Introduction
Levande celler bank metabolisk energi i form av fett och kolhydrater och använda denna energi för biosyntes, membrantransport och rörelse. Viss energi erhålls i cytosolen genom omvandling av kost socker direkt i ATP under glykolysen. Dock är den främsta källan till ATP-produktion i en cell utnyttjas inom mitokondrierna via mitokondriella andningskedjan 1. Arkitekturen i mitokondrier ger den nödvändiga rumslig orientering för effektiv och ändamålsenlig ATP-produktion. Mitokondrier har en dubbel membran separerade av ett intermembrane utrymme och tillsammans med matrisen, den innersta mitokondrieutrymmet, hus komponenterna och samordna de kemiska reaktioner som ingår i ATP-generationen. Det inre membranet innehåller en serie av membranbundna proteinkomplex som innefattar andningskedjan liksom ATP-syntas, proteinkomplexet som kommer med ADP och Pi tillsammans för bildning av ATP. Värdser membran viks in i crista och elektroner skickas vidare andningskedjan komplex via cytokrom c, en löslig elektronbärare som rör sig mellan komplex inom intermembrane utrymmet. Som elektronerna rör sig, uppträder oxidation av reducerande ekvivalenter och vätejoner pumpas från matrisen till intermembrane utrymmet. Som en konsekvens av den höga jonkoncentrationen inom intermembrane utrymme, bygger en elektrokemisk gradient som resulterar i en membranpotential över det inre mitokondriemembranet (Δψ) 2. Syre är den slutliga elektronacceptor av elektrontransportkedjan, och vätejoner strömmar genom ATP-syntaser från intermembrane utrymme tillbaka till matrisen, och därvid direkt orsakar ATP-bildning. Denna process såsom beskrivits i sin helhet är känd som oxidativ fosforylering. Vecken i crista öka ytarean av det inre membranet, vilket möjliggör maximal elektrontransport och ATP-produktion inommitokondrien. Proteinerna, enzymer och andra molekyler som är involverade i oxidativ fosforylering härrör från såväl nukleära och mitokondriella gener. Mitokondrierna innehåller sin egen cirkulärt DNA, kodning för 13 proteiner samt tRNA och mRNA som krävs för ATP-produktion 3. Men många fler proteiner som krävs och därmed är kärn kodad. De flesta av dessa nukleära-kodade proteiner är riktade till den mitokondriella matrisen genom användning av presekvenser vid N-terminalen av prekursorproteinet, och import drivs delvis av Δψ 4,5.
Bortom bidra till bioenergetik i en cell, mitokondrier påverkar också stora metaboliska processer såsom TCA och beta-oxidation, cellulär signalering genom reglering kalcium, samt en nyckelroll i apoptos 6. Specifikt under tider av cellulär stress, BCL-2 familj proteiner som bor på eller interagera på mitokondrie yttre membran kan orsaka mitokondriellayttre membranpermeabilitet (MOMP) 7,8. Under MOMP, är cytokrom c och andra proteiner frigörs i cytosolen, och tillsammans med flera cytosoliska proteiner bildar ett komplex som kallas apoptosome 9,10. Den apoptosome aktiverar kaspaser som går vidare för att klyva cellulära proteiner och DNA under genomförandefasen av apoptos. Så snart MOMP inträffar, är ΔΨ kollapsat och ATP-produktion stoppas. Således, som apoptos initieras mitokondriefunktion äventyras och förändringar i ΔΨ kan korreleras till mitokondrie och cell hälsa 12. Medan apoptos är en slutpunkt i många sjukdomsmodeller, mitokondriefunktion och förändringar till ΔΨ kan också ge värdefull information om sjukdomsorigine och / eller progression. Till exempel har mitokondriella strukturella och funktionella förändringar dokumenterats under neurodegenerativa sjukdomar 13,14.
I den första delen av protokollet, isoning av intakta mitokondrier som behåller sin ΔΨ beskrivs. HEK-293T-celler exponerades för olika koncentrationer och kombinationer av rekombinant TNF-α, IL1-β och IFN-γ att inducera apoptos. Dessa cytokiner valdes eftersom de ofta rapporteras vara hög i primära humana slamprover 15 och den yttre vägen för apoptos kan utlösas av interaktion av TNF-α bindning till sin receptor 6. Eftersom det finns subtila variationer som krävs för att isolera funktionell mitokondrier från primära vävnader jämfört med odlade celler, och eftersom mycket forskning utnyttjar djur, protokollet beskriver också hur man isolera mitokondrier från lever och ryggmärg från anterior lateral skleros (ALS) musmodell.
Den andra delen av det protokoll utvecklades för att övervaka störningar till mitokondriell membranpotential med användning av en potentiell känsligt fluorescerande färgämne med en fluorescerande plattläsare. Skillnads mellan cellulär status (dvs friska kontra ohälsosamma) skiljer sig genom att kvantifiera styrkan i ΔΨ av isolerade mitokondrier i samband med losskopplingsmedel, andningskedjan hämmare, komplexa hämmare och jonoforer, som alla orsakar försvinnande av mitokondriell membranpotential. Ju friskare mitokondrierna, den större ändringen i ΔΨ vid behandling med mitokondriella hämmare, därför svaret från mitokondrier kan användas som en indikator på mitokondriell (dys) funktion.
Användning av isolerade mitokondrier snarare än in situ bedömning av funktionen ger definitiva bevis för att en patologi eller behandling modulerar direkt ändringar i organell 16-18. Även om det finns metoder i litteraturen att isolera mitokondrier från odlade celler, de är vaga 17 och / eller utnyttja specialutrustning 16. Detta protokoll beskriver i detalj isoleringsmetoden och ärlätt att anpassa till andra cellinjer, inklusive primär vävnad och kulturer 13,14,19,20. Många isolerade mitokondrier studier använder samma mitokondriella uncouplers och hämmare som används i detta protokoll, men med en Clark elektrod (21 är ett representativt exempel på många tidningar i litteraturen), vilket återigen är en mycket specifik och specialiserad utrustning. Dessutom har denna traditionella metod begränsningar såsom låg genomströmning och hög komplexitet 22,23 och kräver en betydande mängd mitokondrier (~ 500 mikrogram / reaktion). I detta protokoll, är den fluorescerande membrankännande potentiell sond TMRE används tillsammans med en fluorescerande plattläsare, vilket är en vanlig maskin i många laboratorier. TMRE betraktas allmänt eftersom det snabbt går in celler och isolerade mitokondrier och kan användas vid låga koncentrationer 24. Flera reaktioner kan snabbt sättas upp i tandem och batch analyseras med hjälp av detta protokoll. Vidare reaktionens kräver en mycket liten mängd av isolerade mitokondrier (~ 10 ug / reaktion). Genom att kräva mindre material, kan mindre vävnads eller cellodlingsprover användas som en utgångspunkt för mitokondrier isolering, kan fler replikat eller reaktioner inrättas, och potentiellt tillräckligt med material för andra isolerade mitokondrier experiment såsom ATP-produktion, syreförbrukning, eller importera analyser är möjliga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök överensstämde med National Institutes of Health riktlinjer och godkändes av Wake Forest University Djurvård och användning kommittén. Häckande par för SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] musmodell erhölls från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Icke-transgen vildtyp (WT) honor och hanar SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] var uppvuxna att generera SOD1G93A möss och icke-transgena WT kullsyskon som användes i experimenten.
1. Modeller för utredning
- Cellodling
- Bibehåll humana embryonala njurceller (HEK-T293) celler i DMEM kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin och 1% L-glutamin, vid 37 ° C i 5% CO2.
- Odla celler i T75-kolvar och tillåta dem att nå 90% konfluens.
- Utför Celldelnings via trypsinering (0,25% trypsin-EDTA) under 3-5 min vid 37 ° C i 5% CO 2
- Aspirera media och resuspendera cellpelleten i odlingsmedier.
- Seed celler i lämplig kolv eller plattan 7 x 10 4 celler i en T75-flaska 48 h före cytokinbehandling. Detta bör ge ~ 70% densitet vid behandlingstillfället.
- Serum svälta celler 24 h senare genom att aspirera media och ersätta den med samma volym av serumfritt medium (DMEM, sterilt).
- Förbered TNF-α, IL1-β, och IFN-γ, från lyofiliserat pulver med ultrarent vatten vid arbetskoncentrationer av 5 pg / pl, 10 ng / ul, och 10 ng / ul, respektive och lägga till dem till brunnarna / kolvar.
- Treat serumsvultna celler genom tillsats av solubiliserade cytokiner direkt till cellodlingsmedia av lämpliga kolvar. Behandlingar bestod av individuella cytokiner, en cocktail av alla tre (kallad "* 3"), eller sterile vatten som en kontroll (betecknad som "0").
- Inkubera behandlade celler för 24, 48 eller 72 timmar innan bedömning och skörd.
- Bedömning Cellviabilitet
- Gör en 5 mg / ml lösning av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) i 1 x PBS.
- För 12-brunnars plattor, tillsätt 100 | il av en MTT-lösning till varje brunn och snurra försiktigt för att försäkra jämn fördelning.
- Inkubera plattorna under 15 min-1 h vid 37 ° C i 5% CO 2 och kontrollera under ett mikroskop med avseende på närvaron av lilafärgning. Om ingen lila är närvarande, snurra igen och låta cellerna att inkubera under 5 min intervaller tills lila observeras. Den tid som krävs bör bestämmas av varje utredare.
- Med hjälp av en repetitionspipett, tillsätt 700 | il MTT lösningsmedel (4 mM HCl och 0,1% NP40 i isopropanol) till varje brunn och rock plattan (er) vid rumstemperatur under 5-10 minuter, eller tills all purpurfärg hade lämnat cellerna . Om lilafärgen inte kommer ut ur celler, lägga ytterligare 200 pl lösningsmedel och fortsätter att snurra.
- För analys, ta 100 l från varje brunn och placera i en 96-brunnar och läsa på en tallrik läsare använder 570 nm och en referensvåglängd på 630 nm, men 595 nm kan också godtas så länge avläsningar tas på konsekventa inställningar.
- Djur Modell av ALS
- Alla djurförsök överensstämde med National Institutes of Health riktlinjer och godkändes av Wake Forest University Djurvård och användning kommittén. Häckande par för SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] musmodell erhölls från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Icke-transgen vildtyp (WT) honor och hanar SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] var uppvuxna att generera SOD1G93A möss och icke-transgena WT kullsyskon som användes i experimenten.
- Utför genotypning med standard primers mot mutant SOD1 25.
2. Isolering av mitokondrier
OBS: Det är viktigt att arbeta snabbt och hålla allt på is under hela proceduren.
- Framställning av mitokondriell isoleringsbuffert (MIB), ryggmärg isoleringsbuffert (SC MIB) och experimentell buffert (EB)
- Bered följande stamlösningar i förväg för MIB och EB.
- Gör en M Tris / MOPS genom upplösning 12,1 g Tris-bas i 70 ml H2O Lägg torra MOPS att få pH till 7,4. Justera volymen till 100 ml final. Filtersterilisera och lagra vid 4 ° C.
- Gör 1 M Kphos genom att blanda 80,2 ml K 2 HPO 4 och 19,8 ml KH 2 PO 4. Förvara i rumstemperatur.
- Gör 0,2 M EGTA / Tris genom tillsats av 3,8 g av EGTA till 10 ml H2O Tillsätt 1 M Tris / MOPS tills lösta, ~ 30-40 ml. Justera till 50 ml, sterilfilter och förvara i rumstemperatur. Notera att pH blir ~ 6,7.
- Gör 1 M Glutamat genom att göra 10 ml1 M lösning av glutaminsyra. Filtersterilisera och lagra 4 ° C.
- Gör en M malat genom att göra 10 ml av en IM lösning av äppelsyra. Lägg Tris / MOPS till 50 mM. Filtersterilisera och lagra vid 4 ° C.
- Gör MIB vid en koncentration av 200 mM sackaros, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, och 1 mM EGTA / Tris. Filtersterilisera och lagra vid 4 ° C.
- Gör SC MIB vid en koncentration av 250 mM sackaros, 20 mM HEPES-KOH pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, och proteasinhibitorcocktail.
- Gör EB vid en koncentration av 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM glutamat, 2,5 mM målat, 1 mM K-fosfat, pH 7,4, och 10 mM EGTA / Tris. Filtersterilisera och lagra vid 4 ° C.
- Förberedelse utrustning före skörd av cellerna.
- Skölj ett litet glaskärl och homogenisering mortelstöt tre gånger med sterilt vatten och placera på is.
- Samla nödvändiga objekt såsom en vanlig borrmaskin, cell SCRApers, 1,5 ml, 15 ml och 50 ml rör och lösningar.
- Mitokondrier Isolering
- Odlade Celler
- För varje provtyp, använd två T175 kolvar av celler.
- Se till att cellerna är ~ 90% konfluenta och användning i kontrollexperiment, eller plattan och behandla såsom beskrivits ovan i steg 1,2.
- På bänken toppen, aspirera media och tvätta vidhäftande cellerna två gånger med 15 ml 1x PBS varje gång.
- Aspirera buffert och skrapa kolvar för att avlägsna de vidhäftande cellerna från botten av kolven.
- Tillsätt 15 ml 1x PBS till varje kolv, snurra, och överföra till enskilda 15 ml koniska rör och placera på is.
- När skrapning görs, centrifugera rören i 5 minuter vid 700 xg, 4 ° C med hjälp av en bordsskiva centrifug använder en svängig hink rotor.
- Aspirera supernatanter och suspendera varje pellet i 1 ml MIB.
- Kombinera både upphävanden och överför till en liten glaskärl för homogenisering.
- Lägg MIBtill fartyget tills bufferten når den första raden. Homogenisera celler med mortelstöt knutna till en borr vid medelhastighet under tre pass. Se till att fartyget är på is under detta steg, inte att ta bort mortelstöt ovanför vätskan och att använda en jämn hastighet med kontinuerliga pass.
- Överför den homogeniserade lösningen till en 50 ml koniskt rör.
- Dra in lösningen i en 3 ml spruta med hjälp av en 18 gauge 1 ½ tum nål och utvisa tillbaka den koniska röret på is med en 27 gauge ½ tum nål. Var noga med att driva ut lösningen mot innerväggen av röret så att utnyttja denna kraft för cellmembransöndring.
- Upprepa sprut stegen för totalt fem gånger.
- Överför lösningen till en 15 ml koniska rör och centrifugera under 5 min vid 600 xg, 4 ° C i en bordscentrifug med användning av en svängande hink rötor.
- Ta försiktigt bort supernatanten och fördela bland tre 1,5 ml rör.
OBS: Mitochondria är i supernatanten efter denna första, låg hastighet spinn, medan cellmembran och obrutna celler pelleteras. - Centrifugrör i en fast vinkel rötor vid 10000 xg, 4 ° C under 5 min.
- Aspirera supernatanter och kombinera pellets i 100 pl MIB och omedelbart placera på is.
OBS: Mitokondrierna är i pelleten efter denna höghastighets spinn. Mitokondrier normalt behålla sin membranpotential ~ 2-3 ion isen efter isolering och är mest stabila som en koncentrerad stamlösning i MIB.
- Mitokondrier isolerade från musvävnad
- Bedöva musen enligt IACUC protokollet. Ställ en förångare på 5,0% för att inducera anestesi. Bekräftat att djuret bedövas av brist på reflex för mul nypa eller blinkreflex när ögat är närmade eller tappas med en bomullspinne. Håll musen under anestesi för hela det kirurgiska ingreppet genom att hålla förångaren mellan 1,5% och 2,0%.
- Excise levern och ryggmärgen från varje djur och plats för sig i iskall 1x PBS - / - för att skölja bort något blod.
- För levern, överföra vävnad till en väger skålen på is och hacka i fina bitar med hjälp av en fräsch rakblad i 1 min.
- Lägg vävnad och lämplig buffert (MIB för lever- eller SC MIB för ryggmärgen) till kärlet tills bufferten når den första raden. Homogenisera vävnaden med mortelstöten för hand under fem pass. Se till att fartyget är på is under detta steg, inte att ta bort mortelstöt ovanför vätskan och att använda en jämn hastighet med kontinuerliga pass.
- Överför homogenaten för att rengöra 15 ml rör.
- Centrifugrör i en fast vinkel rötor vid 750 xg, 4 ° C under 10 min.
- Spara supernatanterna till rena rör och placera dem på is.
OBS: Mitokondrierna är i supernatanten efter denna första, låg hastighet spinn, medan cellmembran och hela celler pelleteras. - Återuppslamma ryggmärgen pellets in 500 pl SC MIB.
- Återhomogenisera varje tre gånger, bara att fylla kärlet halvvägs med SC MIB här gången.
- Överför nya homogenatet till ett nytt rör.
- Centrifugera i en fast vinkel rötor vid 750 xg, 4 ° C under 10 min.
- Kombinera dessa nya supernatanter, som innehåller fler mitokondrier, med den första supernatanten från varje prov.
- Centrifugrör i en fast vinkel rötor vid 10000 xg, 4 ° C under 5 min.
- Aspirera supernatanter och resuspendera lever pellets i 500 pl MIB och ryggmärg pellets i 50 pl SC MIB och omedelbart placera på is.
OBS: Mitokondrierna är i pelleten efter denna höghastighets spinn. Mitokondrier normalt behålla sin membranpotential ~ 2-3 ion isen efter isolering och är mest stabila som en koncentrerad stamlösning i MIB. - Utför en proteinkoncentration analys för att uppskatta koncentrationen av mitokondrier i lösning. Följ instruktions för att använda en kommersiell Protein Assay Kit eller liknande metod 26. Typiska koncentrationer av mitokondrierna är: 2 T175 kolvar utbyten ~ 2 mg / ml, ett muslever ~ 3-5 mg / ml, och en mus ryggmärg ~ 1-3 mg / ml.
- Odlade Celler
- Cytokrom c-analys med hjälp av en FoU Råtta / Mus cytokrom c Quantikine ELISA Kit (anpassad från det protokoll som tillhandahålls av tillverkaren).
- Omedelbart före inrättandet reaktionerna, späd mitokondrier till 0,5 mg / ml arbetskoncentration med EB och distribuera utspädda mitokondrier i 1,5 ml rör för reaktioner (vanligen 30-50 pl av mitokondrier per rör).
- Lägg antingen EB eller DMSO, vid 1% av den totala volymen, till de utspädda mitokondrier och inkubera reaktionerna på bänken topp för 7-10 min. Dessa reaktioner är stabil i upp till 30 minuter i rumstemperatur om det behövs en längre tidsram.
- Pellets mitokondrier genom centrifugering i en fast vinkel rötor vid 10000 xg, 4 ° C under 5 min och försiktigly separera supernatanten och placera varje i en separat 1,5 ml rör.
OBS: Rör kan antingen frysas vid -20 ° C för analys senare eller användas omedelbart. - Bestäm frisättning av cytokrom c från en jämförelse av koncentrationen av cytokrom c i pelleten och supernatanten 27.
- Bereda proverna genom solubilisering pellets i den ursprungliga volymen av reaktionen med 0,5% TX-100 i 1 x PBS.
- För varje prov, förbereda två brunnar på ELISA-plattan, en för nu upplösta pellets och en för supernatanten från reaktionen genom tillsats av 100 pl cytokrom c konjugat (använd direkt ur flaskan) plus 100 pl 0,5% Tx- 100 i 1x PBS, och sedan alla av pellet eller supernatanten prov.
- Vortexa försiktigt plattan en låg inställning (nivå 2-4) för 20 sek för att blanda, täck och inkubera i 1 h, 37 ° C.
- Nästa, tvätta plattan fyra gånger med tvättbuffert utspädda enligt tillverkningsrens anvisningar. Avlägsna eventuellt överskott lösning genom att knacka brunnarna på hushållspapper.
- Därefter till 150 pl av 1: 1 A + B framkallningslösning till varje brunn och inkubera plattan i 20-30 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Slutligen, tillsätt 50 | il stopplösning till varje brunn och ta absorbansavläsningar vid 540 nm med användning av en mikroplattläsare. Beräkna mängden cytokrom c-frisättning genom att jämföra mängden av cytokrom c i pelleten vs. supernatanten för varje reaktion.
3. Bedömning av mitokondrie (Dys) funktionen
- Omedelbart före reaktioner sätts upp, späda mitokondrier till 0,5 mg / ml arbetskoncentration med EB och placeras i 1,5 ml rör för reaktioner (vanligtvis 30-50 pl mitokondrier används per rör).
- Mitokondriella behandlingar
- Lägg lämpliga behandlingar (EB-kontroll, 1 ^ M FCCP blandat med 50 nM Valinomycin, 10 ^ M rotenon, 5 pM oligomycin, 2 mM KCN, eller 200 pM ADP, slutkoncentrationer) för att separera reaktioner vid 1/10 th den totala volymen av utspädda mitokondrier. Inkubera reaktioner på bänken topp för 7 min.
OBS: Var försiktig vid hantering av dessa ämnen som oavsiktligt intag eller absorption genom huden kan vara skadligt. - Späd TMRE, rekonstituerades i sterilt vatten vid en arbetskoncentration av 100 pM och lagrades vid -20 ° C, till 2 uM och lägga till en volym lika med den mitokondriella reaktionsvolymen.
- Inkubera reaktioner på bänken topp för 7 min.
- Pellets mitokondrier genom centrifugering i en fast vinkel rötor vid 10000 xg, 4 ° C under 5 min.
- Last hälften av supernatanten volymen av varje prov på en 396-brunnar och läsa fluorescens.
OBS: excitations- och emissionsvåglängder TMRE bör optimeras i enlighet med tillverkarens instruktioner med användning av volymen och plattan som kommer att användas föranalysen. Med hjälp av en vanlig 384-väl svart platta med 25 ^ 1 ^ M TMRE (slutlig reaktionskoncentration) den starkaste signalen erhölls med hjälp excitation / emissionsvåglängder 485 nm / 535 nm. - Beräkna fold-skillnaden i fluorescens mellan kontroll (EB) och varje behandling genom att dividera den relativa fluorescensvärdet (RFU) erhålls från plattläsaren för den experimentella prov av RFU från kontrollprovet.
- Lägg lämpliga behandlingar (EB-kontroll, 1 ^ M FCCP blandat med 50 nM Valinomycin, 10 ^ M rotenon, 5 pM oligomycin, 2 mM KCN, eller 200 pM ADP, slutkoncentrationer) för att separera reaktioner vid 1/10 th den totala volymen av utspädda mitokondrier. Inkubera reaktioner på bänken topp för 7 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling av HEK-293T-celler med 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, och 75 ng / ml IFN-γ (* 3) för 24-48 h leder till progressiva mängder celldöd (Figur 1A ). Cellviabilitet bestämdes med användning av MTT-analyser och konsekvent visar att det finns ~ 10% minskning av cellviabilitet med 24 tim behandling och ~ 20% minskning med 48 tim behandling. Celler behandlade med liknande koncentrationer (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, och 75 ng / ml IFN-γ) ger liknande celldödsresultaten vid 48 h, och behandling med individuella cytokiner avslöjar att minskningen i lönsamhet beror på kombi påverkar (Figur 1B). Uppgifterna viabilitet i figur 1B representerar medelvärdet +/- standardavvikelse 3 separata experiment varje körning i tre exemplar, och tätheten av felstaplarna påvisa reproducerbarhet av data. Mängden av cytokiner kan justeras i detta behandlingsprotokoll att ytterligare elucidate bidraget från varje cytokin på celldöd, och ytterligare cytokiner eller andra faktorer kan också ingå, så länge lämpliga kontroller utförs.
Isolering av mitokondrier från celler och vävnader har beskrivits i litteraturen sedan 1940 28,29. Premissen för förfarandet är störningar cell följt av differentiell centrifugering, där rå mitokondrier är kända för att pelle vid ~ 10.000 x g. Många protokoll som använder isolerade mitokondrier kräver intakta dubbla membran som kan motstå deras membranpotential, och därför är det nödvändigt att utvärdera integriteten när isoleringen är klar. Under utvecklingen av mitokondrierna isoleringsprotokoll från odlade HEK celler, var ett cytokrom c-analys används för att indikera om erhölls intakta mitokondrier. Använda kommersiellt tillgänglig cytokrom c ELISA kit, var mitokondrier kvantifieras efter isolering och späds i EB, och sedan antingen EB eller DMSOsattes och reaktionerna att inkubera på bänk. Sedan, genom att separera mitokondrier från omgivande supernatanten, analys av cytokrom c halt av båda fraktionerna användes som en mätare för mitokondriell membran intactness; om majoriteten av cytokrom c blir kvar i den mitokondriella pellets sedan mitokondrierna vara intakta, medan om mer än 15% av cytokrom c finns i supernatanten, då mitokondrier ansågs olämpliga för funktionella studier. Som framgår av tabell 1, beskrev protokollet avkastningen ~ 12% cytokrom c utsläpp och ~ 15% när isolerade mitokondrier är förbehandlade med DMSO. Liknande resultat har tidigare rapporterats för mitokondrier isolerade från andra cellinjer eller djurvävnader 19,20,27. Alternativt kan mitokondrie integriteten också bedömas med TMRE, som användes under isolering av mus lever och ryggmärgs mitokondrier. Under ursprungliga isoleringen protokoll development, försök utvärderas mitokondrier isolerade från levern och ryggmärgen hos friska, normala möss mitokondrier. För varje prov, blev ΔΨ utvärderades genom att jämföra den fluorescerande signalen från isolerade mitokondrier behandlade med EB dem inkuberas med FCCP + Valinomycin (tabell 2). Ett förhållande av fluorescens mellan behandlade och obehandlade mitokondrier av> 1 användes som en indikation på friska, intakta mitokondrier.
När framgångsrika mitokondrier isoleringsprotokoll utvecklades, mitokondrier isolerade från kontroll, obehandlade celler och * 3 cytokin behandlade celler, eller normala och SOD1 möss analyserades. HEK mitokondrier från båda grupperna behandlades med olika uncouplers och inhibitorer och ΔΨ mätta med ändringar TMRE upptag. Den faldig skillnad i kontroll EB behandlade mitokondrier att frikopplare / inhibitor behandlade mitokondrier indikerar en skillnad i styrka ΔΨ mellan de två grupperna (representativa uppgifter och calarna i tabell 3). Dessutom procent minskning från obehandlade celler till * 3 behandlade celler betyder att mitokondriell hälsa påverkades av cytokin behandlingar, bekräftar cellviabilitet uppgifter (Figur 2). Utvärdering av ΔΨ styrka via TMRE upptag med hjälp mitokondrier isolerade från levern och ryggmärg av fyra individuella normala, kontrollmöss jämfört med fyra ALS-möss tyder på att vävnad hälsa även kan bedömas med hjälp av detta protokoll. Som illustreras av faldiga skillnader och procentuella minskningar i ΔΨ, jämförelse av EB-behandling och FCCP + Valinomycin-behandling av mitokondrier från kontroll och sjukdoms utvecklats djur är signifikant olika (Tabell 4, se även referenser 13 & 14).
Figur 1: Celldöd framkallad med * 3 behandling är progressiv över tid och större än med enskilda cytokin behandlingar. (A) HEK-293T celler behandlades under 24 eller 48 timmar och celldöd mättes med hjälp av en MTT-analys. Värden normaliserades till kontroll, obehandlade proverna och data representerar trefaldiga mätningar för n = 3, +/- standardavvikelse. (B) HEK-293T-celler behandlades med individuella cytokiner eller en cocktail (* 3) för 48 h och celldöd bedömda via MTT-analys. Data representerar n = 5 för varje enskild cytokin och n = 6 för * 3, +/- standardavvikelse.
| Pellet (AU) | Supernatanten (AU) | % Cytokrom c frisättning | |
| 0 | 0,818 | 0,115 | 12,6 ± 2,27 |
| DMSO | 0,793 | 0,142 | 15,3 ±; 2,23 |
Tabell 1:. Bibehållande av cytokrom c i isolerade mitokondrier från odlade celler Data representerar medelvärdet av n = 4, +/- standardavvikelse.
| lever 1 | lever 2 | ryggmärg en | ryggmärg 2 | ||
| RFU | EB | 97830 | 94132 | 339716 | 290154 |
| F / V | 435188 | 461299 | 385366 | 482480 | |
| förhållande | 4,45 | 4,9 | 1,13 | 1,66 | |
| EB = experimentell buffert och F / V = FCCP + valinomycin. | |||||
Tabell 2:. Mått på ΔΨ från mitokondrier isolerade från normala musvävnader Två separata djur användes för att isolera lever och ryggmärg mitokondrier i tandem (t.ex. lever 1 och ryggmärg en är från samma djur).
| EB | oligo | röta | KCN | ADP | F / V | ||
| RFU | 0 | 4844 | 12507 | 12734 | 9925 | 10892 | 4844 |
| * 3 | 6517 | 13639 | 12435 | 10235 | 13154 | 6517 | |
| Faldig skillnad | 0 | NA | 2,58 | 2,63 | 2,05 | 2,25 | 2,65 |
| * 3 | NA | 2,09 | 1,91 | 1,57 | 2,02 | 2,18 | |
| % Minskning | 0 vs. * 3 | 18.94 | 27,41 | 23,35 | 10,24 | 17,67 | |
| EB = experimentell buffert; oligo = oligomycin; rot = rotenon; KCN = kaliumcyanid, och F / V = FCCP + valinomycin. | |||||||
Tabell 3: Rådata och beräkningar från cell culture isolerade mitokondrier experiment.
Figur 2: Mitokondrier isolerade från cytokin-behandlade celler har minskat membranpotential. Procent minskning med ΔΨ för 0 vs. * 3 för varje behandling, jämfört med kontroll, enligt beräkningen i tabell 2. Data representerar medelvärden av dubbla reaktioner för n = 3 (oligomycinkänslig, rotenon och FCCP / Valinomycin) eller n = 2 ( KCN och ADP) +/- standardavvikelse. * = Statistiskt signifikanta p-värden baserade på faldig skillnad beräkningar; p = 0,03, 0,01, och 0,05 för oligomycin, rotenon och FCCP / Valinomycin, respektive.
| Ryggmärg | Lever | ||
| Vik Skillnad | Kontroll | 1,54 ± 0,48 | 3,20 ± 1,56 |
| SOD1 | 1,10 ± 0,30 | 3,12 ± 1,75 | |
| % Minskning | 28,1 | 2,48 | |
| p-värde | 0,03 | 0,41 |
Tabell 4: Mitokondrier isolerade från ryggmärg av SOD1 möss har minskat membranpotential som bedöms av FCCP + Valinomycin Data representerar ett genomsnitt av fyra djur per grupp..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Behandling av HEK-293T-celler med rekombinanta cytokiner orsakar måttliga mängder celldöd över 48 h (figur 1). Mängden celldöd inducerad av TNF-alfa behandling liknar tidigare rapporterade studier 30 och cellviabiliteten minskar efter samtidig administrering av multipla cytokiner som är större än summativa mängder med någon cytokin ensam är också förenligt med litteraturen 31,32. Möjligheten att justera de belopp och typer av cytokin behandlingar samt jämförelse av cocktails till enskilda cytokiner gör denna cellodlingsmodell attraktivt för att studera de specifika effekterna av cytokin exponering på njurceller. Dessutom är resultaten mycket reproducerbara och lätt uppnås (Figur 2). Överväganden att tänka inkluderar sammanflödet av cellerna. Till exempel behöver celler som behandlats med 100% sammanflödet inte svarar lika bra på samma koncentrationer av cytokiner vid behandling vid 70-80% confluens. Vidare bör antalet passager cellerna har gått igenom spåras, som cellsvar eventuellt kan påverkas att ha varit i kultur för länge (mer än 8-12 veckor sedan upptining). Även behandling av odlade celler med cytokiner minskade cellviabiliteten och därefter mitokondriell hälsa, är det ingalunda en modell för sepsis per se. Men användningen av en mer kliniskt relevant modell, till exempel anställa primära njurceller isolerats från möss och / eller behandling med naturligt utsöndrade cytokiner från stimulerade THP1 celler 33, är en naturlig förlängning av detta arbete. Med tanke på skillnaden i förståelsen av njursvikt vid sepsis, sådana cellodlingsmodeller och bedömning av mitokondrier kan ge första inblick i de mekanismer samt en preliminär plattform för att testa effektiviteten av läkemedelssubstanser som förebyggande eller interventionsbehandlingar.
Mitokondrier isolerade från odlade celler eller djurvävnaderråd med kapacitet att snabbt utvärdera effekterna av cellbehandlingar eller sjukdomsprogression på mitokondriell hälsa. Isoleringen och utvärderingsprotokoll är inte tekniskt krävande att utföra, och kunde lätt modifieras för användning med andra cellinjer eller primära vävnader. MIB och EB används för varje prov typ är bra start recept som kan justeras efter behov om en viss cell eller vävnadstyp har olika krav. Till exempel, är vanligtvis nödvändigt för användning med neuroner tillsats av fettsyra-fri BSA, som medföljer ryggmärgen protokoll 15,34. Störningen cellmetoden kan också ändras genom att använda mer sprut fördrivning eller ändra till hand homogenisering istället för att använda en borr eller vice versa. Vidare åter homogenisering av det första centrifugeringspellet, som utförd i ryggmärgen mitokondrier förfarande, kan vara nödvändigt att erhålla en tillfredsställande mängd av mitokondrier. En bra indikator på att en isoleringsprotokoll producerar livskraftiga mitochondria är användning av cytokrom c ELISA. Denna analys är ett snabbt och enkelt alternativ till western blot-analys av cytokrom c frisättning och är också ett bra sätt att bedöma cytokrom c frigivning efter behandling av mitokondrier med peptider eller andra föreningar 19,27. Alternativt kan TMRE användas under protokoll utveckling, men det är viktigt att utvärdera mitokondrier isolerade från ett prov som är känt för att vara frisk. Dessutom, när isolera mitokondrier från mus vävnader som inte rutinmässigt beskrivs i litteraturen, kan lever mitokondrier fungera som en positiv kontroll samt används för att ställa en baslinje. Till exempel, som i detta protokoll, levrar från varje djur, både under protokoll utveckling samt experiment också ut och användas för mitokondrier isolering. Ett annat övervägande för en beredning är mängden mitokondrier erhållen vid slutet av isoleringsförfarandet. Om koncentrationen av mitokondrier är 1 mg / ml eller mindre sedananalysresultat kan vara opålitliga (opublicerade observationer VDGM). Antingen mängd utgångsmaterial, MIB recept eller disruptionsmetoden bör optimeras innan han flyttade till funktionella analyser. När väl en framgångsrik isolering protokoll har uppnåtts, kan mitokondrierna också användas i andra analyser, såsom totalt ATP-innehållet och ATP generation 13,14.
Mitokondrierna funktionen protokoll som beskrivs här tillåter indirekt mätning av mitokondriell upptag av den potentiella kännande färgämne TMRE med en vanlig fluorescerande plattläsare. Efter mitokondrierna har isolerats och lämpliga kemikalier som tillsätts, de inkuberas med TMRE och sedan pellete. Genom att behandla hela celler eller djur och isolera mitokondrier före ΔΨ bedömning, confounding variabler såsom multiresistent transporter eller ATP flux undviks. Mängden fluorescens i supernatanten analyseras sedan med insikten att det hälsosam mitokondriernaden starkare deras ΔΨ och därför mer upptag av TMRE. Som ett resultat bör mängden av fluorescens i supernatanten vara mindre i friskare mitokondrier och mer i ohälsosamma mitokondrier. Genom att inkludera en EB-enda behandling, den faldig skillnad av fluorescens mellan denna kontroll och okopplade mitokondrier kan beräknas. En annan viktig kontroll med varje uppsättning reaktioner köra är TMRE ensam. Resultatet från denna kontroll ger ett maximalt möjliga fluorescerande läsning. Eftersom TMRE läggs till reaktioner är nyligen utspätt, det finns normala variationer. Till exempel var TMRE-endast läsningar av ~ 20.000, 25.000 och 30.000 uppnås vid olika tidpunkter under protokollutveckling. Om TMRE-bara signalen är mycket större än någon av de behandlade mitokondrier prover och / eller om behandlade mitokondrierna är inte signifikant från obehandlat, då isoleringen av kopplade mitokondrier var troligen inte lyckat. Minskningen i ΔΨ mätt med ett förhållande som erhållitsnär man följer detta protokoll liknar tidigare rapporterade belopp för kontroll, friska celler 2,35. Jämförelse av ΔΨ förändringar från mitokondrier isolerade från kontroll, obehandlade HEK-293T celler och * 3 cytokin-behandlade celler visade att minskad cellviabilitet observerats i MTT-analyser översätter till minskad mitokondrier funktion. Denna plattläsare analys skulle lätt kunna användas med mitokondrier isolerade från någon källa och används för att undersöka sjukdomsmodeller som ALS, vilket visas här 13,14.
Flera studier har utnyttjat mitokondrier specifika fluorescerande färger för att upptäcka MOMP, vilket var viktigt för uppkomsten av denna plattläsare analys. Men dessa studier antingen använda hela celler för att screena föreningar som blockerar eller inducerar MOMP 35,36, utforska nya ΔΨ kännande färgämnen 2 eller identifiera andra format såsom flödescytometri på ett mikrochip 37. Detta protokoll är unikt genom att det beskriver adETALJERAD metod för att isolera och använda mitokondrier att snabbt utreda effekterna av hel-cellsbehandling genom respons på kända ΔΨ förändrande föreningar. Detta protokoll utnyttjar en mängd olika uncouplers och hämmare, och indikerar att någon av dem skulle vara lämpliga för att bedöma mitokondriell hälsa. Medan detta särskilt utredningscentra på mitokondriella förändringar på grund av cellulär stress eller progressiv cellulär dysfunktion, protokollet skulle också kunna användas för att undersöka förändringar i mitokondriernas metabolism genom användning av specifika föreningar och / eller tillägg av elektronkällor såsom succinat och NADH .
Viktiga överväganden vid utför den isolerade mitokondrier bedömning inkluderar konsekvens i behandlingsvolymer, hålla mitokondrierna i MIB och späda dem i EB omedelbart före behandlingarna kommer att sättas upp, och med hjälp av mitokondrier inom 3 timmar av isolering för att säkerställa deras ΔΨ fortfarande bibehålls. DenValet av TMRE framför andra mitokondrier specifika fluorescerande färgämnen såsom JC-1 berodde på förmågan att använda små koncentrationer och enkelhet att analysera fluorescens med användning av endast en våglängd. Denna metod kan på liknande sätt utföras med hjälp av fluorescensmikroskopi 2,38 eller flödescytometri 37 emellertid användning av en plattläsare tar mindre tid och kräver mindre optimering 35. Dessutom är detta protokoll mycket mindre tekniskt krävande, snabbare att utföra, och lättare reproducerbar jämfört med att använda en Clark elektrod 22 (Del Gaizo Moore, opublicerade observationer). Titrering mängder av varje mitokondrie behandling kan ge ytterligare insikt i mitokondriefunktion och optimering av koncentrationer bör utföras. Den totala volymen av de mitokondriella reaktionerna kan justeras för att passa den mängd prov som erhållits under isolering samt antalet behandlingsreaktioner nödvändiga. Om möjligt, ett standardbelopp på 50 μ; L används; dock så litet som 20 pl mitokondrier producerar tillförlitliga resultat.
Medan ΔΨ korrelerar till syreförbrukning, analysen presenterades inte direkt mäter syreförbrukning. Medan fluorescerande syre sonden som MitoExpress har utvecklats, förmodligen för att undvika några av de downfalls att använda en Clark elektrod ovannämnda priset per reaktion och kravet på större mängder mitokondrier per analys förblir begränsande. Därför användningen av TMRE och klassiska ΔΨ uncouplers eller hämmare har flera fördelar. Återigen, parti analys av flera prover eller flera behandlingar / prov, reproducerbarhet, lägre utgångsmaterial behov och / eller lägre mängd isolerade mitokondrier krävs per reaktion göra detta protokoll attraktiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-glutamic acid | Sigma | G1251 | Can use the potassium salt instead. |
| malic acid | Sigma | M8304 | Can use the potassium salt instead. |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Trisma base | Sigma | T6066 | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| CCCP | Sigma | C2920 | Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C. |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C. |
| sucrose | Fisher | S5-500 | |
| KCN | Mallinckrodt | 6379 | Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water |
| rotenone | Sigma | R8875 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| oligomycin | Sigma | O4876 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| ADP | Sigma | A2754 | |
| TMRE | Sigma | 8717-25mg | Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use. |
| DMEM | Gibco | 11965-084 | 1x regular (high glucose). |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-155 | |
| L-glutamine | Fisher | SH3002101 | Store aliquots at -20 °C |
| FBS | Lonza | 14-501F | US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C. |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| DMSO | SIgma | D2650 | |
| Protien Assay Dye (5x) | Bio-Rad | 500-0006 | Any protein assay can substitute. |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | Make 2 mg/ml stock in water for protein assay. |
| MTT powder | Sigma | M2128 | Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week. |
| Tergitol solution (NP-40) | Sigma | NP40S | |
| Recombinant Human IL-1B | Gibco | PCH08014 | Once opened store aliquots at -20 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha | Gibco | PHC3015L | |
| Recombinant Human IFN-gamma | Gibco | PHC4031 | |
| Dulbeccos PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions. |
| Cytochrom c ELISA kit | R&D systems | DTC0 | Human for HEK-293T cells. |
References
- Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
- Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
- Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
- Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
- Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
- Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
- Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
- Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
- Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
- Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
- Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
- Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
- Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
- Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
- Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
- Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
- Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
- Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
- Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
- Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
- Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).
