Introduction
Levende celler bank metabolsk energi i form av fett og karbohydrater, og bruke denne energien for biosyntese, membrantransport og bevegelse. Noe energi blir oppnådd i cytosol ved omdannelsen av diettsukker direkte til ATP under glykolyse. Imidlertid er hovedkilden for ATP produksjon i en celle utnyttes i mitokondriene via mitokondrie respiratoriske kjeden 1. Arkitekturen i mitokondriene gir nødvendig romlig orientering for effektiv og effektiv ATP produksjon. Mitokondrier har en dobbelt membran adskilt med en intermembrane plass, og sammen med grunnmassen, den innerste mitokondrie rommet, huset komponentene og koordinere de kjemiske reaksjoner som er involvert i ATP generasjon. Den indre membran inneholder en serie av membranbundne proteinkomplekser som utgjør den respiratoriske kjeden samt ATP syntetase, proteinkompleks som bringer ADP og Pi sammen for dannelsen av ATP. Vertshuseter membranen er foldet til cristae og elektronene føres langs de respiratoriske kjeden komplekser via cytokrom c, et oppløselig elektronbærer som beveger seg mellom kompleksene innenfor intermembrane plass. Når elektronene beveger seg, oppstår oksydasjon av reduserende ekvivalenter og hydrogenioner blir pumpet fra matrisen til det intermembrane plass. Som en konsekvens av den høye ionekonsentrasjon i intermembrane plass, bygger en elektrokjemisk gradient som resulterer i en membran potensial over den indre mitokondrie-membran (Δψ) 2. Oksygen er den avsluttende elektronakseptor for elektrontransportkjeden, og hydrogenioner strømme gjennom ATP synthases fra intermembrane plass tilbake til grunnmassen, og dermed direkte føre til ATP formasjonen. Denne prosessen som er beskrevet i sin helhet er kjent som oksydativ fosforylering. Foldene i cristae øke overflatearealet av den indre membranen, slik at for maksimal elektrontransport og ATP produksjon innenforhver mitokondrie. Proteiner, enzymer og andre molekyler som er involvert i oksidativ fosforylering er avledet fra både nukleære og mitokondrielle gener. Mitokondrier inneholde sin egen sirkulært DNA, som koder for 13 proteiner samt tRNA og mRNA som er nødvendige for ATP produksjon tre. Imidlertid er mange flere proteiner som kreves, og dermed er atom kodet. De fleste av disse atom-kodede proteiner er rettet mot den mitokondrielle matriks ved bruk av presequences ved N-terminalen av forløper-proteinet, og deres innførsel er drevet delvis av Δψ 4,5.
Ut over å bidra til de Bioenergi i en celle, mitokondrier også påvirke viktige metabolske prosesser som TCA og beta-oksydasjon, cellesignalisering ved å regulere kalsium, samt en nøkkelrolle i apoptose 6. Spesielt i tider med cellulært stress, BCL-2 familie proteiner som ligger på eller samhandle på mitokondrie ytre membran kan forårsake mitokondriellytre membran permeabilitet (MOMP) 7,8. Under MOMP, er cytokrom c og andre proteiner frigjort i cytosol, og sammen med flere cytosoliske proteiner danner et kompleks kalt apoptosome 9,10. Den apoptosome aktiverer kaspaser som går på å kløyve cellulære proteiner og DNA i gjennomføringsfasen av apoptose. Så snart MOMP skjer, er ΔΨ kollapset og ATP produksjonen stanset. Således, som apoptose initieres mitokondriefunksjon er kompromittert og endringer i ΔΨ kan korreleres til mitokondriell og celle helse 12. Mens apoptose er et endepunkt i mange sykdomsmodeller, mitokondriefunksjon og endringer til ΔΨ kan også gi verdifull informasjon om sykdom opprinnelse og / eller progresjon. For eksempel har mitokondrie strukturelle og funksjonelle endringer er dokumentert i løpet av nevrodegenerative sykdommer 13,14.
I den første del av protokollen, isoning av intakte mitokondrier som beholder sin ΔΨ er beskrevet. HEK-293T-celler ble eksponert for ulike konsentrasjoner og kombinasjoner av rekombinant TNF-α, IL1-β og IFN-γ å indusere apoptose. Disse cytokiner ble valgt fordi de ofte er rapportert å være høy i primære humane septik prøvene 15 og den ytre vei av apoptose kan utløses ved samvirke av TNF-α-binding til dets reseptor 6. Siden det er små variasjoner er nødvendige for å isolere funksjonell mitokondrier fra primær vev sammenlignet med dyrkede celler, og fordi mye forskning utnytter dyr, protokollen beskriver også hvordan å isolere mitokondrier fra leveren og ryggmargen av fremre lateral sklerose (ALS) musemodell.
Den andre del av protokollen ble utviklet for å overvåke perturbasjoner i den mitokondrielle membranpotensialet ved hjelp av en potensialsensitive fluorescerende fargestoff med et fluorescerende plateleser. Forskjells mellom celle status (dvs. frisk vs. usunn) blir differensiert ved å kvantifisere styrken av ΔΨ av isolerte mitokondrier i forbindelse med frakoblingsmidler, respiratoriske kjede-inhibitorer, komplekse inhibitorer og ionoforer, som alle fører til bortledning av mitokondriemembranpotensialet. Den sunnere mitokondriene, jo større forandringen i ΔΨ ved behandling med mitokondrie-inhibitorer, derfor responsen til mitokondriene kan brukes som en indikator på mitokondrie (dys) funksjon.
Bruk av isolerte mitokondrier fremfor in situ vurdering av funksjonen gir definitive bevis på at en patologi eller behandling modulerer endringer i organeller 16 til 18 direkte. Mens det finnes metoder i litteraturen for å isolere mitokondrier fra dyrkede celler, er de vag 17 og / eller utbytte av spesialisert utstyr 16. Denne protokollen beskriver i detalj isolering fremgangsmåte og erlett kan tilpasses til andre cellelinjer, inkludert primære vev og kulturer 13,14,19,20. Mange isolerte mitokondrier studier utnytte de samme mitokondrielle uncouplers og hemmere brukes i denne protokollen, men med en Clark elektrode (21 er et representativt eksempel på mange papirer i litteraturen), som igjen er en veldig spesifikk og spesialisert utstyr. Videre har denne tradisjonelle metode begrensninger som lav gjennomstrømning og høy kompleksitet 22,23 og krever en betydelig mengde av mitochondria (~ 500 ug / reaksjon). I denne protokoll, blir det fluorescerende membransensor potensial probe TMRE brukes i forbindelse med en fluoriserende plateleser, som er en standard maskin i mange laboratorier. TMRE er ansett siden det raskt går celler og isolerte mitokondrier og kan anvendes ved lave konsentrasjoner 24. Flere reaksjoner kan raskt settes opp i tandem og batch analysert ved bruk av denne protokollen. Videre er reaksjonens krever en mye mindre mengde av isolerte mitokondrier (~ 10 pg / reaksjon). Ved å kreve mindre materiale, kan mindre vevs- eller cellekulturprøver benyttes som et utgangspunkt for mitokondriene isolert, kan flere replikater eller reaksjoner settes opp, og potensielt nok materiale til andre isolerte mitokondrier eksperimenter slik som ATP produksjon, oksygenforbruk eller import assays er mulig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk dannet National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av Wake Forest University Animal Care og bruk komité. Hekkende par for SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] musemodell ble hentet fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Transgen villtype (WT) hunner og SOD1G93A hanner [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] ble avlet for å generere SOD1G93A mus og ikke-transgen WT kullsøsken som ble brukt i forsøkene.
1. Modeller for Investigation
- Cellekultur
- Opprettholde humane embryonale nyreceller (HEK-T293) celler i DMEM supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, og 1% L-glutamin, ved 37 ° C i 5% CO2.
- Dyrke celler i T75 kolber og tillate dem å nå 90% samløpet.
- Utføre celle splitting via trypsinisering (0,25% Trypsin-EDTA) i 3-5 minutter ved 37 ° C i 5% CO2
- Aspireres media, og cellepelleten suspenderes i kulturmedier.
- Seed celler i passende kolbe eller plate 7 x 10 4 celler inn i en T75 Flaske 48 timer før behandling cytokinproduksjon. Dette bør gi ~ 70% tetthet på tidspunktet for behandlingen.
- Serum sulte celler 24 timer senere ved å aspirere media og erstatte den med det samme volumet av serum-frie medier (DMEM, steril).
- Forbered TNF-α, IL1-β, og IFN-γ, fra lyofilisert pulver med ultrarent vann ved arbeidskonsentrasjoner på 5 pg / mL, 10 ng / mL, og 10 ng / mL, henholdsvis, og legge dem til brønnene / kolber.
- Treat serumsultes celler ved tilsetning av oppløseliggjorte cytokiner direkte til cellekulturmedium av passende kolber. Behandlinger besto av enkelte cytokiner, en cocktail av alle tre (referert til som "* 3"), eller sterile vann som en kontroll (betegnet som "0").
- Inkuber behandlede celler for 24, 48 eller 72 timer før vurdering og høsting.
- Celleviabilitet vurdering
- Gjør en 5 mg / ml oppløsning av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) i 1 x PBS.
- For 12-brønners plater, tilsett 100 ul av MTT-løsning til hver brønn og virvle for å sikre jevn fordeling.
- Inkuber platene i 15 min-1 time ved 37 ° C i 5% CO2, og kontroller under et mikroskop med hensyn til nærvær av lilla farge. Hvis ingen lilla er til stede, virvle igjen og la cellene å ruge i 5 min intervaller inntil lilla er observert. Tiden nødvendig bør bestemmes av hver etterforsker.
- Ved hjelp av en tilbakevendende pipette, tilsett 700 ul av MTT oppløsningsmiddel (4 mM HCl og 0,1% NP40 i isopropanol) til hver brønn, og rist platen (e) ved romtemperatur i 5-10 minutter, eller inntil alt purpurfarge hadde forlatt cellene . Hvis lillafargen ikke kommer ut av cellene, legge til en ekstra 200 III løsemiddel og fortsette å svirre.
- For analyse, ta 100 ul fra hver brønn og plasseres i en 96-brønns plate og avlest på en plateleser ved bruk av 570 nm og en referansebølgelengde på 630 nm, men 595 nm også er akseptabelt så lenge målingene blir tatt ved konsistente innstillinger.
- Animal Modell av ALS
- Alle dyreforsøk dannet National Institutes of Health retningslinjer og ble godkjent av Wake Forest University Animal Care og bruk komité. Hekkende par for SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] musemodell ble hentet fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Transgen villtype (WT) hunner og SOD1G93A hanner [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] ble avlet for å generere SOD1G93A mus og ikke-transgen WT kullsøsken som ble brukt i forsøkene.
- Utføre genotyping med standard primere mot mutant SOD1 25.
2. Isolering av Mitokondrier
MERK: Det er viktig å jobbe raskt og holde alt på is gjennom hele prosedyren.
- Fremstilling av mitokondriell isoleringsbuffer (MIB), ryggmargsisoleringsbuffer (SC MIB) og forsøksbuffer (EB)
- Forbered følgende stamløsninger på forhånd for MIB og EB.
- Gjør 1 M Tris / MOPS ved å oppløse 12,1 g Tris-base i 70 ml H 2 O. Legg tørre MOPS å få pH til 7,4. Justere volumet til 100 ml finalen. Filter sterilisere og oppbevar ved 4 ° C.
- Lag 1 M Kphos ved å blande 80,2 ml K 2 HPO 4 og 19,8 ml av KH 2 PO 4. Oppbevares i romtemperatur.
- Gjør 0,2 M EGTA / Tris ved å tilsette 3,8 g EGTA i 10 ml H 2 O. Legg en M Tris / MOPS inntil oppløst, ~ 30-40 ml. Juster til 50 ml, sterilt filter og oppbevares ved romtemperatur. Legg merke til at pH vil være ~ 6,7.
- Lag 1 M Glutamat ved å lage 10 ml1 M oppløsning av glutaminsyre. Filter sterilisere og lagre 4 ° C.
- Lag 1 M Malate ved å lage 10 ml 1 M oppløsning av eplesyre. Legg Tris / MOPS til 50 mm. Filter sterilisere og oppbevar ved 4 ° C.
- Gjør MIB ved en konsentrasjon på 200 mM sukrose, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, og 1 mM EGTA / Tris. Filter sterilisere og oppbevar ved 4 ° C.
- Gjør SC MIB ved en konsentrasjon på 250 mM sukrose, 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, og protease-inhibitor cocktail.
- Gjør EB i en konsentrasjon på 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM glutamat, 2,5 mM malat, 1 mM K fosfat, pH 7,4, og 10 mM EGTA / Tris. Filter sterilisere og oppbevar ved 4 ° C.
- Forberedelse utstyr før høsting av cellene.
- Skyll en liten glassbeholder og homogenisering stampe tre ganger med sterilt vann og legg på is.
- Samle nødvendige elementer som en standard drill, celle skrap sompers, 1,5 ml, 15 ml og 50 ml rør og løsninger.
- Mitokondrier Isolation
- Dyrkede celler
- For hver prøvetype, bruker to T175 kolber av celler.
- Sikre at cellene er ~ 90% sammenflytende og bruk i kontrollforsøk, eller plate og behandles som beskrevet ovenfor i trinn 1.2.
- På benkeplaten, aspirer media og de adherente celler vaskes to ganger med 15 ml 1 x PBS hver gang.
- Aspirer buffer og skrape kolber for å fjerne adherente celler fra bunnen av kolben.
- Tilsett 15 ml 1x PBS til hver kolbe, virvel, og overføre til individuelle 15 ml koniske rør og legg på is.
- Når skrape- er gjort, sentrifuger rørene i 5 min ved 700 x g, 4 ° C ved anvendelse av en bordsentrifuge ved hjelp av en svingende spannrotor.
- Aspirer supernatants og suspender hver pellet i en ml MIB.
- Kombinere begge suspensjoner og overføre til et lite glass fartøy for homogenisering.
- Legg MIBtil fartøyet inntil bufferen når den første linje. Homogen celler med de støter festet til en drill på middels hastighet i tre omganger. Sørge for at fartøyet er på is i løpet av dette trinnet, for ikke å fjerne de støter ovenfor væsken, og å bruke en jevn hastighet med kontinuerlig passerer.
- Overfør den homogeniserte løsningen til et 50 ml konisk rør.
- Trekker oppløsningen inn en 3 ml sprøyte ved hjelp av en 18 gauge 1 ½ tommers nål og utvise den tilbake i konisk rør på isen med en 27 gauge ½ tommers nål. Ta seg å utvise oppløsningen mot den innvendige veggen av røret for å utnytte at kraft for cellemembranen avbrudd.
- Gjenta sprøytetrinn for totalt fem ganger.
- Overfør løsningen til et 15 ml konisk rør og sentrifuger i 5 minutter ved 600 x g, 4 ° C i en bordsentrifuge ved hjelp av en svingende spannrotor.
- Fjern forsiktig supernatanten og fordele mellom tre 1,5 ml rør.
MERK: Mitochondria finnes i supernatanten etter denne første, lav hastighet spinn, samtidig som cellemembraner og ubrutte celler pelleteres. - Sentrifugerør i en rotor med fast vinkel ved 10.000 x g, 4 ° C i 5 min.
- Aspirer supernatants og kombinere pellets i 100 ul MIB og umiddelbart plassere på is.
MERK: Mitokondrier er i pellet etter denne høyhastighets spinn. Mitokondrier vil vanligvis opprettholde sin membranpotensial ~ 2-3 ion is etter isolering, og er mest stabil som en konsentrert lagerløsning i MIB.
- Mitokondrier isolasjon fra mus vev
- Bedøve musen ifølge IACUC protokollen. Sett en vaporizer på 5,0% for å indusere anestesi. Bekreftet at dyret er bedøvet av en mangel på refleks for foten klype eller blunkerefleksen når øyet er kontaktet eller tappet med en bomullspinne. Holde musen under bedøvelse for hele kirurgisk prosedyre ved å holde den fordamper på mellom 1,5% og 2,0%.
- Excise leveren og ryggmargen fra hvert dyr og sted separat i iskald 1x PBS - / - for å skylle bort noe blod.
- For leveren, overføre vev til en veie fatet på is og hogge inn fine stykker ved hjelp av en fersk barberblad i 1 min.
- Legg vev og passende buffer (MIB for lever eller SC MIB for ryggmargen) til fartøyet inntil bufferen når den første linje. Homogenisere vevet med pistill for hånd i fem omganger. Sørge for at fartøyet er på is i løpet av dette trinnet, for ikke å fjerne de støter ovenfor væsken, og å bruke en jevn hastighet med kontinuerlig passerer.
- Overfør homogenatene å rengjøre 15 ml rør.
- Sentrifugerør i en rotor med fast vinkel ved 750 x g, 4 ° C i 10 min.
- Lagre Supernatantene i rene rør og plassere dem på is.
MERK: Mitokondrier er i supernatanten etter denne første, lav hastighet spinn, mens cellemembraner og ubrutte celler er pelletert. - Re-suspendere ryggmargs pellets jegn 500 mL av SC MIB.
- Re-homogen hver tre ganger, bare å fylle beholderen halvveis med SC MIB dette tidspunktet.
- Overfør den nye homogenatet til et nytt rør.
- Sentrifuger i en rotor med fast vinkel ved 750 x g, 4 ° C i 10 min.
- Kombiner de nye supernatantene, som inneholder flere mitokondrier, med den første supernatant fra hver prøve.
- Sentrifugerør i en rotor med fast vinkel ved 10.000 x g, 4 ° C i 5 min.
- Aspirer supernatants og resuspender lever pellets i 500 mL av MIB og ryggmarg pellets i 50 ul SC MIB og umiddelbart plassere på is.
MERK: Mitokondrier er i pellet etter denne høyhastighets spinn. Mitokondrier vil vanligvis opprettholde sin membranpotensial ~ 2-3 ion is etter isolering, og er mest stabil som en konsentrert lagerløsning i MIB. - Utføre en proteinkonsentrasjon analyse for å beregne konsentrasjonen av mitokondrier i oppløsning. Følg instruksjonens for å bruke en kommersiell Protein Assay Kit eller lignende metode 26. Typiske konsentrasjoner av mitokondrier er: 2-T175 kolber utbytter ~ 2 mg / ml, en muselever ~ 3-5 mg / ml, og en mus ryggmarg ~ 1-3 mg / ml.
- Dyrkede celler
- Cytokrom c-analyse ved hjelp av et FoU Rat / Mus Cytochrome c Quantikine ELISA Kit (tilpasset fra protokollen gitt av produsenten).
- Umiddelbart før du setter opp reaksjonene, fortynne mitokondriene til 0,5 mg / ml arbeidskonsentrasjon med EB og distribuere utvannet mitokondrier i 1,5 ml rør for reaksjoner (typisk 30-50 mL av mitokondrier per rør).
- Tilsett enten EB eller DMSO, ved 1% av det totale volum, til de fortynnede mitokondrier og inkubere reaksjonene på benke-platen i 7-10 min. Disse reaksjonene er stabile i opp til 30 minutter ved romtemperatur dersom et lengre tidsrom er nødvendig.
- Pelleten mitokondrier ved sentrifugering i en rotor med fast vinkel ved 10.000 x g, 4 ° C i 5 minutter og forsiktigly skille supernatanten og plasser hver i en egen 1,5 ml rør.
MERK: Rør kan enten fryses ved -20 ° C for senere analyse, eller brukes umiddelbart. - Bestem frigjøring av cytokrom c ved en sammenligne konsentrasjonen av cytokrom c i pelleten og supernatanten 27.
- Forbered prøvene ved oppløsning av pelletene i det opprinnelige volum av reaksjonen med 0,5% TX-100 i 1 x PBS.
- For hver prøve fremstille to brønner på ELISA-plate, en for det nå oppløste pellet og en for supernatanten fra reaksjonsblandingen ved tilsetning av 100 ul av cytokrom c-konjugat (bruke rett ut av flasken) pluss 100 pl av 0,5% TX- 100 i 1 x PBS, og deretter tatt av pelleten eller supernatanten prøven.
- Forsiktig vortex plate en lav innstilling (nivå 2-4) i 20 sekunder for å blande, cover og inkuberes i 1 time, 37 ° C.
- Deretter vaske platen fire ganger med vaskebuffer utvannet i henhold til produsentenseh instruksjoner. Fjern overflødig løsning ved å tappe brønnene på tørkepapir.
- Tilsett deretter 150 ul av 1: 1 A + B utviklende oppløsning til hver brønn og inkuber platen i 20-30 minutter i mørket ved romtemperatur.
- Til slutt legger 50 mL av stoppløsning til hver brønn og ta avlesninger ved 540 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Beregne mengden av cytokrom c frigjøring ved å sammenligne mengden av cytokrom c i pelleten vs. supernatanten for hver reaksjon.
3. Vurdering av mitokondrie (Dys) -funksjonen
- Umiddelbart før er satt opp reaksjoner, fortynn mitokondriene til 0,5 mg / ml arbeidskonsentrasjon med EB og plassert i 1,5 ml rør for reaksjonene (typisk 30 til 50 ul av mitokondrier benyttes per rør).
- Mitokondrie behandlinger
- Legg passende behandlinger (EB kontroll, 1fiM FCCP blandet med 50 nM valinomycin, 10 mm rotenon, 5 uM oligomycin, 2 mM KCN, eller 200 pM ADP, sluttkonsentrasjon) for å skille reaksjonene på 1/10 det totale volum av fortynnet mitokondrier. Inkuber reaksjoner på benke-platen i 7 min.
MERK: Det bør utvises forsiktighet ved håndtering av disse stoffene som utilsiktet inntak eller absorpsjon gjennom huden kan være skadelig. - Fortynn TMRE, rekonstituert i sterilt vann til en arbeidskonsentrasjon på 100 mM og lagret ved -20 ° C, til 2 pM, og legge til et volum lik den mitokondrielle reaksjonsvolum.
- Inkuber reaksjoner på benke-platen i 7 min.
- Pelleten mitokondrier ved sentrifugering i en rotor med fast vinkel ved 10.000 x g, 4 ° C i 5 min.
- Belastningshalvparten av supernatanten volum av hver prøve på en 396-brønners plate og lese fluorescens.
MERK: Eksitasjon og utslippsbølgelengder av TMRE skal være optimalisert i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av volum og plate som skal brukes foranalysen. Ved hjelp av en standard 384-brønns sort plate med 25 ul av 1 pM TMRE (endelig reaksjonskonsentrasjon) den sterkeste signalet ble oppnådd ved anvendelse av eksitasjon / emisjonsbølgelengder 485 nm / 535 nm. - Beregn fold-forskjell i fluorescens mellom kontrollen (EB) og hver behandling ved å dividere den relative fluorescens-verdi (RFU) oppnådd fra plateleser for den eksperimentelle prøven ved RFU fra kontrollprøven.
- Legg passende behandlinger (EB kontroll, 1fiM FCCP blandet med 50 nM valinomycin, 10 mm rotenon, 5 uM oligomycin, 2 mM KCN, eller 200 pM ADP, sluttkonsentrasjon) for å skille reaksjonene på 1/10 det totale volum av fortynnet mitokondrier. Inkuber reaksjoner på benke-platen i 7 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling av HEK-293T-celler med 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, og 75 ng / ml IFN-γ (* 3) for 24 til 48 timer gir en progressiv mengder av celledød (figur 1A ). Cellenes levedyktighet ble bestemt ved hjelp av MTT-analyser og konsekvent viser at det er ~ 10% reduksjon i cellelevedyktighet med 24 timers behandling og ~ 20% reduksjon med 48 timers behandling. Celler ble behandlet med tilsvarende konsentrasjoner (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, og 75 ng / ml IFN-γ) ga lignende resultater celledød ved 48 timer, og behandling med enkelte cytokiner viser at reduksjonen i levedyktighet skyldes kombinato rammer (figur 1B). Levedyktigheten av data i figur 1B representerer gjennomsnitt +/- standardavvik for tre separate eksperimenter hver kjøring i tre eksemplarer, og tetthet av feilfelt demonstrerer reproduserbarheten av dataene. Mengden av cytokiner kan justeres i denne behandlingsprotokoll for å ytterligere elucidate bidraget hvert cytokin på celledød, og flere cytokiner eller andre faktorer kan også være inkludert, så lenge nødvendige kontroller er utført.
Isolering av mitokondrier fra celler og vev er blitt beskrevet i litteraturen siden 1940-tallet 28,29. Forutsetningen for fremgangsmåten er celleoppbrytning, etterfulgt av differensialsentrifugering, hvor råolje mitokondrier er kjent for å pelletere ved ~ 10 000 x g. Mange protokoller som benytter isolerte mitokondrier krever intakt doble membraner som kan opprettholde sin membranpotensialet, og derfor er det nødvendig å vurdere integritet når isolasjon er fullført. Under utviklingen av mitokondriene isolert protokoll fra dyrkede HEK-celler, ble en cytokrom c-analysen brukt til å indikere om intakte mitokondrier ble oppnådd. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelig cytokrom c ELISA kits, ble mitokondrier kvantifisert etter isolasjon og fortynnet i EB, og deretter enten EB eller DMSOtilsatt og reaksjonen inkuberes på benkeplaten. Deretter, ved å separere mitokondrier fra omkringliggende supernatant, ble analyse av cytokrom c innholdet av begge fraksjoner brukes som et mål for mitokondriemembranen intactness; dersom flertallet av cytokrom c blir beholdt i mitokondrie pellet deretter mitokondriene anses intakt, mens hvis mer enn 15% av cytokrom c blir funnet i supernatanten, og deretter mitokondrier ble ansett uegnet for funksjonelle studier. Som det fremgår av tabell 1, protokollen beskrevet utbytter ~ 12% cytokrom c frigjøring og ~ 15% når isolerte mitokondrier er forbehandlet med DMSO. Lignende resultater har tidligere vært rapportert for mitokondriene isolert fra andre cellelinjer eller dyrevev 19,20,27. Alternativt kan mitokondriell integritet også vurderes med TMRE, som ble brukt under isolering av muselever og ryggmargs mitokondrier. Under innledende isolasjon protokollen development, forsøk evaluert mitokondrier isolert fra leveren og ryggmargen av sunne, normale mus mitokondriene. For hver prøve ble ΔΨ evaluert ved å sammenligne det fluorescerende signalet fra isolerte mitokondrier behandlet med EB med de inkubert med FCCP + valinomycin (tabell 2). Et forhold på fluorescens mellom behandlede og ubehandlede mitokondrier av> 1 ble anvendt som en indikasjon på friske, intakte mitokondrier.
Når vellykkede mitokondrier isolasjonsmetoder ble utviklet, mitokondriene isolert fra kontroll, ubehandlede celler og * 3 cytokin behandlede celler, eller normale og SOD1 mus ble analysert. HEK mitokondrier fra begge gruppene ble behandlet med ulike uncouplers og hemmere og ΔΨ målt ved endringer i TMRE opptak. Fold forskjell i kontroll EB behandlet mitokondriene til uncoupler / hemmer behandlet mitokondriene indikerer en forskjell i styrken på ΔΨ mellom de to gruppene (representative data og calninger i tabell 3). Videre er den prosentvise reduksjon fra ubehandlede celler til * 3 behandlede celler betegne at mitokondriell helse ble påvirket av cytokin-behandlinger, bekreftende celleviabilitet data (figur 2). Evaluering av ΔΨ styrke via TMRE opptak ved hjelp av mitokondrier isolert fra leveren og ryggmargen av fire individuelle normal, kontroll mus i forhold til fire ALS mus tyder på at vev helse kan også vurderes ved hjelp av denne protokollen. Som illustrert av fold forskjeller og prosent nedgang i ΔΨ, sammenligning av EB-behandling og FCCP + valinomycin-behandling av mitokondrier fra kontroll og sykdoms kommet dyr er signifikant forskjellig (tabell 4, se også refererer til 13 & 14).
Figur 1: Celledød indusered ved * 3 behandling er progressiv over tid og større enn med de enkelte cytokin behandlinger. (A) HEK-293T-celler ble behandlet i 24 eller 48 timer og celledød ble målt ved hjelp av en MTT-assay. Verdiene ble normalisert til kontroll, ubehandlede prøver og data representerer triplikate målinger for n = 3, +/- standardavvik. (B) HEK-293T-celler ble behandlet med enkelte cytokiner eller en cocktail (* 3) i 48 timer og celledød vurderes via MTT analysen. Data representerer n = 5 for hvert individ cytokin og n = 6 for * 3, +/- standardavvik.
| Pellet (AU) | Supernatant (AU) | % Cytokrom c utgivelse | |
| 0 | 0,818 | 0,115 | 12.6 ± 2.27 |
| DMSO | 0,793 | 0,142 | 15.3 ±; 2.23 |
Tabell 1:. Retensjon av cytokrom c i isolerte mitokondrier fra dyrkede celler Data representerer gjennomsnittet av n = 4, +/- standardavvik.
| lever en | leveren 2 | ryggmarg 1 | ryggmarg 2 | ||
| RFU | EB | 97830 | 94132 | 339716 | 290154 |
| F / V | 435188 | 461299 | 385366 | 482480 | |
| ratio | 4,45 | 4.9 | 1.13 | 1.66 | |
| EB = eksperimentell buffer og F / V = FCCP + valinomycin. | |||||
Tabell 2:. Måling av ΔΨ fra mitokondriene isolert fra normalt musevev To separate dyr ble anvendt for å isolere lever- og ryggmarg mitokondrier i tandem (for eksempel leveren 1 og ryggmargen 1 er fra samme dyr).
| EB | oligo | råte | KCN | ADP | F / V | ||
| RFU | 0 | 4844 | 12507 | 12734 | 9925 | 10892 | 4844 |
| * 3 | 6517 | 13639 | 12435 | 10235 | 13154 | 6517 | |
| Fold Difference | 0 | NA | 2.58 | 2.63 | 2.05 | 2.25 | 2.65 |
| * 3 | NA | 2.09 | 1.91 | 1.57 | 2.02 | 2.18 | |
| % Reduksjon | 0 vs. * 3 | 18.94 | 27.41 | 23.35 | 10.24 | 17.67 | |
| EB = eksperimentell buffer; oligo = oligomycin; råte = rotenon; KCN = kaliumcyanid, og F / V = FCCP + valinomycin. | |||||||
Tabell 3: Rådata og beregninger fra celle cruk isolert mitokondrier eksperimenter.
Figur 2: Mitokondrier isolert fra cytokin-behandlede celler har redusert membranpotensialet. Prosent reduksjon av ΔΨ til 0 vs. * 3 for hver behandling, sammenlignet med kontrollen, som beregnet i tabell 2. Data representerer gjennomsnittet av duplikate reaksjoner for n = 3 (oligomycin, rotenon, og FCCP / valinomycin), eller n = 2 ( KCN og ADP) +/- standard avvik. * = Statistisk signifikante p-verdier basert på fold forskjell beregninger; p = 0,03, 0,01 og 0,05 for oligomycin, rotenon og FCCP / valinomycin, respektivt.
| Spinal Cord | Leveren | ||
| Brett Difference | Kontroll | 1.54 ± 0.48 | 3.20 ± 1.56 |
| SOD1 | 1,10 ± 0,30 | 3.12 ± 1.75 | |
| % Reduksjon | 28.1 | 2.48 | |
| p-verdi | 0.03 | 0.41 |
Tabell 4: Mitokondrier isolert fra ryggmargen av SOD1 mus har redusert membranpotensialet som vurderes av FCCP + valinomycin Data representerer gjennomsnittet av fire dyr per gruppe..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandling av HEK-293T-celler med rekombinante cytokiner forårsaker moderate mengder av celledød i løpet av 48 timer (figur 1). Mengden av celledød indusert av TNF-alfa behandlingen er lik tidligere rapporterte studiene 30 og celleviabilitet avtar etter samtidig bruk av flere cytokiner som er større enn summative mengder med noen cytokin alene er også konsistent med litteraturen 31,32. Muligheten til å justere mengder og typer av cytokin behandlinger samt sammenligning av cocktails til enkelte cytokiner gjøre denne cellekultur modellen attraktiv for å studere de spesifikke effekter av cytokin eksponering på nyreceller. Videre er resultatene er meget reproduserbar og lett oppnås (figur 2). Hensyn å huske inkluderer samløpet av cellene. For eksempel, celler behandlet med 100% konfluens ikke reagerer så vel til de samme konsentrasjoner av cytokiner når de ble behandlet ved 70-80% confluence. Videre skal antallet av passeringer cellene har gått gjennom spores, som cellerespons muligens bli påvirket etter å ha vært i kultur i altfor lang (mer enn 8 til 12 uker etter tining). Selv om behandling av dyrkede celler med cytokiner redusert cellelevedyktighet og deretter mitokondriell helse, er det ingen måte en modell for sepsis per se. Men bruk av en mer klinisk relevant modell, for eksempel ansette primære nyreceller isolert fra mus og / eller behandling med naturlig skilles cytokiner fra stimulerte THP1 celler 33, er en naturlig forlengelse av dette arbeidet. Gitt gapet i forståelsen av nyresvikt i løpet av sepsis, slike cellekulturmodeller og evaluering av mitokondrier kunne gi innledende innsikt i de mekanismer, så vel som et foreløpig plattform for å teste effektiviteten av farmasøytiske forbindelser som forebyggende eller intervensjons behandlinger.
Mitokondrier isolert fra dyrkede celler eller animalsk vevråd kapasitet til raskt å evaluere effekten av celle behandlinger eller sykdomsprogresjon på mitokondrie helse. Isolering og evalueringsprotokoller er ikke teknisk krevende å utføre og kan lett bli modifisert for bruk med andre cellelinjer eller primære vev. MIB og EB brukes for hver prøvetype er gode utgangspunkt oppskrifter som kan justeres som nødvendig hvis en bestemt celle eller vev type har forskjellige krav. For eksempel er tilsetning av fettsyrefritt BSA vanligvis nødvendig for bruk med nevroner, som følger med i ryggmargen protokoll 15,34. Den celleoppbrytning metoden kan også forandres ved hjelp av flere sprøyte eksklusjon eller endring av homogenisering for hånd i stedet for å bruke en drill, eller vice versa. Videre gjen homogenisering av det første sentrifuge pellet, som utført i ryggmargen mitokondrier fremgangsmåte, kan være nødvendig for å oppnå en tilfredsstillende mengde av mitokondrier. En god indikator på at en isolasjons protokollen produserer levedyktige mitochondria er bruken av cytokrom c ELISA. Denne analysen er et raskt og enkelt alternativ til western blot-analyse av cytokrom c frigjøring, og er også en nyttig vurdering av cytokrom c frigjøring etter behandling av mitokondrier med peptider eller andre forbindelser 19,27. Alternativt kan TMRE brukes under protokollutvikling, men det er viktig å vurdere mitokondriene isolert fra en prøve som er kjent for å være sunn. Videre, når isolere mitokondrier fra musevev som ikke rutinemessig er beskrevet i litteraturen, kan lever mitokondrier tjene som en positiv kontroll, så vel som brukes til å sette en grunnlinje. For eksempel, som i denne protokollen, lever fra hvert dyr, både under protokollutvikling, så vel som forsøk ble også skåret ut og brukt i mitokondriene isolert. En annen betraktning for et preparat er mengden av mitokondrier som oppnås ved slutten av isoleringsprosedyren. Hvis konsentrasjonen av mitokondrier er 1 mg / ml eller mindre og deretteranalyseresultatene kan vise seg upålitelige (upubliserte observasjoner VDGM). Enten mengden av utgangsmaterialet, MIB oppskrift eller avbrudd metoden bør optimaliseres før flytting til funksjonelle analyser. Så snart en vellykket isolasjonsprotokoll er oppnådd, kan mitokondriene også brukes i andre analyser som totalt ATP-innhold og ATP generasjon 13,14.
Mitokondriene funksjon protokollen beskrevet her åpner for indirekte måling av mitokondriell opptak av potensialet-sensing fargestoff TMRE hjelp av en standard fluorescerende plateleser. Etter mitokondrier er blitt isolert, og de passende kjemikalier tilsatt, blir de inkubert med TMRE og deretter pelletisert. Ved å behandle hele celler eller dyr og isolere mitokondriene før ΔΨ vurdering, konfunderende variabler som multiresistent transport eller ATP flux unngås. Mengden av fluorescens i supernatanten ble deretter analysert med den forståelse at den sunnere mitokondrienejo sterkere deres ΔΨ og derfor mer opptak av TMRE. Som et resultat, bør mengden av fluorescens i supernatanten er mindre i mitokondriene sunnere og mer inn usunne mitokondrier. Ved å inkludere en EB-eneste behandling, den ganger forskjell i fluorescens mellom denne kontroll og frakobles mitokondriene kan beregnes. En annen viktig kontroll med hvert sett av reaksjoner kjøre er TMRE alene. Resultatet fra denne kontrollen gir en maksimal mulig fluorescerende lesing. Siden TMRE tilsatt til reaksjonene er ferskt fortynnede, er det iboende variabilitet. For eksempel ble TMRE-bare lesninger av ~ 20.000, 25.000 og 30.000 oppnådd på ulike tidspunkter i løpet av protokoll utvikling. Dersom TMRE-bare signalet er meget større enn noen av de behandlede prøvene mitokondrier og / eller hvis behandlede mitokondrier er ikke signifikant forskjellig fra ubehandlet, deretter isolering av kombinert mitokondrier var mest sannsynlig ikke vellykket. Reduksjonen i ΔΨ som målt ved et forhold erholdtnår du følger denne protokollen er lik tidligere rapporterte beløp for kontroll, friske celler 2,35. Sammenligning av ΔΨ endringer fra mitokondrier isolert fra kontroll, ubehandlede HEK-293T-celler og * 3 cytokin-behandlede celler viste at redusert cellelevedyktighet observeres i MTT-analyser betyr mindre mitokondriene funksjon. Denne plateleser assay kan lett brukes med mitokondriene isolert fra en hvilken som helst kilde, og som brukes til å undersøke sykdomsmodeller for eksempel ALS, som demonstrert her 13,14.
Flere studier har benyttet mitokondrier spesifikke fluorescerende fargestoffer for å oppdage MOMP, som var viktig i dannelsen av denne platen leser analysen. Men disse studiene enten bruke hele celler til skjermen forbindelser som blokkerer eller indusere MOMP 35,36, utforske nye ΔΨ sensing fargestoffer to eller identifisere andre formater som flowcytometri på en mikrobrikke 37. Denne protokollen er unik i at beskriver det annonseetailed metode for å isolere og bruke mitokondrier å raskt undersøke effektene av hel-celle behandling gjennom respons på kjente ΔΨ-altering forbindelser. Denne protokollen benytter en rekke uncouplers og inhibitorer, og viser at noen av dem vil være egnet for vurdering av mitokondriell helse. Således, mens denne spesielle undersøkelse sentre på mitokondrie endringer på grunn av cellulært stress eller progressiv cellulær dysfunksjon, protokollen kan også bli brukt til å oppdage forandringer i mitokondriell metabolismen ved bruk av spesifikke forbindelser og / eller tilsetning av elektronkilder som succinat og NADH .
Viktige hensyn når du utfører den isolerte mitokondrier vurderingen inkluderer konsistens i behandlingsvolum, holde mitokondriene i MIB og fortynne dem i EB umiddelbart før behandlingene kommer til å bli satt opp, og ved hjelp av mitokondrier innen 3 timer av isolasjon for å sikre deres ΔΨ er fortsatt blir opprettholdt. DenValget av TMRE fremfor andre mitokondrier spesifikke fluorescerende fargestoffer som JC-1 var på grunn av evnen til å benytte små konsentrasjoner og enkelheten av å analysere fluorescensen ved bruk av bare en bølgelengde. Denne fremgangsmåte kan likeledes bli utført ved bruk av fluorescerende mikroskop eller strømningscytometri 2,38 37, men ved bruk av en plateleser tar mindre tid og krever mindre 35 optimalisering. I tillegg er denne protokollen mye mindre teknisk krevende, raskere å utføre og lettere reproduserbar, sammenlignet med anvendelse av en Clark-elektrode 22 (Del Gaizo Moore, upubliserte observasjoner). Titrere mengder av hver mitokondriell behandling kan gi ytterligere innsikt i mitokondriell funksjon og optimalisering av konsentrasjonen bør utføres. Det totale volumet av de mitokondrielle reaksjoner kan justeres til suite mengden av prøve erholdt ved isolering samt antall behandlingsreaksjoner som er nødvendige. Hvis det er mulig, er en standard mengde av 50 μ; L er brukt; men så lite som 20 mikroliter av mitokondrier produserer pålitelige resultater.
Mens ΔΨ korrelerer til oksygenforbruk, analysen presentert ikke direkte måle oksygenforbruk. Mens fluorescerende oksygen sonde som MitoExpress har blitt utviklet, antagelig for å unngå noen av downfalls av ved hjelp av en Clark elektrode nevnt ovenfor, prisen per reaksjon og kravet om større mengder av mitokondrier pr assay forblir begrensende. Derfor har bruken av TMRE og klassiske ΔΨ uncouplers eller inhibitorer flere fordeler. Igjen, batch analyse av flere prøver eller flere behandlinger / sample, reproduserbarhet, lavere startmaterialbehov og / eller lavere mengde isolerte mitokondrier kreves per reaksjon gjengi denne protokollen attraktive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-glutamic acid | Sigma | G1251 | Can use the potassium salt instead. |
| malic acid | Sigma | M8304 | Can use the potassium salt instead. |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Trisma base | Sigma | T6066 | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| CCCP | Sigma | C2920 | Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C. |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C. |
| sucrose | Fisher | S5-500 | |
| KCN | Mallinckrodt | 6379 | Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water |
| rotenone | Sigma | R8875 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| oligomycin | Sigma | O4876 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| ADP | Sigma | A2754 | |
| TMRE | Sigma | 8717-25mg | Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use. |
| DMEM | Gibco | 11965-084 | 1x regular (high glucose). |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-155 | |
| L-glutamine | Fisher | SH3002101 | Store aliquots at -20 °C |
| FBS | Lonza | 14-501F | US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| DMSO | SIgma | D2650 | |
| Protien Assay Dye (5x) | Bio-Rad | 500-0006 | Any protein assay can substitute. |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | Make 2 mg/ml stock in water for protein assay. |
| MTT powder | Sigma | M2128 | Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week. |
| Tergitol solution (NP-40) | Sigma | NP40S | |
| Recombinant Human IL-1B | Gibco | PCH08014 | Once opened store aliquots at -20 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha | Gibco | PHC3015L | |
| Recombinant Human IFN-gamma | Gibco | PHC4031 | |
| Dulbeccos PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions. |
| Cytochrom c ELISA kit | R&D systems | DTC0 | Human for HEK-293T cells. |
References
- Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
- Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
- Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
- Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
- Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
- Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
- Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
- Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
- Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
- Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
- Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
- Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
- Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
- Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
- Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
- Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
- Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
- Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
- Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
- Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
- Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).
