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Neuroscience

청각 신경의 자극 Optogenetic

Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/52069
Automatic Translation
1,2,5, 1,3, 3, 1, 1, 3, 1,2,4
1InnerEarLab, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 2Bernstein Focus for Neurotechnology, University of Goettingen, 3Auditory Systems Physiology Group, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 4Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University of Goettingen, 5Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, University of Guanajuato

Summary

인공 와우 (CI를) 청각 신경에 직접 전기 자극으로 청각 수 있습니다. 그러나 가난한 빈도와 강도 해상도의 CI와 청각의 품질을 제한합니다. 여기에서 우리는 청각 연구와 미래의 CI 개발을위한 대안 전략으로 생쥐에서 청각 신경의 optogenetic 자극을 설명합니다.

Abstract

인공 와우 (CI에)에 의해 나선 신경절 신경 세포 (SGNs) 직접 전기 자극을 이식 청각 장애인 과목 1-6 대부분의 오픈 음성 이해를 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재의 CI와 사운드 코딩으로 인해 달팽이관 7-9의 tonotopic 축을 따라 SGNs의 큰 숫자를 활성화하는 각 전극 접촉에서 폭 넓은 전류 확산 가난한 빈도와 강도의 해상도를 가지고있다. 광 자극은 공간적으로 더 따라서 SGNs의 활성화를 밀폐과 약속 전기 자극, 부호화 높은 주파수 해상도의 대안으로서 제안되었다. 최근, 달팽이관 직접 적외선 조명 청신경 (10)에 응답을 연상하는 데 사용되어왔다. 전기 자극 10, 11 및 불확실성이 기반이되는기구 12로 남아보다 그럼에도 불구하고 더 높은 에너지를 필요로한다. 여기에서 우리는 SGNs을 자극하는 optogenetics를 기반으로하는 방법을 설명channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 ChR2 변종 캐치 14의 바이러스 매개 표현의 신경 식으로 형질 전환 마우스를 사용하여 낮은 강도 푸른 빛과 함께. 우리는 작은 인공 개구부 (cochleostomy) 또는 둥근 창을 통해 ChR2 - 표현 SGNs을 자극하는 다이오드 (μLEDs) 및 광섬유 결합 발광 레이저 마이크로 빛을 사용했습니다. 우리는 빛을 유발 전위 (optogenetic 청성 뇌간 반응 : oABR)의 두피 녹음하여 응답을 정량 또는 청각 경로에서 미세 전극 기록에 의해 음향 및 전기 자극으로 그들을 비교했다.

Introduction

세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 3억6천만명는 전 세계적으로 청력 상실로 고통. 청각 장애인 대상에서 CI에 의해 SGNs 직접 전기 자극 그들 1,2,4,5-의 대부분에서 열려 음성 이해를 할 수 있습니다. 비록 CI에 따라서는 가장 성공적인 neuroprosthesis되고, 20 만 명 이상에 이식되어, 현재 인공 와우 이식에 의해 구동 사운드 인코딩이 제한됩니다. CI에 각 하나가 청각 신경 따라서 달팽이관에 코르티 역기능 감각 기관을 우회 tonotopic 영역을 활성화 전극의 특정 번호에 의해 전기 자극을 기반으로합니다. 정상 청력 청취자 그러나 오늘날의 CI는 최대 12-22 주파수 채널 4에 사용, 2,000 개 이상의 주파수를 구별 할 수 있습니다. 이는 많은 다른 소리 주파수 8,15 SGNs을 나타내는 다수의 활성화 전극 7,9 각 자극에서 널리 전류 흐름이다. 이제한 다극 자극을 ​​사용하지만 높은 소비 전력 16,17의 비용을 개선 할 수있다. 소리 강도에 대한 그들의 출력 동적 범위는 일반적으로 6-20dB 4,18 이하로 제한된다. 이러한 이유로, 개선 빈도와 강도 해상도는 시끄러운 환경, 운율 이해와 음악 인식에서 음성 인식을 개선하기 위해 CI 성능을 향상시키기위한 중요한 목표입니다.

청각 신경을 자극하는 다른 옵션은 광 자극이다. 빛은 편리하게, 더 나은 공간 감금을 약속 주파수 해상도를 증가시키고 또한 더 나은 강도 해상도의 결과로, 동적 범위를 확대, 작은 SGN 인구를 대상으로 집중 될 수있다. 실제로, 적외선 빛을 가진 인공 와우 자극은 동물 모델 10,11,19 우수한 주파수 해상도를 보여 주었다. 자극이 종류의 한 단점은 전기 자극보다 높은 에너지를 필요로한다는 것이다 12,20 제기되어왔다.

적외선 자극에 대한 대안으로, 우리는 SGNs 민감한 빛을 렌더링하는 optogenetics를 사용합니다. Optogenetics 비 침습적으로 유전 및 광학 기술을 결합하고 특히 높은 시간 정밀도 (리뷰 21 - 23)와 세포를 제어하는 새로운 접근 방법이다. 현재 가장 많이 사용되는 양상은 인 Chlamydomonas reinhardtii에서의 미생물 channelrhodopsin 2 (ChR2) 유전자의 발현을 고용하고 빛 게이트 양이온 채널 24을 인코딩, 이들의 변종. ChR2는, 뉴런으로 형질 도입 및 청색 광에 의해 활성화 될 때, 이와 같이 세포를 24 - 27 탈분극 같은 비 선택적 양이온 채널을 작용 7 - 막 관통 나선 단백질이다. ChR2 잘 특징되었습니다 24,28- 31 많은 변종이 actio을 수정하기 위해 개발되었습니다n 개의 스펙트럼, 게이트 및 투과성 특성 (32, 33). 우리 연구의 목적은 청각 경로의 활성화를 위해 인공 optogenetics을 확립하는 것이다. 우리는 청각 신경을 자극하는 optogenetic 접근 방식은 channelrhodopsin의 발현에 나선 신경절의 유전자 조작을가 있어야한다는 사실을 명심해야합니다. 마우스 및 쥐와 함께 작업하는 것은 tonotopic 축을 따라 동물 36에서 약간의 변화와 함께 channelrhodopsin의 발현을 제공 사용할 수 형질 전환 동물 13,34,35의 사용을 할 수 있습니다. 적절한 Cre 호텔 라인과 조건부 대립 유전자 37을 결합하여 세포 고유의 표현을 제공한다. 다른 동물의 나선 신경절에 유전자 전달은 optogenetics 38 표준 방식 인 아데노 - 연관 바이러스와 같이 우리가 마우스 (36)에서 잘 작동하는 것을 보여 주었다 바이러스의 사용을 필요로한다. 유전자 조작과 같은 글로불린 등의 부작용에 ​​대한 외국인 단백질에게 곰 위험을 코딩하는 유전자의 발현북동 응답 및 / 또는 증식, 손상 상태 나 유 전적으로 조작 된 세포의 죽음. 이 데모의 목적을 위해 우리는 광학적으로 청각 경로를 자극하는 네-1 프로모터 13에서 나선 신경절 신경 세포에 ChR2을 표현 형질 전환 마우스를 사용합니다. 우리는 우리가 SGNs 39로 변형 캐치 14의 바이러스 매개 전송을 사용하여 설명 된대로 다른 channelrhodopsin 변종이 같은 목적을 위해 이용 될 수 있습니다.

인공 optogenetics는 유전자 조작을 필요로하지만, 최적화 SGN 자극 분자에 대한 튜닝을 제공하고 전기 자극에 비해 약속 주파수 및 세기 해상도를 향상시켰다. 청각 경로의 Optogenetic 자극은 연구 청각에 매우 관련이있다. 예를 들어, 사운드의 스펙트럼 localizat 통합 요구 분석, 개발 중에 tonotopy의 활성에 의존하는 정제의 연구 발전을 약속이온 및 중앙 청각 시스템의 주파수 별 심성 돌기 사이의 상호 작용의 정도.

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Protocol

본 연구에 제시된 모든 실험은 실험 동물의 보호 독일어 법에 의해 정의 윤리 기준으로 실시 하였다. 동물 복지에 대한 대학 괴팅겐의 보드 및 니더 작센의 상태의 동물 복지 사무소는 실험을 승인했다.

μLED - 자극기의 1 준비

  1. μLEDs를 들어, 첫번째 μLED - 자극기를 준비합니다. 200 μm의 활성 표면에 의해 200 블루 LED를 사용 (μLED, 재료 표 참조).
  2. μLED에 솔더 와이어. 이어서, μLED 에폭시 접착제를 이용하여 연결을 캡슐화한다. 에폭시 경화 수 있도록 장치 하룻밤 둡니다.
  3. 기계적 안정성 및 전기 절연성이 얇은 유리 모세관을 통해 와이어를 깔때기를 들어, 1mm 외경 보로 실리케이트 모세관을 사용하여 모세관 기계적 머니퓰레이터에 장착 될 수있다 (도 1D)되도록 에폭시 접합부를 밀봉.
    참고 : T여기에 충분한 두께 (자극 유물을 피) 좋은 전기 절연을 얻을 수있는 캡슐을 만드는 트레이드 오프,하지만 LED가 수포 내에서 자유롭게 이동할 수 있도록하고 cochleostomy에 그것을 찾을 정도로 얇은입니다. 그것은 하나 이상의 LED를 준비하는 것이 좋습니다.
  4. 좋은 전기 절연을 확인하려면 먼저 액체로 0.9 % 염화나트륨 및 딥 3 베어 종료 구리 와이어와 페트리 접시를 준비합니다. 이것은 ABR 전극과 동물을 시뮬레이션하는 역할을한다. ABR 앰프와 거기에서 오실로스코프에 전선을 연결합니다.
  5. 이어서, 자극기에 연결하고 LED가 완전히 피복 될 때까지 용액으로 몰입. 이상 20 분 동안 최대 허용 전류에서 펄스 ​​(단계 3.1.1 참조) LED 자극 아티팩트 드라이브 검사. 나타나는 경우, LED를 폐기하고 새로운 시도.

2 수술

  1. Thy1.2 프로모터에서 ChR2을 표현 4-10주 된 형질 전환 마우스 (9 호선을 사용하여왕의 등. 13). 수술을 동물을 조작하고 수행하려면, 항상 깨끗하고 잘 식별 된 수술 도구를 사용합니다.
  2. 우레탄 (1.32 밀리그램 / kg), 자일 라진 (5 밀리그램 / kg)의 혼합물의 IP 주입하여 동물을 마취하고, 부 프레 노르 핀 0.1 μg / g 0.9 % 멸균 염화나트륨 용액으로 희석하고, 신체를 유지하기위한 가열 플레이트 상에 마우스를 배치 37 ° C의 온도. 이 용량으로, 일반적으로 마취 전체 실험 프로토콜에 대한 지속됩니다.
    1. 발 철수 반사에 의한 흥분의 흔적이 초기 마취 유도 검사 후 10 분 시작. 운동의 경우에, (자일 라진)없이 0.9 % 멸균 NaCl 용액에 희석 우레탄 (0.66 밀리그램 / kg) 및 부 프레 노르 핀 (0.05 μg / g)의 유지 투여 량을 적용한다. 다시 발 철수 반사를 확인하고 반사가없는 경우에만 진행합니다.
  3. 조심스럽게 절개의 준비 retroauricular 영역을 면도. retroauricular을 사용하여수포 (공기 함유 중이강)에 도달하는 접근.
    1. 마이크로 포셉 신중하게 해부 및 / 또는 예를 들면 목 근육의 일부, 활 경근, 흉쇄 및 scalenes을 제거와 함께.
    2. 찾아 수포 (그림 1A)를 노출합니다. 고막 (그림 1A)의 삽입을 나타내는 수포 표면에 반지와 특성 구형과 뼈 구조로 수포를 확인합니다. 바로이 반지 아래 인슐린 바늘의 끝이 구멍을 확인합니다. 달팽이관 promontorium은 (도 1b)에 노출되는 방식으로 미세 Rongeur (gnawer) 또는 microforceps과 수포 커버 뼈 제거가 시작.
  4. 그대로 막 미로 (그림 1B)를 떠나 돌보는 : cochleostomy를 들어, 부드럽게 작은 창을 엽니 다 (~ 500-800 μm의 cochleostomy를) 뼈 캡슐을 면도. 두 번째 인공 와우에 cochleostomy를 수행이 stapedial 동맥과 정점에서 충분히 그대로십시오. 정점을 열면 modiolus의 골절을 포함하여 달팽이관의 파열을 생성 할 수 있습니다.
  5. 스칼라 고실 광섬유 또는 μLED 임플란트의 둥근 창을 삽입하는 경우, 조심스럽게 날카로운 메스의 끝이 뼈 틈새 시장을 긁어서 라운드 창 틈새 시장을 확대 (블레이드 번호 11은 좋은 선택이 될 것입니다). 항상 새로운 날 또는 메스를 사용합니다. stapedial 동맥 둥근 창 (그림 1B)에 매우 근접 실행될 때 매우주의해야합니다.

두 가지 방법을 사용하여 3 광 자극

  1. transcochlear 자극, 사용 μLEDs 또는 섬유 결합 레이저하십시오.
    1. cochleostomy에 μLED의 위치를​​주의 깊게 기계 조작자에 μLED를 운반하는 모세 혈관을 마운트하고. 또는 위치를 최적화하기위한 수단으로서, 1-5 Hz에서 전류원 (2.7 V에서 통상적 5~40mA)에서 3-10 밀리 긴 자극에 의​​해 유발 사용 oABR,μLED의 ientation.
    2. 레이저 자극의 경우, 473 nm의 연속파 레이저와 250 μm의 광섬유 (자료 참조)를 사용합니다. 커플 이상적 전력의 고속 아날로그 제어 (다른 광학 자극을 정의하는 음향 광학 소자 또는 빠른 셔터를 사용하여)를 제공 청색 레이저 광원에 광파이버. 미세 조작기를 사용하여, 직접 cochleostomy 상 섬유의 끝 부분을 찾아서 그 치과 용 시멘트 (transcochlear 자극)을 사용하여 해결할 수있다.
  2. intracochlear 자극의 경우, 스칼라 고실에 둥근 창을 통해 광섬유를 삽입합니다. 그런 다음 oABR을 유도하기 위해 1-5 Hz에서 10 ~ 30 mW의 (광 출력 전력)의 3-10 밀리 초 레이저 펄스를 사용합니다. oABR의 큰 진폭은 판독으로 oABR 진폭을 사용하여 이미 터의 위치와 방향 (μLED 또는 광섬유)를 최적화하기 위해 오실로스코프에 하나의 자극에 의​​해 유발 oABR을 관찰 할 수있는 실험을 할 수 있습니다.
  3. 좋은 oABR이 달성되고 나면, cyanoacr와 섬유를 수정접착제 고체 때까지 ylate 접착제, 치과 시멘트 기다립니다.
    참고 : 달팽이관에서 나오는 몇 가지 액체를 관찰하는 것은 정상입니다. 그러나 시멘트 중합 문제를 방지하기 위해서는, 미세한면 심지를 이용하여 영역을 건조하는 것이 바람직하다.

oABR의 4 녹음

  1. 정점과 다리 근처의 뒷면에, 귓바퀴 아래 바늘 전극을 삽입하고 앰프에 연결합니다.
  2. 정점 차이 전위를 증폭 및 피하 주사 바늘을 유상 돌기. 50 kHz 및 필터 (1-10,000 Hz에서)의 비율로 샘플. 광 자극의 위치를​​ 최적화하기위한 녹화 설정 근처 이상적 오실로스코프 차분 전위 시각화. 신호 평균 (50-1,000x)를 사용하여 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 데이터를 저장합니다.

광학 유발 현지 필드 잠재력의 5 녹음

  1. 정위 프레임에 동물을 배치합니다. 집게 센트를 사용하여집회는 두개골을 덮고 피부를 당겨 가위 대략 목 근육은 두개골에 연결 지점으로 눈 사이에서 연장과 중간 절개를 수행합니다.
    1. 측 방향으로 피부를 반영한​​다. 시상 봉합 길이 방향으로 골막을 잘라 조심스럽게 면봉으로 노출 된 두개골 뼈를 문질러 그것을 측방를 제거합니다.
  2. 접시와 람다의 꼬리 끝 사이의 약 1mm 공간을 남기고 노출 된 두개골에 사용자 정의 만든 금속판을 배치합니다. 0.7 mm 직경으로 조심스럽게 드릴 정수리 뼈에 구멍을 드릴.
  3. 부드럽게 0.85 mm 직경 나사에 나사 - 열등한 둔덕에서 기록 된 전위에 대한 기준 역할을하는 (IC) - 한 나사가 단단히 고정되지 않는 집게로 고정 나사. 뇌를 관통하지 않고 나사와 경막 사이 좋은 접촉을 확인합니다. 나사와 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 두개골 상에 금속 접시를 붙인다.
  4. N을 풉니 다부드럽게 두개골에서 에크 근육. 하방 경 1-2mm에 목 근육을 잡아 당깁니다. 우수한 시상 동 (SSS) 및 횡 방향 동 (TS)의 교차점을 확인합니다. 필요한 경우, 생리 염화나트륨 용액으로 뼈를 가습하여 두개골의 투명성을 증가시킨다.
    1. SSS와 TS 교차로에 직접적으로 꼬리 거짓말로 쥐 IC를 식별합니다. 천천히 조심스럽게 IC의 위치를​​ 식별 한 후 공술 (Trepanation) 연장 약을 수행 0.5 mm rostrally TS에 하방 1.5 mm 및 횡 방향으로 약 3mm이다.
    2. 성공적인 실험을 배제 할 이들과 같은 SSS와 TS에 부상을 피하십시오. 여기서, 구멍 뚫린 뼈가 부드럽게 밀어 넣어 느슨해 여부를 테스트합니다. 사용 집게 천천히 뼈를 들어 올립니다.
  5. 적절한 어댑터를 미세 조작기 상에 멀티 어레이와 headstage를 연결합니다. 경질를 꺼낼 때 조심스럽게, IC에 삽입하는 동안 멀티 채널 녹음 배열을 파괴 방지하기 위해작은 피하 주사 바늘의 구부러진 끝이 뼈 가장자리에 시작하는.
    1. 고정대에서 동물을 제거합니다. 정위 고정 남아 줄에 금속판을 고정합니다. IC를 통해 기록 프로브를 위치시키고 최상위 채널 표면에서 바로 볼 수 있도록 미세한 제어를 삽입합니다.
  6. 오프라인 분석을 위해 컴퓨터에 32 kHz의 로우 패스 필터 (300 Hz에서)과 상점의 속도로 기록 어레이와 정수리 뼈 기준 나사, 샘플의 개별 채널의 차이 전위를 증폭한다.
  7. 모든 동물을 인도적으로 안락사 이전에 관련 지침에 따른 마취 회복 과정의 끝에 안락사한다. 안락사의 적절한 방법은 자궁 경부 전위 또는 CO 2 흡입을 포함 할 수있다.

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Representative Results

최적 cochleostomy은 중요하고 성공적인 실험의 확률을 증가시킨다.이 윈도우가 일정한 작은 것을 의미하고, 내부 인공 구조물의 어떠한 손상도 없다. 예를 들어, 출혈은 강선 vascularis의 손상 될 수 있음을 나타냅니다. 좋은 예는 그림 (b)에 표시됩니다.

ChR2 - 형질 전환 마우스를 사용하여, ChR2은 달팽이관 (그림 1C) 내에서 SGNs 표현된다. , 하나, μLED 또는 레이저에 의해 푸른 빛 조명은 진폭과 파형 음향 ABR (aABR)과 다른 대형 oABR을 이끌어. oABR (그림 1 층)은 aABR (그림 1E)보다 큰 진폭을 가지고 있지만.이 oABR 및 eABR 더 SGNs의 반영 모집 및 / 또는 SGNs보다 동기화 활성화로 해석 될 수있는 전기 ABR (eABR, 그림 1G)에 필적 에 대한보다 aABR을 소리 유발.

NT는 "> 둥근 창에 삽입 된 eABR에게 짐승 전기 CI (MED-EL)을 유도합니다. 우리는 이상성 전류 펄스 (80 마이크로 초 위상 기간, 20 마이크로 초 상간 기간, 500 μA, 6 Hz에서 자극 속도) 자극을 사용하고 평균 이 유리 절연 텅스텐 전극 (내부 1, 달팽이관의 한 외부) 100 자극의 반복. 자극에 대한 응답도 가능합니다.

그것은 oABR 전압 - 게이트 된 나트륨 채널 억제 한 후, 또는 동물 (39)을 희생 후, 야생형 동물에서 검출 가능한없는 것이 중요하다. 이러한 제어 실험기구는 않을 광학적으로 유발 ABRS을 기본으로 난방을 렌더링합니다.

우리는 중앙 청각 시스템에 의해 세포 외 기록 청각 통로를 통해 활성의 전달을 확인 하였다. 예를 들어, 달팽이관의 optogenetic 자극이 청각 중뇌도 신경 활동을 유도 (열등 둔덕, 그림2).

그림 1
그림 1 : 외과 절차, 준비, oABR 기록을 μLED (A) 목 근육을 해부하면 수포를 노출,. 특징적인 구형과 고막은 랜드 마크로서 사용할 수있는 뼈에 삽입 반지를 관찰합니다. 스케일 바 1mm. 수포의 (B) 열기는 promontorium 노출됩니다. cochleostomy는 제 인공 차례로 실시 하였다. 다른 랜드 마크는 그 중 stapedial 동맥 표시됩니다. 스케일 바 1mm. SGNs에서 (C) ChR2 - YFP 식입니다. GFP (녹색) 및 phalloidin-AF-568 (빨간색)에 대한 Immunolabeling. 스케일 바 50 μm의. (D) μLED는 유선하지만 아직 모세관에 깔때기. 스케일 바 1mm. (E), (F) 및 (G) 대표적인aABR의의는, oABR (20 Hz에서, 80dB을 클릭) (2 밀리 초, 1 Hz에서, 4 mW의 / mm 2) 유리 절연 텅스텐 전극을 통해 LED 자극 및 eABR (900 μA, 20 Hz에서)에 의해 유도. 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림이
그림 2. 탄성, optogenetic 및 전기적 달팽이관 자극 후 IC에서 녹화 하나씩 시험 로컬 필드 전위 기록 멀티 프로브의 개략적 인 표현은 각 패널의 왼쪽에 그려진다. (A) 다양한 주파수보다 높은 주파수보다 더 많은 표면 활성화로 이어지는 낮은 주파수와 활동의 구별 그라데이션 (80dB SPL) 리드 순수한 톤의 싱글 발표. 이러한 관찰은 evaluat하는 데 사용됩니다IC로 다중 기록 어레이의 전자 성공적인 삽입. (B) 또한 IC 종종 유사한 응답 진폭을 나타내는 로컬 필드 전위 주도 광 자극 (24 mW의 6 밀리 초 지속 기간) 및 (C) 전기 자극 (이상성, 80 마이크로 초 위상 재생 시간, 20 마이크로 초 상간 재생 시간, 500 μA)를. (D)뿐만 아니라 IC 소뇌 부 모두 포함한 외과 원위치. 스케일 바 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

설명한 실험 SGNs의 optogenetic 자극을 입증하고, 원칙적으로, 또한 내측 및 / 또는 외측 유모 세포를 자극하는 데 사용될 수 opsins의 발현을 제공 하였다. 이 실험은 많은 인내와 배려가 필요합니다. 앞서 언급 한 바와 같이, 가장 중요한 단계는 광원의 좋은 cochleostomy / 라운드 창 삽입뿐만 아니라 적절한 위치 자세이다.

ChR2를 사용 optogenetic 자극과 제한 사항이 있습니다. 자극의 속도가 15 증가 할 때 빛의 세기 및 펄스 지속 시간 그러나 우리의 경우 oABR 진폭이 증가에서 감소한다. 응답 지연 시간은 또한 감소, 광 강도에 의존 할 때 자극의 강도가 증가. 우리는 이러한 응답은 ChR2의 속도론 및 SGNs 표현 채널 수의 결과임을 제안한다. 또한 ChR2 높은 스파이크에 여분 스파이크, 장애 및 막 전위를 발생할 수 합산요금 27,40. 이러한 제한 (32, 33)을 극복하기 위해 지속적인 노력이 있었다. 우리는 최근에 빛 요구 사항을 감소 자극 (39)의 높은 비율로 급상승 허용 SGNs에서 ChR2 변종 캐치 14의 바이러스 매개 표현의 사용을보고했다. 가장 최근에 보이든 연구소는 크로노스, 빠른 반응 속도와 높은 감광도 41 channelrhodopsin 보도했다.

우리는 청각 경로의 optogenetic 자극 인공 보철로, 앞으로, 청각 연구에 기여할 수 있음을 제시한다. 우리는 음성 인식과 서디와 음악의 지각을 개선시킬 수 있음을 고려한다. 병원에이 방법의 번역은 channelrhodopsins의 최적화, 광 인공 임플란트 용 다중 채널 광 자극 기술의 개발뿐만 아니라, 광학 stimula 용 생물 안전성의 데모만큼 중요한 발전을 필요기 및 SGNs의 장기 유전자 조작.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 교육 및 연구 (Neurotechnology에 대한 번스타인 초점 T. 모저에 01GQ0810을 부여하고, MED-EL 독일)의 독일 연방 교육부에 의해 지원되었다; N. Strenzke 및 T. 모저에 독일 연구 나노 현미경과 뇌의 분자 생리학 센터를 통해 재단 (FZT 103, T. 모저)과 SFB889 통해).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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신경 과학 문제 92 청각 인공 와우 optogenetics channelrhodopsin 광 자극 청각 장애
청각 신경의 자극 Optogenetic
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Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

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