Abstract
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung der akuten Hirnschnitten. Dieses Verfahren ist ein kritisches Element für elektrophysiologische Patch-Clamp-Experimenten, die weitgehend die Qualität der Ergebnisse bestimmt. Es hat sich gezeigt, dass das Weglassen der Kühlschritt während des Schneidverfahrens ist vorteilhaft beim Erhalt gesunder Scheiben und Zellen, insbesondere beim Umgang mit hoch myelinisierten Hirnstrukturen aus reifen Tieren. Obwohl der genaue Mechanismus, durch erhöhte Temperatur unterstützt neuronalen Gesundheit kann nur spekuliert werden, liegt es nahe, daß, wenn möglich, die Temperatur in dem das Schneiden durchgeführt wird, sollte in der Nähe von physiologischen Bedingungen, um temperaturbedingte Artefakte zu vermeiden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist die Einfachheit des Verfahrens und damit die kurzen Vorbereitungszeit. In der Methode nachgewiesen erwachsenen Mäusen werden verwendet, aber die gleiche Prozedur kann mit jüngeren Mäusen als auch Ratten angewendet werden. Auch die folgenden Patch clamp Experiment auf horizontalen Kleinhirnschnitten durchgeführt, aber die gleiche Prozedur kann auch in anderen Ebenen als auch andere hinteren Bereichen des Gehirns verwendet werden.
Introduction
Das Ziel der vorgestellten Methode ist es, qualitativ hochwertige akuten Hirnschnitten für die in vitro elektrophysiologischen Experimenten bekommen, vor allem bei der Verwendung von Erwachsenen oder sogar alte Tiere.
Die akute Hirnschneidverfahren, wie von Skrede und Westgaard 1 in zwei eleganten Sätzen beschrieben, hat sich zu einer der Grundlagen der modernen neurowissenschaftlichen Forschung und wird weltweit in unzähligen Variationen beschäftigt. Die Qualität der Schichten wird in der Anzahl der lebenden Neuronen pro Schicht reflektiert wird, die Zeitdauer, während welcher die Zellen behalten ihre elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften als auch die Integrität des Gewebes. Außerdem ist die maximale Dauer für einen stabilen Aufzeichnungen hängt von der Qualität der Schichten. Somit entlang der Jahrzehnte die ursprüngliche Schneidverfahren wurde weiter von einzelnen Forschungsgruppen entwickelt Scheibe Erholung nach dem Schneiden 2-10, die durch komplexe Modifikationen der Zusammensetzung der Schneide erweitern or Recovery-Lösungen (wie Hinzufügen Ascorbat, Thioharnstoff oder auch H 2 O 2) als auch intrakardiale Perfusion vorge des Tieres mit gekühlten physiologischen Lösungen.
Wie kürzlich gezeigt, 11 scheint physiologischer Temperatur während des Schneidens als vorteilhafter als Kühl neuronale Gesundheit; die Verbesserung ist auffälligsten bei der Arbeit mit Erwachsenen (2-8 Monate) Nagetiere. Vermeidung dramatische Temperaturänderungen verhindert Artefakte aufgrund von temperaturabhängigen Prozesse in den Zellen, wie Plastizität 13 und Ionenkanäle Kinetik 13,14. Solche Änderungen können Membranspannung und der intrazellulären Calcium-Signalgebung, spitze Schwelle beeinflussen, und Spike Form.
Die "heiße" akute Schnittpräparat hier vorgestellte Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zur Gewinnung hochwertiger akuten Hirnschnitten von jeder Region des Gehirns, einschließlich des Kleinhirns, die Cortex und Hippocampus, Hirnstammkerne 16 </ Sup> und Riechkolben, die beide in Ratten und Mäusen.
Bemerkenswert ist, erfordert die physiologische Temperatur Slicing Verfahren, dass die Schneidklinge schwingt nahezu perfekt horizontal und ist ohne bauliche Mängel. Eine solche Präzision vielleicht nicht erreichbar mit älteren Slicer Modelle; In solchen Fällen empfehlen wir die Durchführung der Schnittpräparat in eiskalten Bedingungen wie die niedrige Temperatur scheint das Gewebe widerstandsfähiger gegen mechanische Beschädigungen, auch wenn auf Kosten der Stoffwechselfehler zu machen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Hebräischen Universität Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Herstellung der Lösungen und Werkzeuge für Slicing
- Herstellung von 1 l physiologischen Standardlösung (SPS) mit den in Tabelle 1 beschriebenen Ionen.
- Vorbereitung einer Stammlösung, die die Salze von 10-fachen der Endkonzentration im Voraus in einem Speicherglasflasche mit 1000 ml entionisiertem Wasser (Leitfähigkeit von 0,055 & mgr; S / cm) gefüllt. Hinzufügen Salze (NaCl, KCl, KH 2 PO 4 und MgSO 4), und Rühren, bis es vollständig gelöst ist. Bewahren Sie die Stammlösung in 4 ° C.
- Die endgültige SPS-Lösung am Tag des Experiments. 100 ml der Stammlösung zu 700 ml gereinigtem Wasser unter Verwendung magnetischer Rührstab lösen das Glucose (3,6 g) und NaHCO 3 (2,18 g) und dann Hinzufügen von gereinigtem Wasser bis zu 1 l
- Gleichgewicht kommen die solutiauf durch Begasung mit 95% O 2/5% CO 2 für ~ 20 min. Danach fügen Sie 2 ml 1 M CaCl 2 -Lösung.
- Montieren Sie folgende Werkzeuge (Abbildung 1).
- Bereiten Sie große Schere oder einem anderen Werkzeug für Enthauptung, kleine chirurgische Scheren zum Öffnen des Schädels, um feine Spitze Pinzette zum Anheben des Schädels, um das Gehirn freizulegen, Skalpell mit Klinge zum Sezieren den gewünschten Teil des Gehirns in Scheiben geschnitten werden und eine kleine Spachtel zur Manipulation der seziert Hirnteile.
- Außerdem bereiten kleine Stücke von Filterpapier zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit aus dem Gehirn, zwei kleine Petrischalen für das Gehirn in zwei 500 ml Becherglas zur Aufnahme erwärmt gereinigtes Wasser und SPS, und Cyanacrylat-Klebstoff zum Verkleben des Gehirns, die zerlegt werden Slicing Bühne.
- Bereiten Sie eine kleine Bürste für die Handhabung der Scheiben während der Schneiden und einem breiten Mund Glas Pasteurpipette zur Bewegung der Scheiben von der Schneide Bad zur Erholung chamber. Desinfizieren Sie die Werkzeuge, um das Wachstum von Bakterien in den warmen Scheibe Bäder verhindern. Darüber hinaus verwenden saubere Laborhandschuhe.
- Bereiten Sie einen untergetauchten Slice Rückgewinnungskammer wie von Gibb und Edwards 15 beschrieben. Kontinuierlich Gas die SPS in ihm mit 95% O 2/5% CO 2 und halten bei 36 ° C. Stellen Sie sicher, dass die Begasung nicht in kleinen Blasen in der Badewanne, die Scheiben beschädigen könnten gefangen führen.
- Warm ~ 300 ml der SPS bis 36 ° C auf einer Heizplatte mit Magnetrührer oder in einem Wasserbad. Wenn eine Heizplatte verwendet wird, kümmern sich um die Lösung von Überhitzung, die in Ionen Fällung führen kann. Im Falle kommt es vor, warme Frisch SPS statt Kühl die alte.
- Bringen ~ 500 ml gereinigtem Wasser zum Kochen mit einem elektrischen Wasserkocher und in ein Becherglas, kombiniert 300 ml davon mit kaltem Wasser, um etwas wärmer Wasser als der Slicing Temperatur zu erhalten. Verwenden Sie diese erwärmt gereinigtes Wasser während der Enthauptung und verwenden Sie die Leistungsbezogenening des abgekochtes Wasser später für die Aufrechterhaltung der physiologischen Temperatur des Slicing-Bad.
- Betäuben die Maus durch Injektion von 0,1 ml von Pentobarbital (60 mg / ml) intraperitoneal verabreicht. Nach ein paar Minuten kontrollieren, ob das Tier nicht zu stark Zehe oder Schwanz drückt reagieren, um den Mangel der Empfindung zu ermitteln.
2. Präparieren des Gehirns
- Enthaupten Sie die Maus schnell durch Schneiden der Hals mit den großen Schere in der Nähe der Rückseite des Schädels, und lassen Sie den Kopf in den Becher mit erwärmtem gereinigtem Wasser abzuspülen überschüssiges Blut sinken.
- Setzen Sie das Foramen magnum in den Schädel unter der Nackenmuskulatur und der Haut, möglicherweise das Entfernen des Hals mit dem kleinen Schere.
- Ziehen Sie die Haut auf der Oberseite des Schädels in der Lage sein, um die Schädelnähte deutlich sehen, um das Öffnen des Schädels Führer sein.
- Schneiden Sie den Schädel öffnen, indem Sie die untere Spitze der kleinen Schere durch das Foramen magnum und sofort wandeln sie in Richtungdie laterale Seite. Vorsichtig entlang der Seitenkante des Scheitelbeins bis zu einer Stelle hinter den Augen und dem frontoparietal Naht abgeschnitten; dann biegen Sie in Richtung der Mitte des Schädels und über die Mittellinie auf die andere Seite des Schädels geschnitten (siehe grüne gestrichelte Linie in Abbildung 2a).
- Mit feiner Spitze Pinzette, heben Sie den Schädel von der frontoparietal Ecke und ziehen Sie sie schräg nach oben und zur Seite, um das Gehirn ausgesetzt werden (siehe gelben gestrichelten Pfeil in Abbildung 2a). Stellen Sie sicher, dass der Schädel ist nicht auf einen Knochen oder Haut des Kopfes angebracht ist, so dass das Gehirn wird an Ort und Stelle bleiben, wenn der Schädel wird angehoben. Im Falle, dass das Gehirn mit dem Schädel bewegen, verwenden Sie die kleine Schere, jede Bindegewebe zwischen dem Schädel und dem Gehirn zu entfernen.
- Wenn das Gehirn ausgesetzt ist, nicht zulassen das Gehirn trocken sein. So führen Sie die nächsten Schritte, während die Schädel und das Gehirn in einer Petrischale mit erwärmt gefüllt, vergast SPS.
- Nehmen Sie den Teil des Gehirns für e verwendetXperiment vom Rest des Gehirns mit einem Skalpell und einem Spatel. Im Falle der Verwendung des Kleinhirns, lösen sich von der Vorderhirn durch einen einzigen Schnitt durch das Mittelhirn und Pons (entlang der roten Linien in den 2B-D) und verschieben Sie sie in eine kleine Petrischale, die frisch enthält, vergast SPS.
- Entfernen Sie den Hirnstamm, eine gerade und breite Basis für die Verklebung das Gehirn Schneidstufe beim Schneiden das Kleinhirn in horizontaler Ebene zu bilden. Kurz legen Sie das Kleinhirn auf einem nassen Stück Filterpapier, so dass die Seite, die aus dem Vorderhirn geschnitten wurde nach unten zeigt.
- Schneiden Sie den Hirnstamm mit einem Skalpell, um die Basis zu bilden (wie bei der blauen Linie in 2B angegeben) und schicken Sie das Kleinhirn an die SPS. Wenn andere Ebenen der Schneid nötig sind, schneiden Sie die Kleinhirn-Block entsprechend (blaue Linien in den 2C & D).
3. Schneiden des Gehirns
- Bereiten Sie den Schneidstufe durch die Ermittlung, dass es dry, bevor ein kleiner Tropfen Superkleber in der Mitte der Bühne.
- Heben Sie das Gehirn Block von der SPS mit einem Spatel mit der richtigen Seite nach oben, und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem Gehirn mit kleinen Stücken von Filterpapier. Dann, mit einem einzigen Bewegung, schieben das Gehirn vor dem Spatel auf die Tropfen Kleber auf der Bühne.
- Um das Gehirn vor dem Trocknen und den Kleber vom Laufen auf den Seiten des Gewebes zu verhindern, ein paar Tropfen von SPS mit einer Pasteurpipette und platzieren Sie den Schneidstufe in der Schneidekammer. Ausrichten des Gehirns blockieren, so dass die Bereiche von Interesse (zB Kleinhirnrinde) sind gegenüber der Klinge und somit zur geringsten mechanischen Druck, bevor es geschnitten unterworfen werden.
- Schneiden Sie jede Scheibe nach den Anweisungen des Herstellers, während er ständig Begasung des SPS in der Schneidkammer sowie die Temperatur bei 34 bis 37 ° C. Halten Sie die Temperatur der Schneidkammer in diesem Bereich durch Befüllen des external Kammer der Slicer mit erwärmtem gereinigtem Wasser und Ersetzen des Wassers, wenn die Temperatur zu niedrig fällt.
HINWEIS: Die Slicing Parameter müssen experimentell für jede Art von Gewebe und Nervenzellen, die untersucht werden gefunden werden. Im Falle des Campden SMZ 700 Schneider mit Keramikschaufeln und zerebelläre Golgi-Zellen verwenden 0,75 mm Schwingungsamplitude bei 65 Hz und die Vorschubgeschwindigkeit von 0,05 mm / sec; für Kleinhirnkern Neuronen höherer Amplitude und Frequenz (1 mm und 90 Hz, jeweils) und langsamer Vorschubgeschwindigkeit (0,01-0,02 mm / sec) empfohlen. Für beide Golgi und Kleinhirnkernneuronen sollte Schichtdicke 300 & mgr; m. - Während der Schneiden, erlauben nicht die Scheiben an sich selbst zu falten. Verhindern Sie dies, indem Sie vorsichtig unterstützt sie mit einer weichen Bürste, vorzugsweise nur in Bereichen, die nicht von Interesse für das Experiment sind Berühren der Scheibe. Achten Sie darauf, den Pinsel vom Berühren der Vibratom Klinge zu verhindern; insbesondere im Falle der keramischen Blätter, sogar ein leichter Kontaktkann die Klinge beschädigen.
- Bewegen Sie jede Scheibe von der Schneidekammer zu einer Erholung / Haltekammer mit einem breiten Mund, feuerpolierte Glaspasteurpipette.
- Lassen Sie die Scheiben ruhen in der Kammer für mindestens 1 Stunde vor dem Start des Experiments. Dies ermöglicht den Abbau geschädigter oder sterbende Zellen und Gewebe und führt zu einer saubereren Scheibenoberfläche bei. Während der ersten Stunde, Halten der Temperatur des SPS in der Kammer im Bereich von 34-36 ° C; sicherzustellen, dass die Scheiben nicht durch Luftblasen, die die Scheiben beschädigen oder sie schwimmen kann berührt.
4. Experiment
- Nach 1 Stunde, lassen die Erholung Kammertemperatur abkühlen auf RT (17-25 ° C).
Anmerkung: Dies kann die Zeitdauer, während der die Scheiben durch die Verlangsamung des Wachstums von Bakterien und Zellstoffwechsels verwendet werden, zu verlängern. Dieser Zeitraum ist abhängig von der Gehirnregion und Zelltyp. Beispielsweise können bestimmte Arten von Golgi-Zellen gefunden werden gesund in Scheiben zu sein8 Stunden nach dem Schneiden während andere Arten dauern nur 6 Stunden. - Nach 1 Stunde wurde aus dem Slicing geben, verwenden Sie die Scheiben für die verschiedenen elektrophysiologischen Experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Scheiben in der beschriebenen Weise hergestellt wurden, können für verschiedene elektrophysiologische und optogenetische Experimente eingesetzt werden. In 3A und 3C zeigen wir ein repräsentatives Beispiel eines horizontalen Kleinhirnscheibe und einem koronalen Gehirnrindenscheibe jeweils unter Differentialinterferenz (DIC) Optik angesehen. In der Klein Scheibe, können verschiedene Arten von Kleinhirn-Neuronen leicht durch ihre Lage und Zellkörperform erkannt werden, so dass gezielt elektrophysiologischen Ableitungen. In 3B und 3D zeichnet Beispiel aus Ganzzell patch-clamp Ableitungen in Stromzange Modus aus einem spontan aktiven Kleinhirn Golgi Zelle und kortikalen Pyramidenzellen gezeigt. Weitere Beispiele für die Qualität der elektrophysiologischen und optogenetischen Aufnahmen von hot-Scheiben geschnitten Gehirne erhalten kann Huang und Uusisaari 11 und Lefler et al. 16 zu finden.
| Konzentration [mm] | Gewicht (g / L) | |
| NaCl | 124 | 72,5 |
| KCl | 3 | 2,23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1,63 |
| MgSO 4 * 6 H 2 O | 1,9 | 4.3 |
| Glucose | 20 | 3,6 |
| NaHCO3 | 26 | 2,18 |
| CaCl 2 | 2 | 1,109 |
Tabelle 1. Zusammensetzung der physiologischen Standardlösung.
Abbildung 1. Anordnung der Werkzeuge. 1. Big Schere, 2. Kleine chirurgische Scheren, 3. Skalpell mit Klinge # 11, 4. Feine Spitze Pinzette, 5. Kleine Spachtel, 6. Kleine Petrischalen, 7. Becherglas für VE-Wasser, 8. Becherglas erwärmt gassed physiologischen Lösung, 9. Superkleber, 10. dünnen Pinsel, 11. Pasteur-Pipette, 12. Kleine Spritze, 13. Pentobarbital, 14 Filterpapiere, 15. Cutting Bühne.
. Abbildung 2. Schematische Darstellung der Schädel und Gehirn Dissektion (A) Zeichnung, die die Öffnung des Schädels, um das Gehirn freizulegen (B - D). Schematische Zeichnungen beschreibt die Ebenen der Schneiden des Gehirns für die drei großen Schnittebenen. Die blaue Linie stellt die Ebene, auf die das Gehirn wird aufgeklebt werden.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der Methode. (A) eine horizontale Scheibe o zerebelläremit dem nachgewiesen Verfahren btained. Die drei Hauptschichten der Kleinhirnrinde (Körnerzellschicht, GC Schicht; Purkinje Neuronenschicht, PN Schicht; molekulare Schicht, ML) als auch der weißen Substanz (WM) angezeigt. Ein Patch-Clamp-Elektrode ist schematisch auf einen Golgi-Zelle (GOC) (Maßstab: 40 & mgr; m) aufgestellt. (B) beispielsweise die Aufnahme von der in A gezeigt Golgi Zell Die Aufnahme wird mit einem Patch-Clamp-Elektrode in Current-Clamp erhalten Modus. (In schwarz: repräsentative Spur von sechs Grauspuren). (C) einen koronalen Gehirnrindenscheibe mit der nachgewiesenen Methode erhalten. Pyramidenzellen der Hirnrinde werden zusammen mit einer schematischen Zeichnung eines Patch-Clamp-Elektrode gezeigt. (D) beispielsweise Patch-Clamp-Aufzeichnung, in Stromzange Modus aus der in (C) gezeigt Pyramidenzelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir zeigen ein Verfahren zur Herstellung von akuten Gehirnschnitten von Mäusen in physiologischer statt eiskalter Temperatur.
Es wurde gezeigt, dass 11 die Qualität der Scheiben in warmen Bedingungen erhaltenen überlegen ist, wenn sie mit denen mit kalten Bedingungen hergestellt verglichen, vorausgesetzt, daß die Schneidklinge eine minimale vertikale Vibration. Slicing in physiologischer Temperatur können physiologische Artefakte durch die niedrige Temperatur verursacht werden, wie sie auf Veränderungen im Stoffwechsel 17-19, die in Abweichungen von Einzelzelle sowie das Netzwerkverhalten zu manifestieren kann, verhindert werden. Außerdem, obwohl das Slicing Verfahren sollte offensichtlich ohne unnötige Verzögerungen durchgeführt werden, gibt es keine Notwendigkeit, mit der Aufschnitt beeilen (wie es beim Schneiden in eiskaltem Bedingungen, um Schneid beenden, bevor Lösungen zu warm werden, und um das zu verhindern Schäden durch lang anhaltende Einfrieren des Gewebes). So können langsamere Schnittgeschwindigkeiten unsed. Dies kann von Vorteil für den Fall des Schneidens sehr empfindliche Strukturen sein. Last, jedoch ohne den Kühlschritt der beiden Lösungen und des Gehirns reduziert die Zeit für das Verfahren als auch die Komplexität erforderlich. Die Abkühlung der Lösung auf eiskaltes Temperatur erfordert etwa 40 min mehr als die Erwärmung der Lösung auf physiologische Temperatur, so dass mehr Zeit für das Experiment selbst.
Es wurde gezeigt, dass 20 die Intensität der Fluoreszenz in kortikalen Neuronen in GAD67-GFP-Mäuse ist stärker, wenn die Prüfung in Scheiben schneiden 20 ° C im Vergleich mit denen in 0 ° C geschnitten. Dies unterstützt weiter die Vorstellung, dass das Schneiden in eiskaltem Temperatur übt einen schädlichen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Neuronen. Andererseits wird in dem gleichen Papier wurde gezeigt, dass die Dichte der fluoreszierenden Neuronen in Scheiben geschnitten wurde bei 37 ° C, erhalten im Vergleich zu denen bei 20 ° C geschnitten reduziert. Der Streit mit den Ergebnissen könnte arisich aus der Tatsache, dass die z-Ablenkung nicht unter Überlegungen gemacht. Wie oben erwähnt, hat die z-Ablenkung einen starken Einfluss auf die Qualität des Gewebes beim Schneiden in physiologischer Temperatur, neben der Qualität der Klinge und der Geschwindigkeit und andere Einstellungen des Slicers.
Einer der entscheidenden Teile des Verfahrens beinhaltet die Feinabstimmung der Schneidklinge vor dem Schneiden. Anders als bei der Verwendung von eiskaltem Lösungen, bei denen das Schneiden wahrscheinlich beinhaltet sowohl horizontale Schneid sowie vertikale "Knacken" der starren Lipidmembranen, die unter physiologischen Bedingungen wird jede Bewegung der Schneidklinge in der z-Richtung werden Schäden im Gewebe verursachen. Um dies zu minimieren, sollte die Klinge so hart und gerade wie möglich sein; Nach unserer Erfahrung haben herkömmliche Rasierklingen zu viele Unvollkommenheiten verwendbar zu sein. Hochwertige Edelstahlklingen speziell für Vibratom Nutzung konzipiert sind besser, aber für beste Ergebnisse empfehlen wir Einzel abgeschrägte ceramic Klingen. Darüber hinaus empfehlen wir dringend, die Ausgaben viel Zeit für eine perfekte horizontale Ausrichtung der Blätter, da diese Scheibe Qualität direkt beeinflusst. Wir verwenden die Campden 700SMZ Slicer, die Abstimmung der Blattausrichtung ermöglicht, so dass die Vibration in der z-Ebene von weniger als 0,5 um. Tatsächlich ist die wichtigste Beschränkung der Heißschneidverfahren die Abhängigkeit von Schneidklinge Qualität und Stabilität. Wenn diese Anforderungen nicht erfüllt werden können, ist es ratsam, die traditionelle eiskaltem Schneidverfahren beim Schneiden in eiskalten Lösung wie variierende Osmolarität von teils gefrorenen stattdessen verwenden, trotz der Nachteile.
Die gezeigte Verfahren wird verwendet, um horizontale Scheiben des Kleinhirns zu erhalten; mit einfachen Modifikationen kann das gleiche Verfahren verwendet werden, um Scheiben entweder in der koronalen und sagittalen Ebene zu erhalten, aus vielen anderen Bereichen der Vorder - oder Hirns sowie des Hirnstamms. Für Scheiben der vorderen Teile des Vorderhirns und Olfactory System sollte der Schädel mehr anterioren geschnitten werden, um Schäden an diesen Bauteilen zu verhindern. Wir ziel halten das Verfahren so einfach und kurz wie möglich und nicht vorge Perfusion des Tieres beschäftigen, noch übernehmen wir in der physiologischen Lösung für Schneid ersetzen keine Komponenten. Dies ermöglicht das Verfahren gemäß der spezifischen neuronalen Subtypen von Interesse verändert werden. Es ist wahrscheinlich, dass Modifikationen der Schneidlösungen (wie in den Referenzen in der Einleitung beschrieben) kann weiter die Lebensfähigkeit der Scheiben und die Robustheit der Ergebnisse zu verbessern. Im allgemeinen sollte das Verfahren mit den meisten anderen üblichen physiologischen Lösungen üblicherweise für elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet werden, kompatibel sein.
In dem hier dargestellten Verfahren werden Scheiben 300 um dick geschnitten. Die optimale Schichtdicke ist abhängig von der geschnittenen Hirnregion, und die Zellen von Interesse. Für die Netzwerkintegrität Überlegungen, die Scheiben sollten nicht dünner als 250 & mgr; m, und wegen der Diffusionsbeschränkungen die bis seinpro Grenze der Schichtdicke ist ~ 400-450 & mgr; m.
Ein kritischer Schritt bei diesem Verfahren hinsichtlich der Verklebung des Gehirns zu der Schneidstufe, wie auch kleine Instabilität im Gewebe kann in unebenem oder unbrauchbar Scheiben führen. Daher sollte darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass die Hirnoberfläche keine überschüssige SPS, wenn sie auf die Klebetropfen gesenkt werden; Außerdem wird zu viel Kleber in das Gehirn liegenden ungleichmäßig auf der Bühne und eventuell von der Stufe Ablösen während des Schneidens führen. Auch könnte überschüssigen Leim kriechen auf den Gewebeseiten und zusätzlich die Einführung Inhomogenität in den Scheiben, kann die Klinge beschädigt.
Es gibt ein paar Schwierigkeiten, die beim Wechsel der Slicing-Protokoll aus dem eiskalten Methode zum Beweis Hitzeverfahren steigen könnte. Eine der Schwierigkeiten ist das Auftreten von Bakterien in den Scheiben. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Werkzeuge, die Kammer und das Schneiden Bad mit Ethanol vor dem Eingriff zu desinfizieren. Auch DrehenAusschalten der Heizungsanlage in der Erholungsbades nach 1 Stunde verlangsamt das Wachstum von Bakterien.
Schließlich sollte betont werden, dass die Verbesserung der Gesundheit der Neuronen in Scheiben geschnitten in physiologischer Temperatur kann auch in Änderungen ihrer Eigenschaften führen. Daher ist es ratsam, einen ersten Vergleich der von den Scheiben mit warmen und kalten Methoden erhaltenen Ergebnisse durchzuführen, insbesondere, wenn die Experimente sind Teil eines längeren Projekt mit früheren Arbeiten im Kaltverfahren erfolgt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
