Abstract
Qui vi presentiamo un protocollo per la preparazione di fettine cerebrali acute. Questa procedura è un elemento critico per elettrofisiologici esperimenti di patch-clamp che determina in larga misura la qualità dei risultati. E 'stato dimostrato che omettendo la fase di raffreddamento durante la procedura di taglio è utile nell'ottenere fette e cellule sane, soprattutto quando si tratta di strutture cerebrali altamente mielinizzate da animali adulti. Anche se il meccanismo preciso con cui temperatura elevata per mantenere salute neurale può essere ipotizzato solo dopo, è ovvio che, quando possibile, la temperatura in cui viene eseguito il taglio dovrebbe essere vicino a condizioni fisiologiche per evitare artefatti relativi alla temperatura. Un altro importante vantaggio di questo metodo è la semplicità del procedimento e quindi il tempo di preparazione breve. Nel metodo illustrato topi adulti sono usati ma lo stesso procedimento può essere applicato con i topi più giovani e ratti. Inoltre, le seguenti cl di patchesperimento amplificatore viene eseguita su fettine cerebellari orizzontali, ma lo stesso procedimento può essere utilizzato anche in altri piani, nonché altre aree posteriori del cervello.
Introduction
Lo scopo del metodo presentato è quello di ottenere fettine cerebrali acute alta qualità per esperimenti elettrofisiologici in vitro, specialmente quando si usano anche vecchi animali adulti o.
Il metodo di taglio cerebrale acuto, come descritto da Skrede e Westgaard 1 in due frasi eleganti, è diventato uno dei fondamenti della moderna ricerca neuroscientifica ed è impiegato in innumerevoli varianti in tutto il mondo. La qualità delle fette si riflette nel numero di neuroni per fetta vivente, il periodo di tempo durante il quale le cellule mantengono le loro proprietà elettrofisiologiche e morfologiche nonché l'integrità del tessuto. Inoltre, la durata massima delle registrazioni stabili dipende dalla qualità delle fette. Così, lungo i decenni, il metodo affettatura originale è stato ulteriormente sviluppato da gruppi di ricerca individuali che permettono di migliorare il recupero fetta dopo il taglio 2-10, spesso complesse modificazioni della composizione di taglio osoluzioni di recupero r (come l'aggiunta di ascorbato, tiourea o H 2 O 2) e intra-cardiaca pre-perfusione dell'animale con soluzioni fisiologiche raffreddate.
Come è stato recentemente dimostrato 11, temperatura fisiologica durante l'affettatura sembra essere più vantaggioso di raffreddamento per la salute neuronale; il miglioramento è più evidente quando si lavora con adulti (2-8 mesi) roditori. Evitare sbalzi di temperatura drammatici evita artefatti dovuti a processi dipendenti dalla temperatura nelle cellule, come la plasticità 13 e ioni canali cinetica 13,14. Tali cambiamenti potrebbero influenzare potenziale di membrana e di segnalazione intracellulare di calcio, soglia di picco e picco di forma.
Il metodo "a caldo" fetta acuta preparazione qui presentata è una procedura generale per l'ottenimento di fettine di cervello acuto di alta qualità da qualsiasi regione del cervello, tra cui il cervelletto, la corteccia e l'ippocampo, nuclei del tronco cerebrale 16 </ Sup> e il bulbo olfattivo, sia in ratti e topi.
In particolare, la procedura di affettatura temperatura fisiologica richiede che la lama di taglio vibra quasi perfettamente orizzontale ed è senza difetti strutturali. Tale precisione potrebbe non essere raggiungibile con i modelli affettatrice anziani; in tali casi, si consiglia di eseguire la preparazione fetta in condizioni di gelo-freddo come la bassa temperatura sembra rendere il tessuto più resistente ai danni meccanici, anche a costo di aberrazioni metaboliche.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura degli animali della Hebrew University and Use Committee.
1. Preparare le soluzioni e strumenti per affettare
- Preparare 1 L di soluzione fisiologica standard (SPS) contenente gli ioni descritte nella Tabella 1.
- Preparare una soluzione madre contenente i sali a 10 volte la concentrazione finale in anticipo in una bottiglia di vetro riempita con memorizzazione 1000 ml di acqua deionizzata (conduttanza 0,055 mS / cm). Aggiungere sali (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, e MgSO 4), e mescolare fino a completa dissoluzione. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
- Effettuare la soluzione finale SPS il giorno dell'esperimento. Aggiungere 100 ml della soluzione madre a 700 ml di acqua purificata, sciogliere il glucosio (3,6 g) e NaHCO3 (2,18 g) con ancoretta magnetica e quindi aggiungere acqua purificata fino a 1 L.
- Equilibrare i solutiil da dare gas con il 95% O 2/5% di CO 2 per ~ 20 min. Dopo questo, aggiungere 2 ml di 1 M CaCl 2 soluzione.
- Montare i seguenti strumenti (Figura 1).
- Preparare grandi forbici o altro strumento per la decapitazione, piccole forbici chirurgiche per l'apertura del cranio, pinza punta fine per il sollevamento del cranio per esporre il cervello, bisturi con lama per sezionare la parte desiderata del cervello da affettare e una piccola spatola per la manipolazione della parti del cervello sezionato.
- Inoltre, preparare piccoli pezzi di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso dal cervello, due piccoli piatti di Petri per il cervello per essere sezionati in due bicchieri di vetro 500 ml al contenimento di acqua purificata e riscaldata SPS, e colla cianoacrilato per incollare il cervello al fase di taglio.
- Preparare una piccola spazzola per la manipolazione delle fette durante l'affettatura e una bocca larga pipetta Pasteur di vetro per spostare le fette dal bagno affettare al cha recuperomber. Disinfettare gli strumenti per prevenire la crescita di batteri nei bagni fetta caldi. Inoltre, usare i guanti di laboratorio puliti.
- Preparare una camera di recupero fetta sommersa come descritto da Gibb e Edwards 15. Continuamente gas la SPS in esso con il 95% O 2/5% di CO 2 e mantenerlo a 36 ° C. Assicurarsi che la gasazione non si traduca in piccole bolle intrappolate nel bagno che potrebbero danneggiare le fette.
- Caldo ~ 300 ml di SPS a 36 ° C su una piastra riscaldante con agitatore magnetico o in un bagno d'acqua. Se viene usata una piastra di riscaldamento, aver cura di evitare che la soluzione dal surriscaldamento, che può provocare la precipitazione di ioni. Nel caso in cui accade, caldi SPS freschi, invece di raffreddamento del vecchio.
- Portare ~ 500 ml di acqua purificata a bollire con un bollitore elettrico e, in un bicchiere, unire 300 ml di esso con acqua fredda per ottenere acqua leggermente più calda rispetto alla temperatura di taglio. Utilizzare questa riscaldato acqua purificata durante la decapitazione e utilizzare il remaizio del acqua bollita in seguito per mantenere la temperatura fisiologica del bagno affettatura.
- Anestetizzare il mouse iniettando 0,1 ml di pentobarbital (60 mg / ml) per via intraperitoneale. Dopo qualche minuto verificare che l'animale non risponde a forti punta o coda pizzichi per accertare la mancanza di sensibilità.
2. Dissezione del cervello
- Decapitare il mouse rapidamente tagliando il collo con le grandi forbici vicino alla parte posteriore del cranio, e lasciare che la testa cadere nel bicchiere con acqua purificata riscaldata per lavare via il sangue in eccesso.
- Esporre il foro occipitale nel cranio sotto i muscoli del collo e la pelle, eventualmente rimuovere più del collo con le piccole forbici.
- Tirare la pelle sulla parte superiore del cranio per poter vedere chiaramente le suture cranio per guidare l'apertura del cranio.
- Tagliare il cranio aperto inserendo l'estremità inferiore delle piccole forbici attraverso il foro occipitale e subito li voltandosi versola parte laterale. Tagliare delicatamente lungo il bordo laterale del parietale fino ad una posizione dietro gli occhi e la sutura fronto; quindi, ruotare verso il centro del cranio e tagliare attraverso la linea mediana verso l'altro lato del cranio (vedi linea verde tratteggiata nella Figura 2A).
- Utilizzando pinze punta fine, sollevare il cranio da un angolo fronto-parietale e tirarlo in diagonale su e lateralmente per esporre il cervello (vedi freccia gialla tratteggiata nella Figura 2A). Assicurarsi che il cranio non è collegata a un osso o pelle della testa, in modo che il cervello rimarrà in posizione quando il cranio è sollevato. Nel caso in cui il cervello si sta muovendo con il cranio, utilizzare le piccole forbici per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo tra il cranio e il cervello.
- Quando il cervello è esposto, non consentono al cervello di essere asciutta. Quindi, eseguire i passi successivi, mantenendo il cranio e il cervello in una capsula di Petri riempita con riscaldato, gasati SPS.
- Staccare la parte del cervello usata per l'eXperiment dal resto del cervello utilizzando un bisturi e una spatola. In caso di utilizzo del cervelletto, staccare dal prosencefalo da un unico taglio attraverso il mesencefalo e ponte (lungo le linee rosse nelle figure 2B-D) e spostarlo in una piccola scatola di Petri che contiene fresco, gasati SPS.
- Rimuovere il tronco cerebrale per formare una base diritta e larga per incollare il cervello a taglio fase quando affetta cervelletto nel piano orizzontale. Brevemente posizionare il cervelletto su un pezzo di carta da filtro umida in modo che il lato che è stato tagliato dal prosencefalo sia rivolta verso il basso.
- Tagliare il tronco con un bisturi per formare la base (come indicato con la linea blu nella Figura 2B), e restituire il cervelletto al SPS. Quando sono necessari altri piani di taglio, tagliare il blocco di cervelletto di conseguenza (linee blu nelle Figure 2C e D).
3. Affettare il cervello
- Preparare la fase di taglio per accertare che sia dry, prima di applicare una piccola goccia di colla al centro del palco.
- Sollevare il blocco cervello dal SPS con una spatola con la corretta posizione normale e rimuovere il liquido in eccesso dal cervello utilizzando piccoli pezzi di carta da filtro. Poi, con un unico movimento, far scorrere il cervello dalla spatola sulla goccia di colla sulla scena.
- Per evitare che il cervello da essiccazione e la colla di corsa sui lati del tessuto, applicare alcune gocce di SPS con una pipetta Pasteur e posizionare la fase di taglio nella camera di affettatura. Allineare il blocco cervello in modo che le regioni di interesse (ad esempio, corteccia cerebellare) si trovano ad affrontare la lama e saranno così sottoposti a minor pressione meccanica prima di essere affettato.
- Tagliare ogni fetta secondo le istruzioni del produttore mentre costantemente gassazione SPS nella camera di taglio e mantenendo la temperatura a 34-37 ° C. Mantenere la temperatura della camera di taglio in questa gamma riempiendo il external camera del affettatrice con riscaldata acqua purificata e sostituendo l'acqua ogni volta che la temperatura scende troppo bassa.
NOTA: I parametri affettatrici devono essere trovati sperimentalmente per ogni tipo di tessuto e di neuroni che sono in fase di esame. Nel caso del Campden SMZ 700 con lame in ceramica e cellule Golgi cerebellari, utilizzare 0,75 millimetri ampiezza di vibrazione a 65 Hz e velocità di avanzamento pari a 0,05 mm / sec; per i neuroni nucleari cerebellari maggiore ampiezza e frequenza (1 mm e 90 Hz, rispettivamente) e la velocità di avanzamento lento (0,01-0,02 mm / sec) sono raccomandati. Per entrambi Golgi e neuroni cerebellari nucleari, spessore di strato deve essere di 300 micron. - Durante il taglio, non consentono le fette di ripiegare su se stessi. Per prevenire questo sostenendoli delicatamente con una spazzola morbida, preferibilmente toccando la fetta solo in regioni che non sono di interesse per l'esperimento. Fare attenzione per evitare che il pennello di toccare la lama vibratome; soprattutto nel caso delle lame di ceramica, anche un leggero contattopuò danneggiare la lama.
- Spostare ogni fetta dalla camera di taglio per un recupero / azienda da camera utilizzando una bocca larga, fuoco lucido vetro pipetta Pasteur.
- Lasciare le fette riposare nella camera per almeno 1 ora prima di iniziare l'esperimento. Questo permette di degradazione del danneggiato o morire tessuti e cellule e quindi si traduce in una superficie fetta detergente. Durante la prima ora, mantenere la temperatura del SPS nella camera nell'intervallo 34-36 ° C; in modo che le fette non sono toccati da bolle d'aria che possono danneggiare le fette o farli galleggiare.
4. Esperimento
- Dopo 1 ora, lasciare che la temperatura della camera di recupero raffreddare a RT (17-25 ° C).
NOTA: Questo potrebbe prolungare il periodo di tempo durante il quale le fette possono essere usate rallentando la crescita di batteri e metabolismo cellulare. Questo periodo dipende dalla regione del cervello e del tipo di cellule. Per esempio, alcuni tipi di cellule del Golgi possono essere giudicati sani a fette8 ore dopo il taglio, mentre altri tipi di durare solo 6 ore. - Dopo 1 ora è passato dal taglio, utilizzare le fette di vari esperimenti di elettrofisiologia.
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Representative Results
Fette preparate nel modo descritto possono essere utilizzati per vari esperimenti elettrofisiologici e optogenetic. Nella Figura 3A e 3C, vi mostriamo un esempio rappresentativo di una fetta cerebellare orizzontale e una fetta coronale cerebrale corticale, rispettivamente, visto sotto interferenza differenziale (DIC) ottiche. Nella fetta cerebellare, diversi tipi di neuroni cerebellari sono facilmente riconoscibili per la loro forma e la posizione delle cellule del corpo, permettendo di mira registrazioni elettrofisiologiche. Nella Figura 3B e 3D, viene tracciato da tutto-cell patch-clamp in modalità morsetto corrente di una cella Golgi cerebellare spontaneamente attiva e cellule piramidali corticali sono mostrati. Ulteriori esempi della qualità delle registrazioni elettrofisiologiche e optogenetic ottenuti da cervelli caldo fette possono essere trovati in Huang e Uusisaari 11 e Lefler et al. 16.
| concentrazione [mm] | peso (g / l) | |
| NaCl | 124 | 72.5 |
| KCl | 3 | 2.23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.63 |
| MgSO4 * 6H 2 O | 1.9 | 4.3 |
| Glucosio | 20 | 3.6 |
| NaHCO 3 | 26 | 2.18 |
| CaCl 2 | 2 | 1.109 |
Tabella 1. Composizione della soluzione fisiologica standard.
Figura 1. Disposizione degli utensili. 1. Grandi forbici, 2. Piccole forbici chirurgiche, 3. bisturi con lama # 11, 4. pinza sottile punta, 5. piccola spatola, 6. piatti Piccolo Petri, 7. bicchiere di vetro per l'acqua deionizzata, 8. bicchiere di vetro per gasse riscaldatosoluzione fisiologica d, 9. Super colla, 10. pennello sottile, 11. pipetta Pasteur, 12. Piccola siringa, 13. pentobarbital, 14. Le carte da filtro, 15. fase di taglio.
. Figura 2. Rappresentazione schematica del cranio e del cervello dissezione (A) Disegno raffigurante l'apertura del cranio per esporre il cervello (B - D). Disegni schematici che descrivono i piani di taglio del cervello per i tre principali piani di affettatura. La linea blu rappresenta il piano su cui il cervello sarà incollato.
Figura 3. Risultati rappresentativi del metodo. (A) orizzontale cerebellare fetta obtained con il metodo illustrato. Sono indicati così come sostanza bianca (WM) I tre principali strati della corteccia cerebellare (strato molecolare, ML strato dei granuli delle cellule, GC strato;; Purkinje livello dei neuroni, PN strato). Un elettrodo patch-clamp è schematicamente disegnato su una cella Golgi (GoC) (barra della scala: 40 micron). (B) esempio registrazione dalla cella Golgi mostrato in A. La registrazione è ottenuta con un elettrodo patch-clamp in current-clamp modalità. (In nero: traccia rappresentativa su sei tracce di grigio). (C) una fetta coronale cerebrale corticale ottenuta con il metodo illustrato. Cellule piramidali corticali sono mostrati insieme con un disegno schematico di un elettrodo patch-clamp. Registrazione morsetto (D) esempio di patch, in modalità pinza amperometrica, dalla cellula piramidale mostrato in (C). Clicca qui per vedere una versione più grande di questo figura.
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Discussion
Abbiamo dimostrato un metodo per preparare fettine cerebrali acute da topi nel fisiologica anziché temperatura ghiacciata.
E 'stato dimostrato 11 che la qualità di fette ottenuti in condizioni calde è superiore rispetto a quelli preparati con freddo, a condizione che la lama affettatrice ha vibrazione verticale minima. Affettare a temperatura fisiologica può impedire artefatti fisiologici causati dalla bassa temperatura, come quelli legati ai cambiamenti nei processi metabolici 17-19 che si possono manifestare in aberrazioni di cella singola e il comportamento della rete. Inoltre, anche se la procedura di taglio deve ovviamente essere completata senza inutili ritardi, non c'è bisogno di affrettarsi con l'affettatrice (come lo è quando affetta in condizioni ghiacciate per terminare taglio prima soluzioni diventano troppo calda, e per impedire la danni da congelamento-lunga durata del tessuto). Così, velocità di taglio più lenti possono essere noied. Questo può essere utile nel caso di affettatura strutture molto delicate. Ultimo, omettendo la fase di raffreddamento di entrambe le soluzioni e del cervello riduce significativamente la quantità di tempo richiesto per la procedura nonché la sua complessità. Il raffreddamento della soluzione a temperatura ghiacciata richiede circa 40 minuti più il riscaldamento della soluzione a temperatura fisiologica, lasciando più tempo per l'esperimento stesso.
E 'stato dimostrato 20 che l'intensità della fluorescenza nei neuroni corticali in GAD67-GFP topi è più forte quando si esaminano le fette tagliate a 20 ° C rispetto a quelli tagliati a 0 ° C. Ciò supporta ulteriormente l'idea che tagliando in temperatura gelida esercita una dannosa influenza sulla vitalità dei neuroni. D'altra parte, nello stesso saggio è stato dimostrato che la densità di neuroni fluorescenti è stato ridotto nel affettato ottenuto a 37 ° C rispetto a quelli tagliati a 20 ° C. La polemica con i risultati potrebbe arise dal fatto che z deflessione non è stata presa in base a considerazioni. Come accennato in precedenza, lo z-deflessione ha una forte influenza sulla qualità del tessuto quando affetta temperatura fisiologica, oltre alla qualità della lama e la velocità e altre impostazioni dell'affettatrice.
Una delle parti cruciali della procedura comporta la messa a punto della lama affettatrice prima di tagliare. A differenza quando si utilizzano soluzioni ghiacciate dove l'affettatura probabile coinvolge sia il taglio orizzontale e verticale "cracking" delle membrane lipidiche rigide, in condizioni fisiologiche qualsiasi movimento della lama affettatrice nella direzione z provoca danni nel tessuto. Per minimizzare questo, la lama deve essere duro e diritto possibile; nella nostra esperienza, lame di rasoio convenzionali hanno troppe imperfezioni per essere utilizzabili. Lame in acciaio inox di alta qualità studiati appositamente per l'utilizzo vibratome sono migliori, ma per i migliori risultati si consiglia Ceram single-smussatolame IC. Inoltre, si consiglia vivamente di spendere molto tempo per un perfetto allineamento orizzontale delle lame come questo influenza direttamente la qualità fetta. Usiamo l'affettatrice Campden 700SMZ che permette la sintonizzazione dell'allineamento lama in modo che la vibrazione nel piano z è inferiore a 0,5 micron. Infatti, la limitazione più importante del metodo di taglio a caldo è la sua dipendenza dalla qualità della lama affettatrice e stabilità. Se non è possibile soddisfare questi requisiti, è consigliabile utilizzare il metodo di taglio ghiacciata tradizionale, invece, nonostante gli svantaggi affettatura in soluzione ghiacciata come varia osmolarità da essere parzialmente congelati.
Il metodo illustrato è utilizzato per ottenere fette orizzontali del cervelletto; con semplici modifiche lo stesso metodo può essere utilizzato per ottenere fette sia nel coronale o piano sagittale, da molte altre regioni della ribalta - o mesencefalo e tronco cerebrale. Per fette di parti più anteriori del proencefalo e Olfactsistema ORY, il cranio deve essere tagliato più anteriore per evitare danni da queste parti. Abbiamo volutamente mantenere il metodo più semplice e più breve possibile e non impieghiamo pre-perfusione dell'animale, né ci sostituiamo i componenti nella soluzione fisiologica per il taglio. In questo modo il metodo da modificare secondo il sottotipo neuronale specifico di interesse. È probabile che le modifiche delle soluzioni di taglio (come descritto nei riferimenti nella Introduzione) possono migliorare ulteriormente le possibilità di fette e robustezza dei risultati. In generale, il metodo deve essere compatibile con la maggior parte delle altre soluzioni fisiologiche incontrate comunemente utilizzati per la registrazione elettrofisiologica.
Nel metodo qui illustrato, le fette sono tagliate spesse 300 micron. Lo spessore ottimale fetta dipende dalla regione del cervello fette e le cellule di interesse. Per considerazioni di integrità di rete, le fette non devono essere più sottile di 250 micron, ed a causa di limitazioni di diffusione sopraal limite dello spessore fetta è ~ 400-450 micron.
Un punto critico in questo metodo riguarda l'incollaggio del cervello per la fase di taglio, in quanto anche piccole instabilità nel tessuto può provocare fette irregolari o inutilizzabili. Pertanto, occorre prestare attenzione per assicurarsi che la superficie del cervello non ha alcun eccesso SPS quando viene abbassato sulla goccia di colla; inoltre, troppa colla si tradurrà nel cervello che si trova in modo non uniforme sul palco e, eventualmente, staccare dal palco durante affettare. Inoltre, la colla in eccesso può insinuarsi sui lati del tessuto e, oltre ad introdurre disomogeneità nelle fette, potrebbe danneggiare la lama.
Ci sono alcune difficoltà che possono sorgere quando si cambia il protocollo taglio dal metodo ghiacciata per il metodo a caldo dimostrata. Una delle difficoltà è la comparsa di batteri nelle fette. Per questo motivo è importante disinfettare gli strumenti, la camera e il bagno affettatura con etanolo prima della procedura. Inoltre, girandospegnere il sistema di riscaldamento nel bagno di recupero dopo 1 ora rallenta la crescita dei batteri.
Infine, va sottolineato che il miglioramento della salute dei neuroni in fette tagliate a temperatura fisiologica potrebbe anche provocare cambiamenti nelle loro proprietà intrinseche. Pertanto, è consigliabile effettuare un primo confronto dei risultati ottenuti dalle fette con entrambi i metodi freddi e caldi, specialmente se gli esperimenti sono parte di un progetto più con lavori precedenti realizzati con il metodo a freddo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
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