Abstract
Här presenterar vi ett protokoll för beredning av akut hjärnan skivor. Detta förfarande är en kritisk faktor för elektrofysiologiska patch-clamp experiment som till stor del avgör kvaliteten på resultaten. Det har visats att utelämna kylningssteget under skärning förfarande är fördelaktigt att erhålla friska skivor och celler, i synnerhet när det handlar om mycket myeliniserade hjärnstrukturer från vuxna djur. Även om den exakta mekanismen genom vilken förhöjd temperatur stöder neural hälsa kan bara spekulera om, är det förståeligt att när så är möjligt, bör temperaturen i vilken skivning utförs vara nära fysiologiska villkor för att förhindra temperaturrelaterade artefakter. En annan viktig fördel med denna metod är enkelheten av förfarandet och därför den korta förberedelsetid. I det visade metoden vuxna möss används men samma förfarande kan tillämpas med yngre möss samt råttor. Även de följande patch clamp Experimentet utförs på horisontella cerebellära skivor, men samma förfarande kan även användas i andra plan samt andra posteriora områden av hjärnan.
Introduction
Syftet med den presenterade metoden är att få högkvalitativa akut hjärnan skivor för in vitro elektrofysiologiska experiment, speciellt vid användning av vuxen eller ens gamla djur.
Den akuta hjärnskivmetoden, som beskrivs av Skrede och Westgaard 1 i två eleganta meningar, har blivit en av grundvalarna för den moderna neurovetenskaplig forskning och är anställd i otaliga varianter världen över. Kvaliteten på de skivor avspeglas i antalet levande neuroner per skiva, den tidsperiod under vilken cellerna behålla sina elektrofysiologiska och morfologiska egenskaper liksom i integriteten av vävnaden. Dessutom den maximala varaktigheten för stabila inspelningar beror på kvaliteten på skivorna. Således längs decennier, den ursprungliga skivmetoden har vidareutvecklats av enskilda forskargrupper att förbättra slice återhämtning efter styckning 2-10, ofta med komplexa modifieringar av sammansättningen av skär or återställningslösningar (som att lägga askorbat, tiourea eller H 2 O 2) samt inom hjärt pre-perfusion av djuret med kylda fysiologiska lösningar.
Som har nyligen visats 11, fysiologisk temperatur under skivning verkar vara mer fördelaktigt än kylning till neuronal hälsa; förbättringen är mest slående när man arbetar med vuxna (2-8 månad) gnagare. Undvika dramatiska temperaturförändringar förhindrar artefakter på grund av temperaturberoende processer i celler, såsom plasticitet 13 och jonkanaler kinetik 13,14. Sådana förändringar kan påverka membranspänning och intracellulär kalcium signalering, spik tröskeln, och Spike form.
Den "heta" akut slice metod preparat som presenteras här är ett allmänt förfarande för att erhålla högkvalitativa akut hjärnan skivor från alla hjärnregion, inklusive lillhjärnan, cortex och hippocampus, hjärnstammen kärnor 16 </ Sup> samt luktloben, både hos råttor och möss.
Noterbart, kräver den fysiologiska temperaturskivning förfarande att kapskivan vibrerar nästan helt horisontellt och är utan några strukturella defekter. Sådan precision kanske inte kan uppnås med äldre slicer modeller; i sådana fall rekommenderar vi att utföra den skiva beredning i frysning-kall förhållanden såsom låg temperatur verkar göra vävnaden mer motståndskraftig mot mekaniska skador, även om på bekostnad av metaboliska aberrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll godkändes av Hebreiska universitetet Animal Care och användning kommittén.
1. Förbereda lösningar och verktyg för skivning
- Förbered ett L av standard fysiologisk lösning (SPS) innehållande jonerna som beskrivs i tabell 1.
- Bered en förrådslösning innehållande de salter vid 10 gånger den slutliga koncentrationen i förväg i en lagringsglasflaska fylld med 1000 ml avjoniserat vatten (ledningsförmåga av 0,055 | iS / cm). Lägg salter (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, och MgSO 4), och rör om tills den är helt upplöst. Förvara stamlösning i 4 ° C.
- Gör den slutliga SPS-lösning på dagen för experimentet. Tillsätt 100 ml av stamlösningen till 700 ml renat vatten, lösa upp glukos (3,6 g) och NaHCO 3 (2,18 g) med hjälp av magnetisk omrörare och sedan lägga renat vatten upp till 1 L.
- Jämvikta solutipå genom gasning den med 95% O2 / 5% CO2 under ~ 20 min. Efter detta, tillsätt 2 ml av 1 M CaCl2-lösning.
- Montera följande verktyg (Figur 1).
- Förbered stora sax eller annat verktyg för halshuggning, små kirurgiska saxar för att öppna skallen, till fin spets pincett för att lyfta skallen att exponera hjärnan, skalpell med blad för att dissekera den önskade delen av hjärnan skivas och en liten spatel för att manipulera dissekerade hjärndelar.
- Dessutom förbereder små bitar av filterpapper för att avlägsna överflödig vätska från hjärnan, till två små petriskålar för hjärnan dissekeras i två glas 500 ml bägare för att innehålla värmas renat vatten och SPS, och cyanoakrylatlim för limning hjärnan till skivning skede.
- Förbered en liten borste för att hantera skivorna under skivning och en bred öppning glas pasteurpipett för att flytta skivorna från skivbadet till återvinnings chamber. Desinficera verktyg för att förhindra bakterietillväxt i den varma slice bad. Dessutom använder rena laboratoriehandskar.
- Förbered en nedsänkt skiva återvinningskammaren såsom beskrivits av Gibb och Edwards 15. Kontinuerligt gas SPS i den med 95% O2 / 5% CO2 och hålla vid 36 ° C. Kontrollera att gasningen inte resulterar i små bubblor infångade i badet som kan skada skivorna.
- Varmt ~ 300 ml av SPS till 36 ° C på en värmeplatta med magnetisk omrörare eller i ett vattenbad. Om en värmeplattan används, se till att förhindra att lösningen från överhettning, vilket kan leda till jon nederbörd. Om det händer, varma färska SPS istället för att kyla den gamla.
- Bring ~ 500 ml renat vatten för att koka med hjälp av en elektrisk vattenkokare och, i en bägare, kombinera 300 ml av den med kallt vatten för att erhålla något varmare vatten än skivningstemperaturen. Använd denna värmde renat vatten under halshuggning och använda remaijan av kokt vatten senare för att upprätthålla den fysiologiska temperaturen för skivning badet.
- Söva musen genom att injicera 0,1 ml av pentobarbital (60 mg / ml) intraperitonealt. Efter några minuter kontrollera att djuret inte reagerar på starka tå eller svans nyper att fastställa bristen på känsla.
2. Analysera hjärnan
- Halshugga musen snabbt genom att skära halsen med de stora saxen nära baksidan av skallen, och lät huvudet falla i bägaren med uppvärmd renat vatten för att skölja bort överflödigt blod.
- Exponera foramen magnum i skallen i nackmusklerna och huden, eventuellt ta bort mer av halsen med en liten sax.
- Dra huden på toppen av skallen för att tydligt kunna se suturerna för att styra öppningen av skallen.
- Skär skallen öppna genom att sticka in den nedre spetsen av en liten sax genom foramen magnum och omedelbart vända dem motden laterala sidan. Skär försiktigt längs den laterala kanten av den parietala benet upp till en plats bakom ögonen och frontoparietal suturen; då, sväng mot mitten av skallen och skär tvärs över mittlinjen till den andra sidan av skallen (se grön streckad linje i figur 2A).
- Med fin spets pincett, lyft skallen från frontoparietal hörnet och dra den snett uppåt och åt sidan för att exponera hjärnan (se gul streckad pil i figur 2A). Kontrollera att skallen inte är fäst till något ben eller hud av huvudet, så att hjärnan kommer att stanna på plats när skallen lyfts. I fallet att hjärnan är i rörelse med skallen, använd en liten sax för att avlägsna eventuell bindväv mellan skallen och hjärnan.
- När hjärnan utsätts, inte tillåter hjärnan att vara torr. Således utför nästa steg samtidigt som skallen och hjärnan i en petriskål fylld med uppvärmd, gasade SPS.
- Lossa den del av hjärnan som används för eXperiment från resten av hjärnan med användning av en skalpell och en spatel. Vid användning av lillhjärnan, lossna från framhjärnan med ett enda snitt genom mitthjärnan och pons (längs röda linjer i figurerna 2B-D) och flytta den till en liten petriskål som innehåller färska, gasade SPS.
- Ta hjärnstammen för att bilda en rak och bred bas för limning hjärnan att skära skede när skivning lillhjärnan i horisontalplanet. Placera kort på lillhjärnan på en våt bit filterpapper så att den sida som är klippt från framhjärnan är vänd nedåt.
- Skär hjärnstammen med en skalpell för att utgöra basen (som indikeras med den blå linjen i figur 2B), och återlillhjärnan till SPS. När det behövs andra plan av skärning, trimma lillhjärnan blocket i enlighet därmed (blå linjerna i diagram 2C & D).
3. Skiva hjärnan
- Förbered skärstadiet genom att konstatera att det är dry, innan du applicerar en liten droppe superlim i mitten av scenen.
- Lyft hjärnan kvarter från SPS med hjälp av en spatel med rätt sida upp, och ta bort eventuell överflödig vätska från hjärnan med hjälp av små bitar av filterpapper. Då, med en enda rörelse, skjut hjärnan från spateln på droppe lim på scenen.
- För att förhindra hjärnan från torkning och limmet från att köra upp på sidorna av vävnaden, applicera några droppar av SPS med en pasteurpipett och placera skärsteg i skivkammaren. Rikta hjärnan blocket så att de områden av intresse (t.ex., cerebellar cortex) är vända bladet och därmed kommer att utsättas för minsta möjliga mekaniskt tryck innan den skivas.
- Skär varje skiva enligt tillverkarens instruktioner samtidigt ständigt gasning SPS i skärkammaren och temperaturen hölls vid 34-37 ° C. Håll temperaturen hos skärkammaren vid detta intervall genom att fylla external kammare i skivaren med uppvärmd renat vatten och byte av vatten när temperaturen sjunker för lågt.
OBS: skivning parametrar måste experimentellt hittas för varje typ av vävnad och nervceller som undersöks. I fallet med Campden SMZ 700 skivare med keramiska knivar och cerebellära Golgi celler, använder 0,75 mm amplitud vid 65 Hz och avancera hastighet på 0,05 mm / sek; för cerebellära nukleära neuroner högre amplitud och frekvens (1 mm och 90 Hz, respektive) och långsammare uppdateringshastighet (0,01-0,02 mm / sek) rekommenderas. För både Golgi och cerebellära nukleära nervceller bör snittjocklek vara 300 um. - Under skivning, inte tillåter skivorna att lägga sig på sig själva. Förhindra detta genom att försiktigt stödja dem med en mjuk borste, helst röra segmentet endast i områden som inte är av intresse för experimentet. Var försiktig så att borsten från att röra vibratome bladet; särskilt i fallet med de keramiska bladen, även en lätt kontaktkan skada bladet.
- Flytta varje skiva från skivkammaren till en återhämtning / håller kammaren med hjälp av en bred öppning, brand-polerat glas pasteurpipett.
- Låt skivorna vila i provkammaren under minst 1 timme före start av experimentet. Detta gör det möjligt för nedbrytningen av skadade eller döende vävnader och celler och därmed resulterar i en renare slice yta. Under den första timmen, hålla temperaturen hos SPS i kammaren i intervallet 34-36 ° C; se till att skivorna inte berörs av luftbubblor som kan skada skivorna eller göra dem flyta.
4. Experiment
- Efter 1 timme, låt den återvinningskammaren temperatur svalna till RT (17-25 ° C).
NOTERA: Detta kan förlänga den tidsperiod under vilken skivorna kan användas genom att bromsa tillväxten av bakterier samt cellulär metabolism. Denna period beror på hjärnregion och celltyp. Exempelvis kan vissa typer av Golgi celler befunnits vara friska i skivor8 h efter styckning medan andra typer endast varar 6 timmar. - Efter 1 timme har gått från skivning, använd skivor för olika elektrofysiologiska experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skivor som framställts på det beskrivna sättet kan användas för olika elektrofysiologiska och optogenetic experiment. I figur 3A och 3C visar vi ett representativt exempel på en horisontell cerebellär skiva och en koronala cerebral kortikal skiva, respektive, betraktas under differential interferens (DIC) optik. I lillhjärnan skiva, kan flera olika typer av cerebellära neuroner lätt igen på deras placering och cellkroppsform, vilket tillåter riktade elektrofysiologiska inspelningar. I figur 3B och 3D, exempel skrivs från hel-cell patch-clamp inspelningar i strömtång läge från ett spontant aktiv cerebellär Golgi cell och kortikala pyramidala celler visas. Ytterligare exempel på kvaliteten på elektrofysiologiska och optogenetic inspelningar framställda av varm-skivade hjärnor finns i Huang och Uusisaari 11 och Lefler et al. 16.
| koncentration [mM] | vikt (g / L) | |
| NaCl | 124 | 72,5 |
| KCl | 3 | 2,23 |
| KH 2 PO 4 | 1,2 | 1,63 |
| MgSO 4 * 6H 2 O | 1,9 | 4,3 |
| Glukos | 20 | 3,6 |
| NaHCOs 3 | 26 | 2,18 |
| CaCl2 | 2 | 1,109 |
Tabell 1. Sammansättning av standarden fysiologisk lösning.
Figur 1. Arrangemang av verktygen. 1. Stora saxar, 2. Små kirurgiska saxar, 3. Skalpell med blad nr 11, 4. fin spets pincett, 5. liten spatel, 6. Liten Petriskålar, 7. glasbägare för avjoniserat vatten, 8. glasbägare för värmde Gassed fysiologisk lösning, 9. Super lim, 10. Tunn pensel, 11. Pasteur pipett 12. Liten spruta, 13. Pentobarbital, 14. Filterpapper, 15. Skär skede.
. Figur 2. Schematisk bild av skallen och hjärnan dissektion (A) Ritning som visar öppningen av skallen att exponera hjärnan (B - D). Schematiska ritningar som beskriver planen för att skära hjärnan för de tre stora skivning plan. Den blå linjen visar det plan på vilket hjärnan ska limmas på.
Figur 3. Representativa resultat av metoden. (A) en horisontell cerebellär skiva obtained med den visade metoden. De tre stora lagren av cerebellar cortex (granulat cellskikt, GC skikt; Purkinje neuron skikt, PN skikt, molekylära skikt, ML) samt vita substansen (WM) anges. En patch-clamp elektrod schema dras på en Golgi cell (GOC) (skal: 40 pm). (B) exempel inspelning från Golgi-cell som visas i A. Inspelningen erhålls med en patch-clamp elektrod i strömklämma läge. (I svart: representativ spår av sex grå spår). (C) en koronala cerebral kortikal skiva som erhålls med den demonstrerade metoden. Kortikala pyramidala celler visas tillsammans med en schematisk ritning av en patch-clamp elektrod. (D) exempel patch clamp inspelning i strömtång läge, från pyramidcellen visas i (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visar ett förfarande för framställning av akut hjärnsnitt från möss i fysiologisk istället iskall temperatur.
Det har visats 11 att kvaliteten hos skivor framställda i varma förhållanden är överlägsen i jämförelse med de som framställts med kalla förhållanden, förutsatt att skivaren bladet har minimal vertikal vibration. Skivning i fysiologisk temperatur kan förhindra fysiologiska artefakter orsakade av låg temperatur, till exempel de som rör förändringar i metaboliska processer 17-19 som kan manifestera i aberrationer av encelliga samt nätverksbeteende. Dessutom, trots att skivning förfarandet uppenbarligen bör slutföras utan onödiga förseningar, det finns ingen anledning att skynda med skivning (som det är när skivning i iskalla förhållanden för att avsluta skär före lösningar blir för varmt, och för att förhindra att skador från långvarig frysning av vävnad). Således kan långsammare skärhastigheter vara ossed. Detta kan vara fördelaktigt vid skivning mycket känsliga strukturer. Sist, utelämna kylningssteget av båda lösningarna och i hjärnan minskar signifikant mängden tid som krävs för förfarandet samt dess komplexitet. Kylningen av lösningen på iskall temperaturen krävs ca 40 min mer än uppvärmning av lösningen till fysiologisk temperatur, vilket ger mer tid för experimentet själv.
Det har visats 20 att intensiteten av fluorescens i kortikala nervceller i GAD67-GFP möss är starkare när man undersöker skivor skurna i 20 ° C jämfört med de skurna i 0 ° C. Detta stöder dessutom tanken att skivning i iskallt temperatur utövar en skadlig in fl ytande på livskraft nervceller. Å andra sidan, i samma papper visades det att densiteten av fluorescerande neuroner reducerades i skivad erhölls vid 37 ° C jämfört med de som skärs vid 20 ° C. Kontroversen med resultaten kan Arise från det faktum att z-böjningen inte togs som hänsyn. Som nämnts ovan har z-avböjning ett starkt inflytande på vävnadskvalitet när skivning i fysiologisk temperatur, förutom kvaliteten på bladet och hastighet och andra inställningar för skivaren.
En av de avgörande delarna av förfarande innebär finjustering av skivaren bladet innan skivning. Till skillnad från när man använder iskalla lösningar där skivning sannolikt innebär både horisontell kapning samt vertikal "cracking" av de styva lipidmembraner, under fysiologiska förhållanden varje förflyttning av skivaren bladet i z-riktningen kommer att orsaka skador i vävnaden. För att minimera detta bör bladet vara så hård och rak som möjligt; i vår erfarenhet, konventionella rakblad har för många brister för att kunna användas. Knivar av hög kvalitet i rostfritt stål speciellt utformade för vibratome användning är bättre, men för bästa resultat föreslår vi enkel avfasade ceramic blad. Dessutom rekommenderar vi starkt att spendera mycket tid för perfekt horisontell inriktning av bladen eftersom detta har betydelse direkt slice kvalitet. Vi använder Campden 700SMZ skivare som tillåter inställning av kniven anpassningen så att vibrationen i z-planet är mindre än 0,5 | im. I själva verket är den mest avgörande begränsning av den heta skärmetoden beroendet av skivare blad kvalitet och stabilitet. Om dessa krav inte kan uppfyllas, är det lämpligt att använda den traditionella iskall skärmetoden i stället, trots de nackdelar skivning i iskallt lösning, såsom varierande osmolaritet från att vara delvis frysta.
Metoden demonstreras används för att erhålla horisontella skivor i cerebellum; med enkla modifieringar av samma metod kan användas för att få skivor i antingen den koronala eller sagittalplanet, från många andra regioner i förgrunden - eller mitthjärnan liksom hjärnstammen. För skivor av de mest främre delarna av framhjärnan och olfactory systemet bör skallen klippas mer anterior att förhindra skador på dessa delar. Vi håller målmedvetet metoden så enkel och kort som möjligt och inte använder pre-perfusion av djuret, inte heller vi ut någon av komponenterna i fysiologisk lösning för kapning. Detta gör att metoden som ska ändras i enlighet med den specifika neuronala subtyp av intresse. Det är troligt att ändringar av skärlösningar (som beskrivs i referenserna i inledningen) ytterligare kan förbättra lönsamheten för skivor och robusthet av resultat. I allmänhet bör metoden vara kompatibel med de flesta andra vanliga fysiologiska lösningar som vanligen används för elektrofysiologiska inspelning.
I den metod som visas här, är skivor skärs 300 | im tjock. Den optimala skiva tjocklek beror på den skivade hjärnregion och cellerna av intresse. För nätverksintegritet överväganden bör skivorna inte vara tunnare än 250 ^ m, och på grund av diffusionsbegränsningar den uppper gränsen för snittjockleken är ~ 400-450 nm.
Ett kritiskt steg i denna metod gäller limning hjärnan till skärsteget, eftersom även små instabilitet i vävnaden kan resultera i ojämn eller oanvändbara skivor. Därför bör man vara noga med att se till att hjärnans yta har inget överskott SPS när det sänks ned på limmet drop; också, kommer för mycket lim resultera i hjärnan som ligger ojämnt på scenen och eventuellt lossnar från scenen under skärning. Dessutom kanske överflödigt lim smyga sig på vävnads sidorna och, förutom att införa homogen i skivor, kan skada bladet.
Det finns några problem som kan uppkomma vid byte av skiv protokollet från iskalla metod till demonstrerade heta metoden. En av svårigheterna är uppkomsten av bakterier i skivorna. Av denna anledning är det viktigt att desinficera verktygen, kammaren, och den skivning bad med etanol innan förfarandet. Också, att vridafrån värmesystemet i återhämtnings badet efter 1 timme bromsar bakterietillväxt.
Slutligen bör det understrykas att den förbättrade hälsan hos nervceller i skivor skurna i fysiologisk temperatur också skulle kunna leda till förändringar i deras inneboende egenskaper. Därför är det tillrådligt att utföra en första jämförelse av de erhållna resultaten från skivor med både kalla och varma metoder, speciellt om de experiment som är en del av ett längre projekt med tidigare arbeten utförts med användning av den kalla metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg/ml in physiological saline. |
| Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
| Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5–2 cm |
| Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
| Small spatula | Fisher | 2350 | |
| Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
| Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Slicer | Campden | 7000-smz | |
| Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
| Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
| Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
| Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
| Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |
References
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
