Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تحفيز Optogenetic من العصب السمعي

Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/52069
Automatic Translation
1,2,5, 1,3, 3, 1, 1, 3, 1,2,4
1InnerEarLab, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 2Bernstein Focus for Neurotechnology, University of Goettingen, 3Auditory Systems Physiology Group, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 4Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University of Goettingen, 5Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, University of Guanajuato

Summary

زراعة قوقعة (CIS) تمكين السمع بواسطة التنبيه الكهربائي المباشر من العصب السمعي. ومع ذلك، وضعف وتيرة وشدة قرار يحد من جودة السمع مع رابطة الدول المستقلة. نحن هنا وصف optogenetic تحفيز العصب السمعي في الفئران باعتبارها استراتيجية بديلة للبحث السمعي وتطوير التهيئة المستقبلية.

Abstract

التحفيز الكهربائي المباشر من الخلايا العصبية العقدة الحلزونية (SGNs) من خلال زراعة قوقعة (CIS) يتيح الفهم خطاب مفتوح في غالبية المواضيع صماء مزروع 1- 6. ومع ذلك، ترميز الصوت مع التهيئة الحالية لديه ضعف وتيرة وشدة قرار بسبب انتشار واسع الحالي من كل اتصال القطب تفعيل عدد كبير من SGNs على طول محور التوضع النغمي من القوقعة 7- 9. ويقترح التحفيز البصري كبديل لالتحفيز الكهربائي الذي يعد أكثر مكانيا تنحصر تفعيل SGNs، وبالتالي، قرار تردد أعلى من الترميز. في السنوات الأخيرة، وقد استخدمت الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء مباشرة من القوقعة لاستحضار الردود في العصب السمعي 10. ومع ذلك فإنه يتطلب طاقات أعلى من التحفيز الكهربائي 10،11 وعدم اليقين لا يزال لآلية الكامنة 12. نحن هنا تصف طريقة استنادا optogenetics لتحفيز SGNsمع كثافة منخفضة الضوء الأزرق، وذلك باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير العصبية من channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 أو التعبير بوساطة فيروس من قبض ChR2-البديل 14. كنا ضوء الصغير الثنائيات (μLEDs) وأشعة الليزر، بالإضافة إلى تحفيز ألياف SGNs، معربا عن ChR2 من خلال فتحة صغيرة الاصطناعي (فغر القوقعة) أو إطار جولة. نحن يعاير ردود التسجيلات فروة الرأس من إمكانات أثار ضوئية (optogenetic استجابة الدماغ السمعية: oABR) أو عن طريق التسجيلات مسرى مكروي من المسار السمعي وقارنوها مع التحفيز الصوتية والكهربائية.

Introduction

وفقا لمنظمة الصحة العالمية، 360 مليون شخص في العالم يعانون من فقدان السمع. في موضوعات صماء، التحفيز الكهربائي المباشر للSGNs بواسطة التهيئة تمكين الفهم خطاب مفتوح في أغلبيتهم 1،2،4،5. على الرغم من التهيئة تم زرعها في أكثر من 200،000 شخص، وبالتالي كونها neuroprosthesis أنجح، ترميز الصوت مدفوعا زراعة قوقعة الحالية محدودة. تستند التهيئة على التحفيز الكهربائي من قبل عدد معين من الأقطاب الكهربائية حيث كل واحد ينشط منطقة التوضع النغمي من العصب السمعي وبالتالي تجاوز الجهاز الحسي مختلة كورتي في القوقعة. يمكن المستمعين السمع يميز أكثر من 2،000 الترددات، لكن استخدام عناصر التهيئة اليوم فقط ما يصل الى 12-22 تردد القنوات 4. هذا يرجع إلى تدفق التيار الكهربائي على نطاق واسع من كل 7،9 تحفيز وتفعيل عدد كبير من SGNs التي تمثل العديد من الترددات الصوتية المختلفة 8،15. هذايمكن تحسين الحد باستخدام التحفيز متعدد الأقطاب ولكن على حساب زيادة استهلاك الطاقة 16،17. على النطاق الديناميكي الناتج عن شدة الصوت محدودة أيضا، وعادة أقل من 4،18 ديسيبل 6-20. لهذه الأسباب، وتحسين وتيرة وشدة قرار هي أهداف هامة لزيادة أداء CI لتحسين التعرف على الكلام في البيئات الصاخبة، فهم علم العروض والموسيقى التصور.

وثمة خيار آخر لتحفيز العصب السمعي هو التحفيز البصري. الضوء يمكن أن تركز بشكل ملائم لاستهداف السكان SGN صغير، واعدا الحبس المكاني أفضل، وزيادة وتيرة وأيضا قرار توسيع النطاق الديناميكي، مما أدى إلى قرار كثافة أفضل. في الواقع، أظهرت التحفيز القوقعي مع ضوء الأشعة تحت الحمراء قرار تردد ممتازة في النماذج الحيوانية 10،11،19. ومن عيوب هذا النوع من التحفيز هو أنه يتطلب طاقات أعلى من التحفيز الكهربائي 12،20 مباشرة.

كبديل لتحفيز الأشعة تحت الحمراء، ونحن توظيف optogenetics لتقديم SGNs ضوء حساسية. Optogenetics هو النهج الجديد الذي يجمع بين التقنيات الوراثية والبصرية لغير جراحية وتحديدا السيطرة على الخلايا بدقة عالية الزمنية (مراجعات 21- 23). طريقة حاليا الأكثر استخداما توظف التعبير عن الميكروبي channelrhodopsin 2 (ChR2) الجين من كلاميدوموناس reinhardtii ومتغيراتها، ترميز قناة الموجبة بوابات الخفيفة 24. ChR2 هو بروتين 7 عبر الغشاء الحلزوني أنه عندما transduced في الخلايا العصبية وتفعيلها من خلال الضوء الأزرق، تعمل قناة الموجبة وغير انتقائية، وبالتالي إزالة إستقطاب الخلايا 24- 27. تم ChR2 تتميز كذلك 24،28- 31 و وقد وضعت العديد من المتغيرات لتعديل التدبير العمومين الطيف، النابضة ونفاذية خصائص 32،33. والهدف من عملنا هو إنشاء optogenetics القوقعة لتفعيل المسار السمعي. نلاحظ أن النهج optogenetic لتحفيز العصب السمعي يتطلب التلاعب الجيني للالعقدة الحلزونية للتعبير عن channelrhodopsin. العمل مع الفئران والجرذان يسمح باستخدام حيوانات معدلة وراثيا المتاحة 13،34،35، والتي توفر التعبير عن channelrhodopsin مع تقلب قليلا على طول محور التوضع النغمي وعبر الحيوانات 36. الجمع بين الأليلات الشرطية المناسبة مع 37 لجنة المساواة العرقية خطوط يوفر للتعبير عن خلية محددة. نقل الجينات إلى العقدة دوامة من الحيوانات الأخرى يتطلب استخدام فيروس مثل فيروس الغدة المرتبطة وهذا هو نهج موحد في optogenetics 38 وأننا أظهرنا للعمل بشكل جيد في الفئران 36. التلاعب الجيني والتعبير عن الجينات المحورة ترميز البروتينات الغريبة المخاطر الدب الآثار الضارة مثل immuردود شمال شرق و / أو انتشار، حالة خطر أو حتى موت خلايا التلاعب وراثيا. لغرض هذه المظاهرة نستخدم الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ChR2 الخلايا العصبية في العقدة الحلزونية تحت PROMOTOR خاصتك-1 13 إلى تحفيز بصريا المسار السمعي. نلاحظ أن المتغيرات channelrhodopsin أخرى يمكن استخدامها لنفس الغرض كما أثبتنا باستخدام نقل الفيروس بوساطة من الصيد البديل 14 إلى 39 SGNs.

بينما optogenetics القوقعة يتطلب التلاعب الجيني، فإنه يوفر ضبط الجزيئي لتحسين SGN التحفيز والوعود تحسين تواتر وشدة قرار بالمقارنة مع التحفيز الكهربائي. التحفيز Optogenetic من المسار السمعي هو ذات الصلة للغاية لأبحاث السمع. على سبيل المثال، يعد التقدم في دراسات صقل تعتمد على النشاط tonotopy من خلال التنمية، في تحليل متطلبات الاندماج الطيفي في localizat الصوتايون ومدى التفاعل بين التوقعات تردد محدد وارد في النظام السمعي المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب التي قدمت في هذا العمل مع المعايير الأخلاقية التي يحددها القانون الألماني لحماية حيوانات التجارب. وافق مجلس جامعة غوتنغن لرعاية الحيوان والرفق بالحيوان مكتب ولاية ساكسونيا السفلى التجارب.

1. إعداد μLED-مشجعا

  1. لμLEDs، وإعداد للمشجعا μLED أولا. استخدام المصابيح الزرقاء مع 200 من 200 ميكرون السطح النشط (μLED، انظر الجدول المواد).
  2. أسلاك لحام إلى μLED. ثم، تغليف μLED والاتصالات باستخدام الغراء الايبوكسي. ترك بين عشية وضحاها جهاز للسماح للعلاج الايبوكسي.
  3. لتحقيق الاستقرار الميكانيكية والعزل الكهربائي بضخ الأسلاك من خلال الزجاج الشعرية رقيقة، استخدم 1 ملم القطر الخارجي البورسليكات الشعيرات الدموية وختم تقاطع مع الايبوكسي (الشكل 1D) بحيث الشعرية يمكن تركيبه على مناور الميكانيكية.
    ملاحظة: Tهنا هو مفاضلة جعل كبسولة سميكة بما فيه الكفاية للحصول على العزل الكهربائي جيدة (تجنب القطع الأثرية التحفيز)، ولكن رقيقة بما فيه الكفاية للسماح للLED التحرك بحرية داخل الفقاعة، وتحديد موقعه على فغر القوقعة. وهو ممارسة جيدة لإعداد LED أكثر من واحد.
  4. لتأكيد العزل الكهربائية جيدة، وإعداد أول طبق بتري مع كلوريد الصوديوم 0.9٪ وتراجع 3 العارية الأسلاك النحاسية انتهت في السائل. هذا يعمل على محاكاة حيوان مع أقطاب ABR. ربط الأسلاك إلى ABR مكبر للصوت ومن هناك إلى الذبذبات.
  5. بعد ذلك، ربط LED للمشجعا وتزج به إلى الحل حتى يتم تغطيتها تماما. محرك الصمام مع البقول (راجع الخطوة 3.1.1) في الحد الأقصى المسموح به التيار لمدة أطول من 20 دقيقة والتحقق من وجود القطع الأثرية التحفيز. إذا ظهورها، تجاهل LED ومحاولة واحدة جديدة.

2. الإجراء الجراحي

  1. استخدام 4-10 أسابيع من العمر الفئران المعدلة وراثيا معربا عن ChR2 تحت المروج Thy1.2 (خط 9في وانغ وآخرون 13). لمعالجة الحيوان وإجراء الجراحة، دائما استخدام أدوات جراحية نظيفة والمحددة جيدا.
  2. تخدير الحيوانات مع حقنة الملكية الفكرية من خليط من يوريتان (1.32 ملغ / كلغ)، زيلازين (5 ملغ / كلغ)، والبوبرينورفين 0.1 ميكروغرام / غرام مخففة في 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم المعقم ووضع الماوس على لوحة التدفئة للحفاظ على الجسم درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. مع هذه الجرعة، والتخدير وعادة ما يستمر لمدة البروتوكول التجريبي كله.
    1. تبدأ في 10 دقيقة بعد الاختيار الأولي تحريض التخدير عن علامات الإثارة التي لا ارادي مخلب الانسحاب. في حالة الحركات، وتطبيق جرعات صيانة يوريتان (0.66 ملغ / كلغ) والبوبرينورفين (0.05 ميكروغرام / غرام) المخفف في 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم المعقم (بدون زيلازين). التحقق مرة أخرى منعكس مخلب الانسحاب والمضي قدما إلا إذا كان رد الفعل غائب.
  3. حلاقة بعناية المنطقة خلف الأذن في إعداد شق. استخدام خلف الأذنالاقتراب للوصول إلى الفقاعة (تجويف الأذن الوسطى التي تحتوي على الهواء).
    1. مع ملقط تشريح الصغرى بعناية و / أو إزالة جزء من عضلات الرقبة، على سبيل المثال، لل platysma، القصية الترقوية الخشائية، وscalenes.
    2. البحث وفضح الفقاعة (الشكل 1A). تحديد الفقاعة كهيكل عظمي مع الشكل الكروي المميز مع عصابة على سطح الفقاعة التي تشير إلى الإدراج في الغشاء الطبلي (الشكل 1A). جعل ثقب مع غيض من إبرة الأنسولين فقط دون هذه الحلبة. تبدأ هناك، وإزالة العظام التي تغطي الفقاعة مع مقراض غرامة (القضام) أو microforceps في مثل هذه الطريقة أن الطنف من القوقعة يتعرض (الشكل 1B).
  4. لفغر القوقعة، حلاقة بلطف قبالة كبسولة عظمية لفتح نافذة صغيرة (فغر القوقعة: ~ 500-800 ميكرون)، مع الحرص على ترك سليمة والتيه الغشائي (الشكل 1B). إجراء فغر القوقعة على القوقعة الثانيةبدوره كما هو الآن ما يكفي من الشريان الركابي ومن قمة. يمكن فتح ذروة إنتاج تمزق القوقعة بما في ذلك كسر في عماد القوقعة.
  5. لنافذة الإدراج جولة من الألياف البصرية أو μLED-الزرع إلى السقالة الطبلية، تكبير بعناية النافذة المستديرة المتخصصة التي كتبها خدش مكانة عظمي مع غيض من مشرط حاد (شفرة رقم 11 هو خيار جيد). دائما استخدام شفرة جديدة أو مشرط. نكون حذرين للغاية كما يعمل الشريان الركابي قريب جدا من نافذة مستديرة (الشكل 1B).

3. البصرية عن طريق تحفيز نهجين

  1. لتحفيز transcochlear، μLEDs أو الألياف إلى جانب استخدام الليزر.
    1. جبل الشعرية تحمل μLED على مناور الميكانيكية وبعناية وضع μLED على فغر القوقعة. استخدام oABR، التي تسببها 3-10 التحفيز طويلة مللي ثانية من مصدر الحالي (عادة 5-40 مللي أمبير في 2.7 V) في 1-5 هرتز، كوسيلة لتحسين الموقف وأوientation من μLED.
    2. لتحفيز الليزر، واستخدام 473 نانومتر المستمر موجة الليزر والألياف البصرية 250 ميكرون (انظر المواد). زوجين الألياف البصرية إلى مصدر الليزر الأزرق الذي يقدم مثالي السيطرة التناظرية سريعة من الطاقة (آخر استخدام جهاز صوتية أو بصرية أو مصراع سريع لتحديد التحفيز البصري). باستخدام مياداة مجهرية، موقع غيض من الألياف مباشرة على فغر القوقعة وإصلاحه هناك باستخدام الاسمنت الأسنان (التحفيز transcochlear).
  2. لتحفيز intracochlear، إدراج الألياف من خلال النافذة المستديرة في طبلة الأذن سكالا. ثم استخدم 3-10 نبضات الليزر ميللي ثانية من 10-30 ميغاواط (قوة الانتاج الألياف) في 1-5 هرتز للحصول oABR. سعة كبيرة من oABR تمكن المجرب لمراقبة oABR التي حركها المحفزات واحدة على الذبذبات لتحسين الموقف والتوجه للباعث (μLED أو الألياف) باستخدام oABR السعة باعتبارها من القراءة.
  3. متى تحققت oABR جيدة، وتحديد الألياف مع cyanoacrylate الغراء أو الأسمنت الأسنان والانتظار حتى الغراء الصلبة.
    ملاحظة: فمن الطبيعي أن نلاحظ بعض السائل الخروج من القوقعة. ومع ذلك لتجنب المشاكل مع البلمرة من الأسمنت، فإنه من المستحسن أن تجف المنطقة باستخدام الفتائل القطن غرامة.

4. تسجيلات oABR

  1. إدراج أقطاب الإبرة تحت الصيوان، على قمة الرأس وعلى الظهر بالقرب من الساقين وربطها مكبر للصوت.
  2. تضخيم إمكانات الفرق بين قمة الرأس وإبر تحت الجلد الخشاء. عينة بمعدل 50 كيلوهرتز و فلتر (1-10،000 هرتز). تصور إمكانية الاختلاف على الذبذبات مثالي بالقرب من الإعداد الأمثل لتسجيل موقف مشجعا البصرية. استخدام إشارة المتوسط ​​(50-1،000x) وتخزين البيانات على الكمبيوتر للتحليل غير متصل.

5. تسجيلات من إمكانات بصريا مستدعى الميدانية المحلية

  1. وضع الحيوان في إطار المجسم. باستخدام ملقط المائةمسيرة سحب الجلد المغطي الجمجمة وإجراء شق متوسط ​​مع مقص تمتد تقريبا من بين العينين إلى النقطة التي نعلق عضلات الرقبة إلى الجمجمة.
    1. يعكس الجلد أفقيا. قطع السمحاق طوليا على طول الدرز السهمي وإزالته sideward عن طريق فرك بلطف عظم الجمجمة يتعرض مع مسحة القطن.
  2. وضع لوحة معدنية العرف على الجمجمة يتعرض ترك حوالي 1 مم الفضاء بين نهاية الذيلية من لوحة وامدا. مع 0.7 مم حفر بعناية حفر حفرة في العظم الجداري.
  3. المسمار بلطف في 0.85 ملم قطر المسمار - لتكون بمثابة مرجعية لإمكانات المسجلة من أكيمة السفلي (IC) - عقد المسمار مع ملقط طالما لا المسمار تثبيتها بشكل آمن. ضمان اتصالات جيدة بين المسمار والجافية دون اختراق الدماغ. الغراء والمسمار لوحة معدنية على الجمجمة مع الغراء cyanoacrylate.
  4. تخفيف نإيك العضلات بلطف من الجمجمة. سحب عضلات الرقبة نحو caudally لحوالي 1-2 ملم. تحديد تقاطع الجيوب الأنفية متفوقة سهمي (SSS) والجيوب الأنفية عرضية (TS). إذا لزم الأمر، وزيادة الشفافية في الجمجمة بواسطة تبليل العظام بمحلول كلوريد الصوديوم الفسيولوجية.
    1. تحديد IC في الفئران والكذب الذيلية مباشرة إلى نظام الضمان الاجتماعي وTS التقاطع. بعد تحديد موقع IC ببطء وبعناية إجراء حوالي نقب تمديد 0.5 ملم إلى 1.5 ملم rostrally نحو caudally إلى TS وحوالي 3 ملم أفقيا.
    2. تجنب أية إصابة في نظام الضمان الاجتماعي وTS لأن هذه من شأنه أن يحول دون تجربة ناجحة. هنا، واختبار ما إذا كانت العظام trepanned أصبحت فضفاضة التي دفعت به بهدوء. باستخدام ملقط رفع ببطء قبالة العظام.
  5. مع محول مناسب إرفاق مجموعة متعددة وheadstage الصعود إلى مياداة مجهرية. لمنع تدمير مجموعة تسجيل الأقنية خلال الإدراج في IC، بعناية إزالة الجافيةمع طرف عازمة إبرة تحت الجلد صغيرة بدأت قريب من حافة العظام.
    1. إزالة الحيوان من الإطار التجسيمي. إصلاح لوحة معدنية على شريط البقاء تثبيت التجسيمي. وضع المسبار تسجيل على IC وأدخلها تحت السيطرة المجهرية مثل أن أعلى معظم قناة مرئيا فقط على السطح.
  6. تضخيم إمكانات الفرق بين القنوات الفردية للمجموعة تسجيل والمسمار إشارة في العظم الجداري، عينة بمعدل 32 كيلو هرتز، مرشح تمرير منخفض (300 هرتز) وتخزينها على جهاز كمبيوتر لتحليل غير متصل.
  7. كل الحيوانات يجب أن يتم التخلص إنسانية في نهاية الإجراء قبل الاستعادة مخدر وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة القتل الرحيم. قد تتضمن أساليب مناسبة من القتل الرحيم خلع عنق الرحم أو CO 2 الاستنشاق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفغر القوقعة الأمثل أمر بالغ الأهمية ويزيد من احتمال وجود تجربة ناجحة، وهذا يعني أن الإطار النظامي، صغيرة، وليس هناك إصابة الهياكل قوقعة الأذن الداخلية. على سبيل المثال، يشير النزيف الضرر للعائي السطر. ويرد مثال جيد في الشكل 1B.

استخدام الفئران المعدلة وراثيا ChR2، وأعرب عن ChR2 في SGNs داخل القوقعة (الشكل 1C). ضوء إضاءة زرقاء، إما عن طريق μLED أو الليزر، ويتسبب oABR كبيرة، والتي تختلف من ABR الصوتية (aABR) في السعة والموجي. oABR (الشكل 1F) لديها سعة أكبر من aABR (الشكل 1E) لكنها مماثلة لABR الكهربائية (eABR، الشكل 1G). يمكن تفسير ذلك على oABR وeABR التوظيف يعكس أكثر SGNs و / أو تفعيل أكثر متزامنة من SGNs من لصوت أثار aABR.

الإقليم الشمالي "> لانتزاع eABR القوارض CI الكهربائية (MED-EL) تم إدراجها في إطار جولة وكنا البقول الحالية ثنائية الطور (80 μsec مدة المرحلة 20 μsec مدة البيني، 500 أمبير، 6 هرتز معدل التحفيز) لتحفيز والمتوسط الردود على 100 التكرار التحفيز. تحفيز 2 مع أقطاب التنغستن معزول الزجاج (1 و 1 داخل خارج القوقعة) هو ممكن أيضا.

من المهم أن نلاحظ أن oABR هم لا يمكن كشفها في الحيوانات البرية نوع، بعد تثبيط قنوات الصوديوم الجهد بوابات أو بعد التضحية الحيوانات 39. هذه التجارب تجعل السيطرة التدفئة كآلية الكامنة ABRs أثار بصريا غير مرجح.

علينا التحقق من انتشار النشاط من خلال المسار السمعي من التسجيلات خارج الخلية في الجهاز السمعي المركزي. للحصول على مثال، وتحفيز optogenetic من القوقعة أثارت أيضا النشاط العصبي في الدماغ المتوسط ​​السمعي (أكيمة رديئة، الشكل2).

الشكل 1
الشكل 1: إجراء العمليات الجراحية، μLED إعداد وتسجيل oABR (A) تشريح عضلات الرقبة يفضح الفقاعة؛ مراقبة شكلها الكروي المميز والحلبة حيث إدراج طبلة الأذن إلى العظام، والتي يمكن استخدامها كمعلم. شريط النطاق 1 مم. (B) افتتاح الفقاعة سوف تعرض الطنف. تم إجراء فغر القوقعة على تحويل القوقعة الثاني. يشار إلى معالم أخرى، من بينها الشريان الركابي. شريط النطاق 1 مم. (C) ChR2-YFP التعبير في SGNs. Immunolabeling لGFP (الخضراء) وphalloidin-AF-568 (الحمراء). شريط النطاق 50 ميكرون. (D) μLED، سلكي لكن ليس بعد ضخها في الشعرية. شريط النطاق 1 مم. (E)، (F) و (G) مثال تمثيليق من aABR (انقر فوق، 20 هرتز، 80 ديسيبل)، oABR (2 ميللي ثانية، 1 هرتز، 4 ميغاواط / مم 2) الناجم عن التحفيز وLED eABR (900 أمبير، 20 هرتز) عبر الأقطاب الكهربائية التنغستن معزول الزجاج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
ويوجه محاكمة واحدة امكانات الحقل المحلية المسجلة من IC بعد الصوتية، optogenetic، والتحفيز الكهربائي القوقعة والتمثيل التخطيطي لجنة التحقيق تسجيل متعدد القنوات على الجانب الأيسر من كل لوحة: الشكل 2. (A) عروض واحدة من نغمات نقية مع ترددات مختلفة (80 ديسيبل SPL) تؤدي إلى الانحدار مميز من النشاط مع ترددات منخفضة نسبيا مما يؤدي إلى تفعيل أكثر سطحية من ترددات أعلى. وتستخدم هذه الملاحظة إلى evaluatالبريد الإدراج الناجح لمجموعة تسجيل متعدد القنوات في IC. (B) التحفيز البصري (24 ميغاواط، مدة 6 ميللي ثانية) و (C) التحفيز الكهربائي (ثنائي الطور، مدة 80 μsec المرحلة، 20 μsec مدة البيني، 500 أمبير) أدى أيضا إلى امكانات الحقل المحلية في كثير من الأحيان IC اظهار سعة استجابة مماثلة. (D) بتوضع الجراحي بما في ذلك IC وكذلك جزء من المخيخ. شريط النطاق 5 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف التجارب تثبت التحفيز optogenetic من SGNs، ويمكن، من حيث المبدأ، يمكن استخدامه أيضا لتحفيز خلايا الشعر الداخلية و / أو الخارجية، قدمت التعبير عن opsins. هذه التجارب تتطلب الكثير من الصبر والرعاية. كما ذكر من قبل، الخطوات الأكثر أهمية هي جيدة فغر القوقعة / جولة نافذة الإدراج فضلا عن الموقف المناسب والتوجيه من مصدر الضوء.

هناك قيود مع التحفيز optogenetic عند استخدام ChR2. في حالتنا oABR زيادة السعة مع شدة الضوء ومدة النبضة ولكن عندما ينخفض ​​معدل التحفيز يزيد 15. يعتمد الكمون ردا أيضا على شدة الضوء، وخفض كثافة عندما يزيد التحفيز. نقترح أن هذه الردود هي نتيجة لحركية من ChR2 وعدد من القنوات التي أعرب عنها في SGNs. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسبب ارتفاع ChR2 اضافية، والفشل وغشاء الجمع المحتملين في ارتفاع عالمعدلات 27،40. فقد كانت هناك جهود متواصلة للتغلب على هذه القيود 32،33. لقد ذكرت مؤخرا استخدام التعبير بوساطة فيروس من قبض ChR2-14 البديل في SGNs، التي خفضت متطلبات الضوء ويسمح ارتفاعه إلى معدلات أعلى من التحفيز 39. مؤخرا ذكرت المختبر بويدن على كرونوس، وهو channelrhodopsin مع حركية أسرع والحساسية للضوء عالية 41.

نقترح أن التحفيز optogenetic للمسار السمعي يمكن أن تسهم في البحث والسمعية، في المستقبل، إلى الأطراف الصناعية قوقعة. ونحن نعتبر أنه يمكن تحسين التعرف على الكلام والإدراك من علم العروض والموسيقى. ترجمة هذا النهج إلى العيادة تتطلب العديد من التطورات الهامة مثل الاستفادة المثلى من channelrhodopsins، وتطوير تكنولوجيا متعددة القنوات التحفيز البصرية لزرع القوقعة البصرية فضلا عن مظاهرة السلامة الأحيائية لstimula البصرينشوئها والتلاعب الجيني على المدى الطويل SGNs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (بيرنشتاين التركيز العصبية لمنح 01GQ0810، لT. موسر، وMED-EL ألمانيا)؛ المؤسسة الألمانية للبحوث من خلال مركز النانو المجهري وعلم وظائف الأعضاء الجزيئية في الدماغ (FZT 103، T. موزر) ومن خلال SFB889، لN. Strenzke وT. موزر).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
  2. Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
  3. Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
  4. Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
  5. Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
  6. Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
  7. Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
  8. Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
  9. Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
  10. Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
  11. Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
  12. Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
  13. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  14. Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  15. Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
  16. Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
  17. Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
  18. Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
  19. Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
  20. Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  22. Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
  23. Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  24. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  25. Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
  26. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
  29. Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
  30. Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
  31. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
  32. Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
  33. Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
  34. Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  35. Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
  36. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  37. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
  38. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  39. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  40. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
  41. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Tags

علم الأعصاب، العدد 92، السمع، وزرع القوقعة، optogenetics، channelrhodopsin، التحفيز البصري، الصمم
تحفيز Optogenetic من العصب السمعي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing,… More

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter