologique, en plus de la qualité de la lame et la vitesse et d'autres paramètres de la trancheuse.
Un des éléments essentiels de la procédure implique réglage fin de la lame à trancher avant de trancher. Contrairement à l'utilisation de solutions glacées où le tranchage implique probablement à la fois coupe horizontale ainsi que verticale "craquage" des membranes lipidiques rigides, dans des conditions physiologiques tout mouvement de la lame à trancher dans la direction z peut causer des dommages dans les tissus. Pour minimiser ce, la lame doit être aussi dur et aussi droit que possible; dans notre expérience, des lames de rasoir classiques ont trop nombreuses imperfections pour être utilisable. Lames en acier inoxydable de haute qualité spécialement conçus pour l'utilisation vibratome sont mieux, mais pour de meilleurs résultats nous suggèrent Ceram unique biseautélames IC. En outre, nous vous recommandons fortement de passer beaucoup de temps pour parfait alignement horizontal des lames car cela influence directement la qualité de tranche. Nous utilisons la trancheuse Campden 700SMZ qui permet un réglage de l'alignement de la lame de sorte que la vibration dans le plan z est inférieur à 0,5 um. En effet, la limitation la plus importante du procédé de découpage à chaud est sa dépendance à la qualité et à la stabilité de la lame de trancheuse. Si ces exigences ne peuvent être respectées, il est conseillé d'utiliser la méthode de coupe glacée traditionnelle à la place, malgré les inconvénients à trancher dans une solution glacée comme osmolarité variable d'être en partie gelé.
Le procédé montré est utilisée pour obtenir des tranches horizontales du cervelet; avec de simples modifications de la même méthode peut être utilisée pour obtenir des tranches soit dans la coronaire ou dans le plan sagittal, de nombreuses autres régions de l'avant - ou mésencéphale ainsi que le tronc cérébral. Pour les tranches des parties les plus antérieures du cerveau antérieur et Olfactsystème Ory, le crâne doit être coupé plus antérieur pour éviter d'endommager ces pièces. Nous gardons volontairement la méthode aussi simple et aussi court que possible et ne employons pas pré-perfusion de l'animal, ni ne nous substituons tous les composants de la solution physiologique pour la coupe. Cela permet au procédé d'être modifiée en fonction du sous-type neuronal spécifique d'intérêt. Il est probable que des modifications de solutions de découpe (comme décrit dans les références de l'Introduction) peuvent améliorer la viabilité des tranches et la robustesse des résultats. En général, le procédé doit être compatible avec la plupart des autres solutions physiologiques ordinaires communément utilisées pour l'enregistrement électrophysiologique.
Dans la méthode présentée ici, les tranches sont coupées 300 um d'épaisseur. L'épaisseur de tranche optimale dépend de la région du cerveau en tranches et les cellules d'intérêt. Pour des considérations d'intégrité du réseau, les tranches ne doivent pas être plus mince que 250 um, et en raison des limitations de la diffusion vers le hautpar la limite de l'épaisseur de la tranche est ~ 400-450 um.
Une étape critique dans ce procédé concerne le collage du cerveau à l'étape de découpage, en tant que petit instabilité même dans les tissus peut entraîner des tranches inégales ou inutilisables. Ainsi, il faut prendre soin de s'assurer que la surface du cerveau a pas d'excès SPS quand il est descendu sur la chute de la colle; En outre, trop de colle entraîne dans le cerveau se trouvant de façon inégale sur la scène et, éventuellement, détacher de la scène pendant le tranchage. En outre, l'excès de colle peut se glisser sur les côtés du tissu et, en plus de l'introduction d'hétérogénéité dans les tranches, pourrait endommager la lame.
Il ya quelques difficultés qui pourraient augmenter lors du changement de protocole de tranchage de la méthode de la glace à la méthode à chaud démontré. L'une des difficultés est l'apparition de bactéries dans les tranches. Pour cette raison, il est important de désinfecter les outils, la chambre et le bain de tranchage avec de l'éthanol avant l'intervention. De plus, en tournantarrêt du système de chauffage dans le bac de récupération après une heure ralentit la croissance de bactéries.
Enfin, il convient de souligner que l'amélioration de la santé des neurones dans des tranches coupées en température physiologique peut également entraîner des changements dans leurs propriétés intrinsèques. Par conséquent, il est conseillé d'effectuer une première comparaison des résultats obtenus à partir de tranches avec les deux méthodes froides et chaudes, en particulier si les expériences font partie d'un projet plus avec des travaux antérieurs effectués en utilisant la méthode à froid.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
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