Summary
Descriviamo come visualizzare macrofagi C. neoformans (Cn) interazioni in tempo reale, con particolare enfasi sul processo di esocitosi non-litica mediante microscopia ottica digitale. Utilizzando questa tecnica individuale macrofagi infetti può essere studiato per accertare i vari aspetti di questo fenomeno.
Abstract
Molti aspetti l'infezione di macrofagi da Cryptococcus neoformans sono stati ampiamente studiati e ben definito. Tuttavia, una particolare interazione che non è chiaramente compreso è esocitosi non-litico. In questo processo, le cellule di lievito vengono rilasciati nello spazio extracellulare con un meccanismo poco compreso che lascia entrambi i macrofagi e Cn praticabile. Qui, descriviamo come seguire un gran numero di macrofagi infettati singolarmente per un periodo di 24 ore l'infezione mediante microscopia-tempo trascorso. Macrofagi infetti sono alloggiati in una camera di riscaldamento con un atmosfera di CO 2 collegato ad un microscopio che fornisce le stesse condizioni di un incubatore di coltura cellulare. Microscopio digitale diretta in grado di fornire informazioni sulle interazioni dinamiche tra un host e agente patogeno che non è disponibile da immagini statiche. Essere in grado di visualizzare ogni cellula infettata può fornire indizi su come i macrofagi gestire infezioni fungine, e viceversa. Questa tecnica isa potente strumento per studiare le dinamiche che stanno dietro un fenomeno complesso.
Introduction
Le fasi di una infezione fungina tra le cellule criptococco e macrofagi sono ben documentati 1-3. Dopo cellule di lievito vengono ingeriti dai macrofagi, una varietà di interazioni possono verificarsi: il macrofago può lisare rilasciando il suo carico fungina nello spazio extracellulare, o potrebbe controllare l'infezione mantenendo le cellule di lievito entro i confini della sua membrana cellulare 4. Tuttavia, alcuni anni fa un nuovo risultato è stato descritto indipendentemente da due gruppi: esocitosi non-litico, un processo in cui un macrofago cancellata alcune o tutte le celle criptococco nell'ambiente circostante o una cellula vicina e sia host e patogeno rimangono vitali 5 -8. Diversi studi hanno cercato di comprendere i meccanismi molecolari alla base di questa interazione, ma abbiamo ancora non hanno una conoscenza completa su ciò che guida questo fenomeno.
La capacità di catturare immagini in tempo reale e successivamente analizzare infettare piùEd macrofagi permette di rispondere a molte domande sulle proprietà fisiche circostanti esocitosi non-litica per quanto riguarda i tempi, la capacità spaziale, il cambiamento nella morfologia e anche lo stress di macrofagi nel corso di una infezione fungina. Permettendo alle cellule di essere ospitati in un ambiente che è paragonabile a quello di un incubatore, possiamo intravedere la natura dinamica delle interazioni cellulari di macrofagi-fungine. I ricercatori hanno usato questa tecnica per studiare vari elementi di questo processo. Il ruolo del phagosome in questo processo è stato reso evidente con colorazione fluorescente e actina agenti di blocco 9, mentre un altro gruppo ha usato questo metodo per dimostrare che esocitosi non-litica è stata bloccata in cellule che hanno avuto la WASH nucleazione domini proteici cancellato 10. L'effetto di segnalazione delle citochine è stata anche determinata mediante microscopia in tempo reale 11. Questo processo non è limitato a C. neoformans come è stato osservato anche con Candida albicans, another patogeno fungino che ha la capacità di infettare i macrofagi 12. Questi risultati sono esempi di come questo metodo può fornire una serie di informazioni in un'area che sappiamo così poco.
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Protocol
Tutto il lavoro animale è stato fatto in conformità con le normative e le linee guida dell'Istituto di studi sugli animali con Albert Einstein College of Medicine.
1. Crescita Condizioni di C. neoformans H99 (sierotipo A)
- Grow individuale C. neoformans (Cn) colonie su piastre di agar Sabouraud.
- Un giorno prima dell'esperimento, selezionare una colonia e inoculare 10 ml di brodo Sabouraud.
- Lasciare cultura a crescere durante la notte a 37 ° C agitando a velocità di 250 rpm.
2 Isolamento e preparazione di primaria Bone macrofagi da C57 / BL6 Mice
- Euthanize topi mettendo animale in una camera di CO 2 fino a non respirare più. Come seconda misura, cervicale dislocare il collo prima di iniziare la dissezione. Sterilizzare tutto il corpo con il 70% di alcol etilico.
- Rimuovere entrambi i femori e tibia e posto le ossa in DMEM sterile.
- Rimuovere il tessuto in eccesso e muscolare con delicate asciuga fino ossa sono completamente puliti.
- Posizionare le ossa intatte solo in una capsula di Petri contenente il 70% di alcol etilico e incubare per 3 minuti per uccidere i microrganismi associati. Togliere le ossa e posto in capsula di Petri con DMEM sterile.
- Tagliare con cautela estremità delle ossa. Tenere osso su un tubo conico vuoto 50 ml posti su ghiaccio e lavare accuratamente 10 ml di DMEM freddo utilizzando un ago da 25 G con ogni osso.
NOTA: Ogni topo produrrà 4 ossa (2 femori, tibie 2). Pertanto un mouse dovrebbe produrre circa 40 ml di sospensione cellulare. - Sospensione cellulare Centrifugare a temperatura ambiente per 10 min a 650 x g.
- Durante questo centrifugazione, preparare e filtro sterilizzare midollo osseo macrofagi alimentazione dei media che consiste di DMEM supplementato con il 20% L929, siero di vitello fetale 10%, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-glutammina , 1% di aminoacidi non essenziali, 0,1% 2-mercaptoetanolo.
- Risospendere il pellet risultante con 10 ml di alimentazione dei supporti. Passare suspens cellulariion attraverso un filtro 70 micron cella di interrompere grumi di cellule e rimuovere i detriti di grandi dimensioni.
- Tavola 1 ml di sospensione cellulare in 10 ml di media alimentare in capsule di Petri che vengono specificati per l'uso coltura tissutale (per un totale di 10 piatti).
- Consentono alle cellule di aderire a 37 ° C con 10% di CO 2. Aggiungere 5 ml di supporti di alimentazione fresca il giorno 3 Il giorno 7, completamente sostituire il supporto di alimentazione e macrofagi sono pronti per essere utilizzati.
- Il giorno prima dell'esperimento, staccare macrofagi di targa togliendo mezzi di alimentazione e aggiungere 5 ml di una cellula dolce strippaggio reagente alla piastra.
- Incubare per 5-10 min a 37 ° C e rimuovere macrofagi con dolce pipettaggio.
- Cellule pellet per centrifugazione a 650 xg per 10 min.
- Risospendere il pellet in 1 ml di alimentazione dei supporti. Usando una diluizione 1:20, calcolare la concentrazione di macrofagi pipettando 10 ml di sospensione cellulare su un emocitometro.
- Utilizzo di 14 millimetri con fondo trasparente piastre di Petri, un piattoconcentrazione di 1 x 10 5 macrofagi direttamente sul pozzo interno che contiene un massimo di 200 ml, quindi prendere precauzioni per non superare questo volume, come mostrato in Figura 4.
- Consentire alle cellule di aderire alla piastra di Petri di vetro mettendo i piatti in un incubatore a 37 ° C per 1 ora.
- Aggiungere 1-2 ml di alimentazione supporti integrati con LPS a 1 mg / ml e IFNg a 500 U / ml e permettono alle cellule di incubare una notte.
3 co-incubazione dei macrofagi murini primari e C. neoformans
- Il giorno dell'esperimento, rimuovere 1 ml di cellule di coltura e lievito pellet pernottamento inoculate mediante centrifugazione per 5 min a 420 x g.
- Lavare le cellule 3 volte con PBS sterile per rimuovere il supporto e prodotti criptococco extracellulari come la glucuronoxylomannan polisaccaride (GXM) alla velocità e il tempo di cui sopra.
- Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS sterile e fare una diluizione 1: 100. Pipettare 10 ml di tegli diluizione su un emocitometro e contare le cellule. Aggiungi cellule di lievito in una MOI di 1: 5. Ad esempio, se ci sono 1 x 10 5 macrofagi / bene, fare una sospensione cellulare di 5 x 10 6 / ml di Cn e aggiungere 100 ml di questa soluzione per un importo complessivo di 5 x 10 5 Cn.
- Registrare il volume calcolato di sospensione cellulare criptococcica a 1 ml di mezzi di alimentazione con l'anticorpo monoclonale 18B7 ad una concentrazione di 10 mg / ml. Incubare sospensione cellulare a temperatura ambiente per 5 min.
- Rimuovere i supporti di alimentazione dal fondo di vetro piatto di Petri e lavare 1 volta con PBS sterile. Aggiungere 100 ml di opsonizzati Cn direttamente al bene.
- Consentono alle cellule di incubare per 2 ore a 37 ° C con il 10% di CO 2.
- Dopo aver co-incubazione, controllare da microscopio che i macrofagi hanno interiorizzato Cn. Per essere considerati interiorizzato, le cellule criptococco dovrebbero chiaramente essere visto entro i confini del macrofago.
- Lavare 3x Petri piatto con PBS sterile per rimuovere ogni e qualsiasi extracellular Cn.
- Aggiungere 1-2 ml di alimentazione dei supporti, senza l'aggiunta di mAb 18B7, e impostare microscopio.
4. Visualizing non-litica Esocitosi in tempo reale Utilizzando Luce Microscopia Digitale
NOTA: Per eseguire questi esperimenti, un microscopio che viene fornito con una camera di incubazione allegato che include CO 2 la consegna è richiesta una unità di riscaldamento.
- Prima dell'esperimento, pre-riscaldare la camera di incubazione per almeno 30 min a 37 ° C. Assicurarsi che l'unità di CO 2 legge 5% all'inizio dell'esperimento.
- Luogo fondo di vetro piatto di Petri su piattaforma microscopio, coprire con CO 2 coperchio, e chiudere tutte le porte per garantire l'assenza di fughe di calore.
- Utilizzando l'obiettivo 10X con il microscopio a contrasto di fase, concentrarsi su una chiara campo di macrofagi infettati. Sulla base della sperimentazione, determinare l'obiettivo utilizzato da quanti macrofagi necessario studiare.
- Impostare il software microscopio a take un'immagine ogni 4 minuti per un periodo di 24 ore.
- Dopo 24 ore, l'esperimento avrà raggiunto il completamento e sarà stato raccolto un totale di 361 immagini. Esportare queste immagini come .jpegs a compressione 5%. Utilizzando software Image J, visualizzare le immagini come una pila di Visual a 5 fotogrammi al sec. Se il filmato deve essere visto per la pubblicazione o una presentazione, salvarla sia come avi o mov di file a seconda di quale formato funziona meglio per lo spettatore.
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Representative Results
Le immagini che questa tecnica produce possono essere analizzati in una varietà di modi per raccogliere informazioni che circonda ciò che accade dopo che le cellule sono fagocitati C. neoformans. Come si vede nella figura 1, ci sono circa 100 i macrofagi che sono o infetto o non infetto. Ognuno di questi macrofagi dà allo spettatore l'opportunità di studiare le interazioni ospite-patogeno su un livello molto microscopico. Come le figure 2 e 3 mostrano, ci sono diversi esiti che possono verificarsi tra una cellula macrofagi e lievito, e persino tra macrofagi-macrofagi. I macrofagi possono essere segnati come in fase di esocitosi non-litico, il trasferimento cellula-cellula, o qualsiasi altro processo cellulare che possono verificarsi. La tempistica di tali eventi durante l'infezione può anche essere accertata sulla base dei parametri impostati quando il filmato viene registrato.
Figura 1:. Campo di macrofagi infetti Questa figura mostra un intero campo di macrofagi infettati singolarmente all'inizio di un periodo di infezione 24 ore. Va notato che il campo è libero di Cn extracellulare e, soprattutto, come è chiaro che i macrofagi sono infetti (come indicato da una freccia grande) e che non contengono cellule fungine (come indicato da una piccola freccia). Barra della scala rappresenta 50 micron.
Movie 1 : Visualizzazione dei macrofagi C. neoformans 24 ore Periodo di infezione. La cornice iniziale del film mostra molti macrofagi in tutto il campo, con alcuni che sono non infetto e alcuni che hanno fagocitato quantità variabili di cellule criptococco. Mentre il film progredisce, le cellule are tutti mobili e può essere visto muoversi sul campo. Siamo in grado di seguire ognuno di questi macrofagi per vedere che tipo di processo cellulare che subiscono.
Figura 2:. Primari murini macrofagi sottoposti a non-litica Esocitosi An macrofagi infetti (Pannello A, indicato da una freccia bianca) si vede subendo le fasi iniziali di esocitosi non-litico. Il phagosome inizia per ingrandire (pannello aC) e la carica fungina inizia a spostarsi. Diverse cellule Cn vengono poi rilasciati nello spazio extracellulare come si può vedere in pannelli DE. Un secondo macrofagi infetti nel Pannello di F, indicato da una freccia bianca, subisce anche un evento esocitosi non-litica (Pannello di GH). Alla fine del processo, entrambi i macrofagi vengono lasciati vuoti (Pannello I) come mostrato dalle frecce bianche. Barra della scala rappresenta 25 micron.
Movie 2 :. Visualizing primario murino macrofagi sottoposti a non-litica Esocitosi In questo film, è chiaro che le cellule criptococco sono entro i confini di un macrofagi infetti. Il macrofago diventa agitato e una cellula di lievito può essere visto in erba all'interno del phagosome. Cellule criptococcica sono poi rapidamente espunte nell'ambiente circostante. Un secondo macrofago infettato subisce esocitosi non-litico e più cellule di lievito vengono rilasciati nello spazio extracellulare. Le cellule ospiti restino vitali dopo la esocitosi criptococcica come indicato dalla loro capacità di continuare a muoversi.
Figura 3:. Primari murini macrofagi sottoposti a trasferimento cellula-cellula di un altro process che può essere catturata usando questo protocollo è il trasferimento cellula-cellula che si verifica quando le cellule criptococco vengono trasferiti da un macrofago ad un macrofago vicina. Due macrofagi infetti sono in stretta vicinanza l'uno all'altro indicato da frecce bianche (Pannello A) e spostare ancora più vicini per avviare il trasferimento cellula-cellula (pannello B). Un ponte cellula-cellula indicato dalle frecce rosse si forma tra i due macrofagi tale che le cellule criptococco non vengono esposte all'ambiente circostante durante il trasferimento (pannello C, E). Dopo che il trasferimento è completo, le cellule si staccano (Pannello D, F). Barra della scala rappresenta 25 micron.
Movie 3 :. Visualizzazione trasferimento cellula-cellula Tra macrofagi infetti A volte, i macrofagi interagiscono in modo tale che facilita il trasferimento di cellule criptococcica tra le cellule ospiti. Le cellule di lievito non sono espostiper l'ambiente extracellulare e le cellule ospiti rimangono vitali. In questo film, due macrofagi infetti creano ponti cellula-cellula in due diverse occasioni alle cellule criptococco navetta da uno dei macrofagi ad un altro.
Figura 4: Schema che mostra la preparazione di cellule.
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Discussion
Qui abbiamo descritto un metodo con cui le interazioni fungine-macrofagi possono essere registrati e analizzati in tempo reale per un periodo di 24 ore. Il nostro laboratorio ha utilizzato questo protocollo per studiare molti degli aspetti temporali della esocitosi non-litica e continuerà ad utilizzare la microscopia in tempo reale per accertare le componenti morfologiche che circondano questo processo.
Per questa tecnica per produrre risultati ottimali, particolare attenzione deve essere data ad alcuni passaggi del protocollo. La densità delle cellule che viene placcato la sera prima è importante perché troppe cellule in grado di creare un film che non è utilizzabile in quanto la visione del movimento e le interazioni di singole cellule è ostacolato, mentre troppo poche cellule possono produrre dati che non è significativo. L'obiettivo è quello di raggiungere un campo uniformemente spaziate di macrofagi tali che i singoli macrofagi possono essere seguiti per tutta la durata del periodo di infezione. In quella stessa vena, lavando via il extracellulare Cn è un passaggio fondamentale come exextracellulare Cn dividerà nel tempo che potrebbe oscurare il campo e portare a una perdita di visibilità dei macrofagi. A seconda della lunghezza del film, il telaio può spostare fuori fuoco che rende le immagini inutilizzabili per studiare e pertanto necessita la registrazione da verificare in vari punti durante l'infezione.
Come indicato, ci sono vari modi questa tecnica può essere modificato per adattarsi entro i parametri di altri esperimenti. Molti coloranti fluorescenti e marcatori diversi possono essere utilizzati per evidenziare le dinamiche di membrana e phagosomal ma bisogna essere cauti di foto sbiancamento e l'effetto che può avere sul benessere delle cellule. Una varietà di tipi di cellule può essere utilizzato anche come J774.1 macrofagi come cellule, monociti o amebe in combinazione con altri ceppi fungini per studiare le differenze che possono verificarsi. Ti consigliamo di utilizzare un obiettivo di 10 volte perché i nostri esperimenti richiedono la raccolta di dati di una grande quantità di cellule, ma si potrebbe usare un più altoobiettivo di studiare solo poche cellule. Il momento che ogni immagine è presa può essere regolato. Assunzione di una immagine ogni 4 min per 24 ore produce un film che scorre circa 1 minuto di lunghezza, quando sono stati compressi tutti i fotogrammi. Aumentare o aspetto (la durata di infezione o il tempo tra i fotogrammi) aumenta la quantità di file che devono essere memorizzati che possono essere un problema per alcuni laboratori.
Esocitosi non-litico è un processo incredibilmente dinamico che avviene rapidamente ed a vari intervalli di tempo durante l'infezione. Quindi, cercando di catturare i macrofagi sottoposti a questa interazione con altri metodi come la microscopia elettronica a scansione e trasmissione può essere estremamente rara. A causa della natura di come campioni vengono fissati ed elaborati, non si può essere certi che ciò che viene visualizzato è definitivamente esocitosi non-litici contro altri processi cellulari come la lisi o apoptosi. Inoltre, un segno distintivo di esocitosi non-litica è che ospite e patogeno rimangono via bile dopo che è qualcosa che non può essere dedotta da immagini fisse, poiché questi metodi possono produrre solo istantanee di un processo in un dato momento.
Anche se questo protocollo può fornire innumerevoli immagini di processi cellulari, ci sono alcune limitazioni nell'uso di questa tecnica per studiare le interazioni patogeno ospite. L'obiettivo partire usiamo studiare una grande quantità di macrofagi contemporaneamente non consente un'immagine risoluzione sufficiente per visualizzare l'interazione tra il fagosoma e la membrana cellulare, che non è un aspetto ben compreso di esocitosi non-litico. Una volta che sono state registrate tutte le immagini, l'analisi post delle seguenti molti macrofagi può essere molto noioso e richiede tempo. I macrofagi, anche quelli aderito al vetro, può essere molto mobili e si sposta dentro e fuori della cornice molto rapidamente. Questo può rendere difficile seguire i singoli macrofagi, dall'inizio alla fine, in particolare quelli che sono vicino alla periferia del telaio.
jove_content "> Nonostante questi limiti, questo è il protocollo può essere utilizzato in una varietà di modi per studiare i molteplici aspetti delle interazioni ospite-patogeno.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano che non abbiamo interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal NIH premi 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
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