Abstract
Her presenterer vi en protokoll for utarbeidelse av akutte hjerneskiver. Denne prosedyren er et kritisk element for elektrofysiologiske patch-clamp eksperimenter som i stor grad avgjør kvaliteten på resultatene. Det har blitt vist at å utelate kjøletrinnet under skjæring fremgangsmåten er fordelaktig i å skaffe friske skiver og celler, særlig ved håndtering av svært myelinerte hjernestrukturer fra modne dyr. Selv om den nøyaktige mekanismen der forhøyet temperatur støtter neural helse kan bare spekulere på, står det til grunn at når det er mulig, bør temperaturen der slicing er utført være nær fysiologiske forhold for å hindre temperaturrelaterte gjenstander. En annen viktig fordel med denne fremgangsmåten er enkelhet av fremgangsmåten, og derfor den kort forberedelsestid. I det viste fremgangsmåte voksne mus blir brukt, men den samme fremgangsmåte kan anvendes med yngre mus samt rotter. Also, følgende patch clamp eksperiment utføres på lillehjernen horisontale stykker, men den samme fremgangsmåte kan også brukes i andre fly så vel som andre bakre områder av hjernen.
Introduction
Målet med den fremlagte fremgangsmåte er å få høy kvalitet akutte hjernesnitt for in vitro elektrofysiologiske eksperimenter, spesielt ved bruk av voksen eller til og med gamle dyr.
Den akutte hjerne slicing metoden, som beskrevet av Skrede og Westgaard 1 i to elegante setninger, har blitt en av grunnlaget for moderne nevrovitenskap forskning og er ansatt i utallige varianter over hele verden. Kvaliteten av sektorene er reflektert i antall levende neuroner pr skive, den tidsperiode i løpet av hvilken cellene beholde sine elektrofysiologiske og morfologiske egenskaper, så vel som i integriteten av vevet. Videre har den maksimale varighet for stabile opptak avhenger av kvaliteten av sektorene. Således langs flere tiår, den opprinnelige kutting metoden har blitt videreutviklet ved de enkelte forskningsgrupper for å forbedre utvinningen skive etter kutting 2-10, ofte ved kompliserte modifikasjoner av sammensetningen av skjære or utvinning løsninger (slik som tilsetning av askorbat, tiourea eller til og med H 2 O 2) så vel som intra-kardial pre-perfusjon av dyret med avkjølte fysiologiske oppløsninger.
Som det har nylig blitt vist 11, virker fysiologisk temperatur under kutting til å være mer fordelaktig enn avkjøling til neuronal helse; forbedringen er mest slående når du arbeider med voksne (2-8 mnd) gnagere. Å unngå dramatiske temperaturendringer hindrer gjenstander som følge av temperaturavhengige prosesser i cellene, slik som plastisitet 13 og ione-kanaler kinetikk 13,14. Slike endringer kan påvirke membranspenning og intracellulært kalsium signalering, spike terskel, og spike form.
Den "varme" akutt skive fremstillingsmetode som presenteres her er en generell fremgangsmåte for å oppnå høy kvalitet på akutte hjernesnitt fra en hvilken som helst hjerneregionen, inkludert lillehjernen, cortex og hippocampus, hjernekjerner 16 </ Sup> samt luktelappen, både i rotter og mus.
Spesielt, krever den fysiologiske temperatur slicing prosedyre at kappeskiven vibrerer nesten helt horisontalt og er uten noen strukturelle defekter. Slik presisjon er kanskje ikke oppnåelig med eldre slicer modeller; i slike tilfeller anbefaler vi utfører stykket forberedelse i iskaldt kaldt forhold som lav temperatur synes å gjøre vevet mer motstandsdyktig mot mekanisk skade, selv om på bekostning av metabolske avvik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet i denne protokollen ble godkjent av det hebraiske universitetets Animal Care og bruk komité.
1. Forberedelse av løsninger og verktøy for å ha klippet
- Forbered 1 L av standard fysiologisk oppløsning (SPS) inneholdende ioner er beskrevet i tabell 1.
- Tilbered en stamløsning inneholdende de salter ved 10 ganger sluttkonsentrasjonen på forhånd i en lagringsglassflaske fylt med 1000 ml avionisert vann (konduktansen av 0,055 uS / cm). Legg salter (NaCl, KCl, KH 2PO 4, og MgSO4), og røres til det er helt oppløst. Oppbevar stamløsning i 4 ° C.
- Gjør den endelige SPS løsning på dagen av forsøket. Legg 100 ml av stamoppløsning til 700 ml renset vann, oppløse glukose (3,6 g) og NaHCO3 (2,18 g) ved hjelp av magnetisk rørestav og deretter legge renset vann opp til 1 L.
- Stabilisere de solutividere av det gassing med 95% O2 / 5% CO 2 for ~ 20 min. Etter dette, tilsett 2 ml 1 M CaCl 2-løsning.
- Monter følgende verktøy (figur 1).
- Forbered store saks eller annet verktøy for halshogging, små kirurgiske saks for å åpne skallen, til fine tips tang for å løfte skallen å avsløre hjernen, skalpell med blad for å dissekere den ønskede delen av hjernen bli skiver og en liten slikkepott for å manipulere dissekert hjernedeler.
- I tillegg fremstille små stykker av filterpapir for å fjerne overflødig væske fra hjernen, til to små petriskåler for hjernen bli dissekert i to glass 500 ml begerglass inneholdende varmet for renset vann og SPS, og cyanoakrylat-lim for liming av hjernen til slicing scenen.
- Forbered en liten børste for håndtering av skivene under kutting og en bred åpning glass Pasteur pipette for å flytte skivene fra slicing bath til utvinning chamber. Desinfiser verktøy for å hindre bakterievekst i det varme skive bad. Videre bruker rene laboratoriehansker.
- Forbered en neddykket skive utvinning kammer slik som beskrevet av Gibb og Edwards 15. Kontinuerlig gass SPS i det med 95% O 2/5% CO 2 og holde ved 36 ° C. Sørg for at gassingen ikke fører til små bobler fanget i badekaret som kan skade skiver.
- Varm ~ 300 ml av SPS til 36 ° C på en varmeplate med magnetrører, eller i et vannbad. Dersom en varmeplate anvendes, ta vare for å hindre at oppløsningen fra overoppvarming, noe som kan resultere i utfelling av ionet. I tilfelle det skjer, varme ferske SPS i stedet for kjøling den gamle.
- Ta med ~ 500 ml renset vann til å koke ved hjelp av en vannkoker og, i et beger, kombinere 300 ml den med kaldt vann for å få litt varmere vann enn slicing temperatur. Bruk denne varmet renset vann under halshogging og bruke remainelsen av kokt vann senere for å opprettholde den fysiologiske temperatur av kutting badet.
- Anaesthetize mus ved injeksjon av 0,1 ml av pentobarbital (60 mg / ml) intraperitonealt. Etter noen minutter sjekke at dyret ikke reagerer på sterke tå eller hale klyper å fastslå mangel på følelse.
2. dissekere hjernen
- Halshogge musen raskt ved å kutte halsen med de store saks i nærheten baksiden av hodeskallen, og la hodet falle i begeret med varmet renset vann for å skylle bort overflødig blod.
- Expose foramen magnum i skallen under nakkemusklene og huden, mulig å fjerne mer av halsen med liten saks.
- Dra huden på toppen av skallen for å kunne tydelig se skallen sting for å veilede åpning av skallen.
- Skjær skallen åpen ved å sette den nedre spissen av liten saks gjennom foramen magnum og umiddelbart snu dem motden laterale side. Forsiktig klippe langs sidekanten av issebeinet opp til et sted bak øynene og frontoparietal sutur; og deretter slå mot midten av skallen og skåret på tvers av midtlinjen til den andre siden av hodeskallen (se grønn stiplet linje i figur 2A).
- Ved hjelp av fin spiss tang, løfter skallen fra frontoparietal hjørne og trekk det skrått oppover og sideveis for å avsløre hjernen (se gul stiplet pil i figur 2A). Sørg for at hodeskallen ikke er knyttet til noen bein eller hud av hodet, slik at hjernen vil holde seg på plass når skallen løftes. I tilfelle at hjernen går med skallen, bruker de små saks for å fjerne eventuelle bindevev mellom skallen og hjernen.
- Når hjernen er utsatt, ikke la hjernen til å være tørr. Dermed utføre de neste trinnene mens du holder hodeskallen og hjernen i en petriskål fylt med varme, gasset SPS.
- Løsne den delen av hjernen som brukes til eXperiment fra resten av hjernen ved hjelp av en skalpell og en spatel. Ved hjelp av lillehjernen, løsner fra brain av en enkelt kutt gjennom midthjernen og pons (sammen røde linjer i figurene 2B-D) og flytte den til en liten petriskål som inneholder friske, gasset SPS.
- Ta av hjernestammen for å danne en rett og bred base for liming hjernen til å kutte scenen når slicing lillehjernen i horisontalplanet. I korthet plassere cerebellum på et vått stykke filterpapir slik at den siden som ble kuttet fra forhjernen vender ned.
- Skjær hjernestammen med en skalpell for å danne basen (som angitt med den blå linjen i figur 2B), og returnere lillehjernen til SPS. Når andre flyene av skjæring er nødvendig, trim lillehjernen blokken tilsvarende (blå linjer på figur 2C & D).
3. Slicing Brain
- Klargjør skjære scenen ved å konstatere at det er dry, før du påfører en liten dråpe superlim i midten av scenen.
- Løft hjernen kvartal fra SPS med en slikkepott med riktig side opp, og fjerne overflødig væske fra hjernen ved hjelp av små biter av filterpapir. Så, med en enkelt bevegelse, skyver hjernen fra slikkepotten på dråpe lim på scenen.
- For å hindre hjernen fra tørking og limet fra å kjøre opp på sidene av vevet, anvende et par dråper SPS med en Pasteur-pipette og plassere skjæretrinn i kuttekammeret. Juster hjernen blokken slik at de regioner av interesse (for eksempel cerebellar cortex) er vendt mot bladet og vil således være utsatt for minst mulig mekanisk trykk før de ble oppskåret.
- Skjær hver skive i henhold til produsentens instruksjoner, mens stadig gassing SPS i skjærekammeret samt temperaturen ble holdt ved 34-37 ° C. Hold temperaturen på skjærekammeret på dette område ved å fylle external kammer av slicer med varmet renset vann og erstatte vannet når temperaturen faller for lavt.
MERK: slicing parametrene må eksperimentelt funnet for hver type vev og nerveceller som blir undersøkt. I tilfelle av Campden SMZ 700 høvelen med keramiske blad og lillehjernen Golgi-celler ved å bruke 0,75 mm vibrasjonsamplitude ved 65 Hz og fremrykkhastigheten på 0,05 mm / sek; for cerebellare atom neuroner høyere amplitude og frekvens (1 mm og 90 Hz, henholdsvis) og langsommere forhånd hastighet (0,01 til 0,02 mm / sek) anbefales. For både Golgi og lillehjernen atom nevroner, bør skivetykkelse være 300 mikrometer. - Under slicing, ikke la skivene til å kaste på seg selv. Forhindre dette ved å forsiktig støtte dem med en myk børste, helst berøre skive bare i områder som ikke er av interesse for forsøket. Vær nøye med å hindre børsten fra berøre vibratome blad; spesielt i tilfelle av de keramiske blad, selv en lett berøringkan skade bladet.
- Flytt hver skive fra slicing kammeret til en recovery / holde kammeret ved hjelp av en bred åpning, brann-polert glass Pasteur pipette.
- La skivene hviler i kammeret i minst 1 time før start av eksperimentet. Dette gjør det mulig for nedbrytning av skadede eller døde celler og vev, og således resulterer i en renere skiveoverflate. I løpet av den første timen, holde temperaturen av SPS i kammeret i området fra 34-36 ° C; sørg for at skivene ikke blir berørt av luftbobler som kan skade skiver eller gjøre dem flyte.
4. Experiment
- Etter 1 time, la gjenvinningskammeret temperaturen avkjøles til romtemperatur (17-25 ° C).
MERK: Dette kan forlenge perioden hvor skivene kan brukes ved å bremse veksten av bakterier samt cellenes stoffskifte. Denne periode avhenger av hjerneregionen og celletype. For eksempel kan visse typer av Golgi-celler bli funnet å være sunn i skiver8 timers etter klipping, mens andre typer varer bare 6 hr. - Etter en time har gått fra slicing, bruke skiver for ulike elektrofysiologiske eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skiver fremstilt på den beskrevne måte kan anvendes for forskjellige elektrofysiologiske og optogenetic eksperimenter. I figur 3A og 3C, viser vi et representativt eksempel på en horisontal lillehjernen stykke og en koronale cerebral cortical skive, henholdsvis, sett under differensial interferens (DIC) optikk. I lillehjernen slice, kan flere typer lillehjernen nevroner lett gjenkjennes ved sin plassering og cellekroppsform, slik at målrettet elektrofysiologiske opptak. I Figur 3B og 3D, spor eksempel fra hel-celle patch-clamp opptak i strømtang modus fra et spontant aktive lillehjernen Golgi celle og kortikale pyramidale celle vises. Ytterligere eksempler på kvaliteten på elektrofysiologiske og optogenetic opptak hentet fra hot-skiver hjerner kan bli funnet i Huang og Uusisaari 11 og Lefler et al. 16.
| konsentrasjon [mM] | vekt (g / L) | |
| NaCl | 124 | 72.5 |
| KCl | 3 | 2.23 |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1,63 |
| MgSO4 * 6H O 2 | 1.9 | 4.3 |
| Glukose | 20 | 3.6 |
| NaHCO3 | 26 | 2.18 |
| CaCl2 | 2 | 1.109 |
Tabell 1. Sammensetning av standard fysiologisk oppløsning.
Figur 1. Plassering av verktøyene. 1. Store saks, 2. Små kirurgiske saks, 3. Skalpell med blad som nr 11, 4. fin spiss tang, 5. Liten slikkepott, 6. Small petriskåler, 7. begerglass for avionisert vann, 8. begerglass for varmet gassed fysiologisk oppløsning, 9. Superlim, 10. Tynn børste, 11. Pasteur pipette, 12. Liten sprøyte, 13. Pentobarbital, 14. Filter papirer, 15. Cutting scenen.
. Figur 2. Skjematisk fremstilling av hjerneskallen og disseksjon (A) tegning som viser åpningen av skallen for å eksponere hjernen (B - D). Skjematiske tegninger som beskriver planene av skjære hjernen til de tre hovedplanene kutting. Den blå linje representerer planet på hvilket hjernen vil bli limt på.
Figur 3. Representative resultater av fremgangsmåten. (A) en horisontal skive o cerebellarbtained med demonstrert metoden. De tre store lag av cerebellar granule cortex (cellelag, GC-lags; Purkinje neuron lag, PN laget; molekyl lag, ML) så vel som hvit substans (WM) er indikert. En patch-clamp elektroden er skjematisk tegnet på en Golgi celle (GOC) (skala bar: 40 mikrometer). (B) eksempel opptak fra Golgi cellen vist i A. Opptaket oppnås med en patch-clamp elektrode i current-klemme modus. (I sort: representativt spor av seks grå traser). (C) en koronale hjerne kortikale skive oppnådd med den viste fremgangsmåte. Kortikale pyramidale celler er vist sammen med en skjematisk tegning av en patch-clamp elektroden. (D) eksempel patch klemme opptak, i strømtang modus, fra pyramidecelle vist i (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer en fremgangsmåte for fremstilling av akutte hjernesnitt fra mus i fysiologisk stedet for iskald temperatur.
Det har blitt vist 11 at kvaliteten av skiver som oppnås i varme forhold er overlegen sammenlignet med de som fremstilles med kalde forhold, forutsatt at høvelen bladet har minimal vertikal vibrasjon. Slicing i fysiologisk temperatur kan hindre fysiologiske artefakter forårsaket av lav temperatur, for eksempel de som er knyttet til endringer i metabolske prosesser 17-19 som kan manifestere i avvik av encellede samt nettverks atferd. Videre, selv om slicing prosedyren bør åpenbart være ferdig uten unødvendige forsinkelser, er det ingen grunn til hastverk med slicing (som det er når slicing i iskalde forhold for å fullføre skjæring før løsninger blir for varm, og for å hindre at skader fra langvarige frysing av vevet). Dermed kan tregere skjærehastighet være ossed. Dette kan være fordelaktig i tilfelle av kutting meget ømfintlige strukturer. Sist, utelatelse kjøletrinnet av begge løsningene og av hjernen reduserer i betydelig grad mengden av tid som kreves for fremgangsmåten, så vel som dens kompleksitet. Avkjølingen av oppløsningen til iskald temperatur krever omtrent 40 min mer enn oppvarming av løsningen til fysiologisk temperatur, slik at mer tid for forsøket i seg selv.
Det har blitt vist 20 at intensiteten av fluorescens i kortikale neuroner i GAD67-GFP mus er sterkere når undersøke skiver kuttet i 20 ° C sammenlignet med dem kuttet i 0 ° C. Dette støtter videre oppfatningen at slicing i iskald temperatur utøver en skadelig innflytelse på levedyktigheten av nerveceller. På den annen side, i samme papir ble det vist at tettheten av fluorescerende neuroner ble redusert i skiver oppnådd ved 37 ° C sammenliknet med de som er kuttet ved 20 ° C. Striden med resultatene kanskje Ariog for seg fra det faktum at z-nedbøyning ikke ble tatt under hensyn. Som nevnt ovenfor, har z-nedbøyning en sterk innflytelse på vevet kvalitet når kutting i fysiologisk temperatur, i tillegg til kvaliteten av bladet og hastigheten og andre innstillinger av høvelen.
En av de avgjørende deler av prosedyren innebærer finjustering av slicer bladet før slicing. I motsetning til ved bruk av is-kald løsninger hvor kutting sannsynligvis innebærer både horisontal skjæring, så vel som vertikal "cracking" av de stive lipidmembraner, under fysiologiske betingelser enhver bevegelse av bladet høvelen i z-retningen vil føre til skade på vevet. For å minimere dette, bør bladet være så hardt og rett som mulig; i vår erfaring, konvensjonelle barberblader har for mange feil til å være brukbare. Høykvalitets kniver i rustfritt stål er spesielt utviklet for vibratome bruk er bedre, men for best resultat foreslår vi single-skrå Ceramic kniver. Videre anbefaler vi på det sterkeste å bruke betydelig tid for perfekt horisontal justering av bladene da det har betydning slice kvaliteten direkte. Vi bruker Campden 700SMZ høvelen som tillater innstilling av bladet innretting, slik at vibrasjoner i z-planet er mindre enn 0,5 um. Faktisk er den mest avgjørende begrensning av den varme slicing metoden sin avhengighet av slicer blad kvalitet og stabilitet. Dersom disse kravene ikke kan oppfylles, er det tilrådelig å bruke den tradisjonelle iskald klippemetoden i stedet, til tross for ulempene i slicing i iskaldt løsning som varierende osmolaritet fra å være delvis frossen.
Metoden demonstreres blir anvendt for å oppnå horisontale stykker av cerebellum; med enkle modifikasjoner av samme metode kan brukes for å få skiver i enten den koronale eller sagittalplanet, fra mange andre regioner i forgrunnen - eller midthjernen, så vel som hjernestammen. For skiver av de fremre delene av brain og olfactory system, bør skallen kuttes mer fremre å hindre skade på disse deler. Vi målrettet holde den fremgangsmåte som er enkle og korte som mulig, og ikke anvende pre-perfusjon av dyret, og heller substituere vi noen av komponentene i den fysiologiske oppløsning for skjæring. Dette tillater fremgangsmåten å bli modifisert i henhold til den spesifikke neuronale undertype av interesse. Det er sannsynlig at modifikasjoner av de skjærende løsninger (som beskrevet i referansene i innledningen) kan ytterligere forbedre levedyktigheten til skiver og robustheten av resultatene. Generelt bør fremgangsmåten være kompatibelt med de fleste andre vanlige fysiologiske løsninger som vanligvis anvendes for elektrofysiologisk opptak.
I fremgangsmåten vist her, er skåret skiver 300 um tykt. Den optimale skivetykkelse avhenger av skiver hjerneregion og cellene av interesse. For nettverksintegritetshensyn, bør skivene ikke være tynnere enn 250 mikrometer, og på grunn av diffusjonsbegrensninger oppper grense for skivetykkelse er ~ 400-450 mikrometer.
Et kritisk trinn i denne fremgangsmåte gjelder liming hjernen til skjæretrinn, som selv liten ustabilitet i vevet kan resultere i ujevn eller ubrukelig skiver. Derfor bør man sørge for å være sikker på at hjernen overflaten har ingen overflødig SPS når den senkes på limet fallet; Dessuten vil for mye lim resultere i hjernen liggende ujevnt på scenen og eventuelt løsne fra scenen under kutting. Også, kan overflødig lim krype opp på de sider vev og, i tillegg til å innføre inhomogenitet i skivene, kan skade bladet.
Det er noen problemer som kan stige når du endrer slicing protokollen fra det iskalde metoden til den demonstrert varmt metoden. En av vanskelighetene er utseendet av bakterier på skivene. Av denne grunn er det viktig å desinfisere verktøy, kammeret, og kutting bad med etanol før prosedyren. Også, snuav varmesystemet i utvinningen bad etter 1 time bremser bakterievekst.
Til slutt bør det understrekes at bedre helse av nevroner i skiver skåret i fysiologisk temperatur kan også føre til endringer i sine iboende egenskaper. Derfor er det tilrådelig å utføre en innledende sammenligning av resultatene fra skiver med både kalde og varme metoder, spesielt hvis forsøkene er en del av en lengre prosjekt med tidligere arbeider gjort ved hjelp av den kalde metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
