Summary
Vi beskriver, hvordan man kan visualisere macrophage- C. neoformans (cn) interaktioner i realtid, med særlig vægt på processen ikke-lytisk exocytose hjælp af digital lysmikroskopi. Brug af denne teknik individuelt inficerede makrofager kan undersøges for at fastslå forskellige aspekter af dette fænomen.
Abstract
Mange aspekter af infektion af makrofager af Cryptococcus neoformans er blevet grundigt undersøgt og veldefineret. Men en særlig interaktion, der ikke er klart forstået er non-lytisk exocytose. I denne proces er gærceller frigives i det ekstracellulære rum ved en dårligt forstået mekanisme, der lader både makrofager og Cn levedygtige. Her beskriver vi, hvordan at følge et stort antal individuelt inficerede makrofager til en 24 timers infektion periode ved tidsforkortet mikroskopi. Inficerede makrofager er opstaldet i et varmekammer med en CO2-atmosfære fastgjort til et mikroskop, der giver de samme betingelser som en celle-kultur kuvøse. Levende digital mikroskopi kan give oplysninger om den dynamiske interaktion mellem vært og patogen, der ikke er tilgængelig fra statiske billeder. At være i stand til at visualisere hver inficeret celle kan give et fingerpeg om, hvordan makrofager håndtere svampeinfektioner, og omvendt. Denne teknik ISA kraftfuldt værktøj i at studere den dynamik, der ligger bag et komplekst fænomen.
Introduction
De faser af en svampeinfektion mellem kryptokok celler og makrofager er veldokumenterede 1-3. Efter gærceller indtages af makrofager, kan en række interaktioner forekomme: makrofag kan lysere frigiver sin fungal belastning i det ekstracellulære rum, eller det kan kontrollere infektionen ved at holde gærcellerne inden for rammerne af dens cellulære membran 4. Men for flere år siden en ny resultat blev beskrevet uafhængigt af to grupper: ikke-lytisk exocytose, en proces, hvor en makrofag slettet nogle af eller alle de kryptokok celler i det omgivende miljø eller en nabocelle og både vært og patogen forblive rentable 5 -8. Flere undersøgelser har forsøgt at forstå de molekylære mekanismer bag denne interaktion, men vi har stadig ikke en fuld forståelse af, hvad der driver dette fænomen.
Evnen til at fange billeder i realtid og efterfølgende analysere flere inficereed makrofager tillader en at besvare mange spørgsmål om de fysiske egenskaber omkring ikke-lytisk exocytose i forhold til timing, fysisk kapacitet, ændringer i morfologi og endda stress af makrofager i løbet af en svampeinfektion. Ved at tillade cellerne, der skal anbringes i et miljø, der er sammenlignelig med en inkubator, kan vi glimt den dynamiske karakter af makrofag-fungal celle interaktioner. Forskere har anvendt denne teknik til at undersøge forskellige komponenter i denne proces. Rolle fagosomet i denne proces blev gjort synlige med fluorescerende farvning og actin blokerende midler 9, mens en anden gruppe brugt denne metode til at vise, at ikke-lytisk exocytose blev blokeret i celler, der har haft WASH kernedannende proteindomæner slettet 10. Virkningen af cytokin signalering er også blevet konstateret ved hjælp af real-tid mikroskopi 11. Denne proces er ikke begrænset til C. neoformans som det er også blevet observeret med Candida albicans, another fungale patogen, der har evnen til at inficere makrofager 12. Disse resultater er eksempler på, hvordan denne metode kan give et væld af oplysninger til et område, vi ved så lidt om.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr blev arbejdet i overensstemmelse med reglerne og retningslinjerne for Institute for Animal Studies på Albert Einstein College of Medicine.
1. Vækst Betingelser C. neoformans H99 (serotype A)
- Grow individuel C. neoformans (cn) kolonier på Sabouraud agarplader.
- En dag før eksperimentet, skal du vælge en koloni og pode 10 ml Sabouraud bouillon.
- Tillad kulturen at vokse natten over ved 37 ° C under omrystning ved en hastighed på 250 rpm.
2. Isolering og Udarbejdelse af primær Bone makrofager fra C57 / BL6 Mus
- Aflive mus ved at anbringe dyret i en CO2-kammer, indtil der ikke længere vejrtrækning. Som en anden foranstaltning, cervically forskubbe halsen, før du begynder dissektion. Sterilisere hele kroppen med 70% ethanol.
- Fjern begge lårben og skinneben og sted knogler i steril DMEM.
- Fjern overskydende væv og muskler ved hjælp af deeksemplarer klude indtil knoglerne er helt rene.
- Placer kun intakte knogler i en petriskål indeholdende 70% ethanol og inkuberes i 3 minutter for at dræbe associerede mikroorganismer. Fjern knogler og sted i petriskål med steril DMEM.
- Skær forsigtigt enderne af knogler. Hold ben over en tom 50 ml konisk rør på is og skylles forsigtigt 10 ml kold DMEM under anvendelse af en 25 G nål gennem hvert ben.
BEMÆRK: Hver mus vil give 4 ben (2 lårben, 2 skinneben). En mus Derfor bør give cirka 40 ml cellesuspension. - Centrifuger cellesuspension ved stuetemperatur i 10 minutter ved 650 x g.
- I løbet af denne centrifugering, forberede og filteret steriliseres knoglemarv makrofag indføring af medier, der består af DMEM suppleret med 20% L929, 10% føtalt kalveserum, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-glutamin , 1% ikke-essentielle aminosyrer, 0,1% 2-mercaptoethanol.
- Resuspender resulterende pellet med 10 ml indføring af medier. Pass celle suspension gennem en 70 um cellefilter at forstyrre celleklumper og fjerne stort affald.
- Plade 1 ml cellesuspension i 10 ml indføring af medier i petriskåle, der er angivet til brug vævskultur (i alt 10 plader).
- Tillad celler til at klæbe ved 37 ° C med 10% CO2. Der tilsættes 5 ml frisk fodring medier på dag 3. På dag 7 helt erstatte fodring medier og makrofager er klar til at blive brugt.
- Dagen før eksperimentet frigøre makrofager fra pladen ved at fjerne fodring medier og tilsæt 5 ml af en blid celle stripping reagens til pladen.
- Inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C og fjerne makrofager med forsigtig pipettering.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 650 xg i 10 min.
- Resuspender pellet i 1 ml indføring af medier. Ved hjælp af en fortyndet 1:20, beregne koncentrationen af makrofager ved pipettering 10 pi cellesuspension på en hæmocytometer.
- Brug 14 mm glas bund petriskåle, Plate enkoncentration på 1 x 10 5 makrofager direkte på den indre såvel som besidder et maksimum på 200 ul, så tage forsigtighed for ikke at overskride denne mængde, som vist i figur 4.
- Lad cellerne til at klæbe til glasset petriskålen ved at placere skålene i en 37 ° C inkubator i 1 time.
- Tilføj 1-2 ml indføring af medier suppleret med LPS ved 1 mg / ml og IFNg ved 500 u / ml og tillader celler at inkubere natten over.
3. Co-inkubation af primær murine makrofager og C. neoformans
- På dagen for eksperimentet, fjerne 1 ml natten podede kultur og pille gærceller ved centrifugering i 5 minutter ved 420 x g.
- Vask cellerne 3 gange med sterilt PBS for at fjerne medier og ekstracellulære kryptokok produkter som polysaccharid glucuronoxylomannan (GXM) ved den hastighed og tid nævnt ovenfor.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml sterilt PBS og gøre en 1: 100 fortynding. Afpipetteres 10 ul than fortynding på et hæmocytometer og tælle celler. Tilføj gærceller ved en MOI på 1: 5. For eksempel, hvis der er 1 x 10 5 makrofager / brønd, lave en celle suspension af 5 x 10 6 / ml CN og tilsættes 100 ul af denne opløsning til et samlet beløb på 5 x 10 5 KN.
- Tilføj beregnede mængde cryptococcal cellesuspension til 1 ml fodring medier med mAb 18B7 antistof ved en koncentration på 10 mg / ml. Inkuber cellesuspension ved stuetemperatur i 5 min.
- Fjern indføring af medier fra glas bund petriskål og vask 1x med sterilt PBS. Tilsæt 100 ul opsoniseret Cn direkte til godt.
- Tillad celler at inkubere i 2 timer ved 37 ° C med 10% CO2.
- Efter co-inkubation kontrolleres ved mikroskop, at makrofager har internaliseret KN. For at blive betragtet internaliseret, bør kryptokok celler tydeligt ses inden for rammerne af makrofager.
- Vask petriskål 3x med sterilt PBS for at fjerne ethvert extracellular Cn.
- Tilføj 1-2 ml indføring af medier uden tilsætning af mAb 18B7 og etablere mikroskop.
4. Visualisering Ikke-lytiske exocytose i Real-time hjælp Digital Light Microscopy
BEMÆRK: For at udføre disse eksperimenter, et mikroskop, der kommer med en vedhæftet inkubere kammer, der omfatter CO 2 levering og en varmeenhed er påkrævet.
- Forud for forsøget, præ-varme inkubere kammer i mindst 30 minutter til 37 ° C. Kontroller, at CO 2 læser enheden 5% ved forsøgets start.
- Placer glas bund petriskål på mikroskop platform, dæk med CO 2 låg, og luk alle døre for at sikre, at ingen varme undslipper.
- Brug af 10X objektiv med mikroskopet i fasekontrast, fokusere på et klart område af inficerede makrofager. Baseret på forsøg, fastlægge mål anvendes af hvor mange makrofager skal undersøges.
- Opsæt mikroskop software til at take et billede hver 4 min i en 24 timers periode.
- Efter 24 timer, vil forsøget har nået færdiggørelse og i alt 361 billeder vil være blevet indsamlet. Eksportere disse billeder som .jpegs på et 5% komprimering. Brug Billede J software, se billeder som en visuel Stak på 5 billeder pr sek. Hvis filmen skal ses til offentliggørelse eller en præsentation, skal du gemme det som enten en .avi eller .mov fil, afhængigt af hvilket format der fungerer bedst for beskueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De billeder, at denne teknik producerer kan analyseres i en række forskellige måder at indsamle information omkring hvad der sker efter cellerne er fagocyteret C. neoformans. Som det ses i figur 1, er der cirka 100 makrofager, som er enten inficerede eller ikke-inficerede. Hver af disse makrofager giver seeren mulighed for at studere værtspatogene interaktioner på en meget mikroskopisk niveau. Som figurerne 2 og 3 viser, er der forskellige resultater, der kan opstå mellem en makrofag og gærcelle, og selv mellem makrofag-makrofag. Makrofager kan scores som undergår ikke-lytisk exocytose, celle-celle-overførsel, eller enhver anden cellulær proces, der kan forekomme. Timingen af sådanne arrangementer i løbet af infektion kan også konstateres på grundlag af de parametre, der er indstillet, når filmen bliver optaget.
Figur 1:. Field of Infected Makrofager Denne figur viser et helt felt af individuelt inficerede makrofager ved starten af en 24 timers infektion periode. Det skal bemærkes, at området er fri for ekstracellulær Cn og endnu vigtigere, hvor klart det er som makrofager inficeret (som indikeret ved en stor pilespids), og som ikke indeholder fungale celler (som angivet ved en lille pil). Målestokken repræsenterer 50 um.
Movie 1 : Visualisering af Macrophage- C. neoformans 24 timers infektionsperioden. Den oprindelige billede i filmen viser mange makrofager i hele området med nogle, som er inficerede, og nogle, der har fagocyteret varierende mængder af kryptokok celler. Som filmen skrider frem, ar cellernee alle bevægelige og kan ses bevæge sig omkring banen. Vi er i stand til at følge hver af disse makrofager at se, hvad slags cellulær proces, de gennemgår.
Figur 2:. Primær Murint Macrophage foretaget en ikke-lytisk exocytose En inficeret makrofag (Panel A, angives med en hvid pilespids) ses undergår begyndelsen stadier af ikke-lytisk exocytose. Fagosomet begynder at forstørre (panel f.Kr.) og svampens belastning begynder at skifte. Adskillige Cn celler udsættes derefter i det ekstracellulære rum som det kan ses i paneler DE. En anden inficeret makrofag i panel F, angivet med en hvid pilespids, undergår også en ikke-lytisk exocytose begivenhed (Panel GH). Ved slutningen af processen, er begge makrofager tomt (Panel I) som vist med de hvide pile. Målestokken repræsenterer 25 um.
Movie 2 :. Visualizing Primær Murint Macrophage foretaget en ikke-lytisk exocytose I denne film er det klart, at de kryptokok celler er inden for rammerne af en inficeret makrofag. Makrofagen bliver ophidsede og en gærcelle kan ses spirende inden fagosomet. Cryptococcal celler derefter hurtigt slettet i det omgivende miljø. En anden inficeret makrofag undergår ikke-lytisk exocytose og flere gærceller frigives i det ekstracellulære rum. Værtscellerne forblive levedygtig efter cryptococcal exocytose som indikeret ved deres evne til at fortsætte med at flytte.
Figur 3:. Primær Murint Macrophage Er under celle-celle Transfer anden procESS, der kan fanges ved hjælp af denne protokol er celle-celle overførsel, som opstår, når kryptokok celler overføres fra et makrofag til en nærliggende makrofag. To inficerede makrofager er i tæt nærhed af hinanden angivet med hvide pile (panel A) og endnu tættere at indlede celle-celle-overførsel (panel B). En celle-celle-bro angivet ved de røde pilespidser er dannet mellem de to makrofager således at kryptokok cellerne ikke er udsat for det omgivende miljø under overførslen (panel C og E). Når overførslen er færdig, cellerne bryde væk (panel D, F). Målestokken repræsenterer 25 um.
Movie 3 :. Visualisere celle-celle Overførsel mellem inficeret Makrofager Den lejlighed, vil makrofager interagere på en sådan måde, der letter overførsel af cryptococcal celle mellem værtsceller. Gærcellerne ikke er udsattil det ekstracellulære miljø og værtscellerne forbliver levedygtige. I denne film, to inficerede makrofager skabe celle-celle broer på to separate lejligheder til shuttle kryptokok celler fra en makrofag til en anden.
Figur 4: Skematisk fremstilling af celler viser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken svampe-makrofag interaktioner kan registreres og analyseres i realtid over en 24 timers periode. Vores laboratorium har anvendt denne protokol til at studere mange af de tidsmæssige aspekter af ikke-lytisk exocytose og vil fortsætte med at bruge realtid mikroskopi at fastslå de morfologiske elementer, der omgiver denne proces.
Til denne teknik til at give ideelle resultater, bør man være særlig opmærksom på visse trin i protokollen. Celledensiteten der er belagt natten før er vigtigt, fordi alt for mange celler kan oprette en film, der ikke er anvendeligt som visning af bevægelser og interaktioner af de enkelte celler hæmmes, mens for få celler kan give oplysninger, der ikke er signifikant. Målet er at opnå en jævnt fordelt inden for makrofager således at enkelte makrofager kan følges for varigheden af infektionen periode. I samme ånd, vaske væk ekstracellulære CN er et afgørende skridt som tidligeretracellular Cn vil splitte over tid, som kunne skjule feltet og føre til et tab af synlighed makrofager. Afhængigt af længden af filmen, kan rammen flytte ud af fokus, hvilket gør billederne ubrugelige til at studere, og derfor har brug for optagelsen, der skal kontrolleres på forskellige tidspunkter i løbet af infektionen.
Som beskrevet, er der forskellige måder denne teknik kan ændres til at passe inden for parametrene for andre eksperimenter. Mange forskellige fluorescerende farvestoffer og markører kan bruges til at fremhæve membran og phagosomal dynamik, men man skal være forsigtig med foto blegning og påvirke denne kan have på egnethed af cellerne. Kan også anvendes, såsom en række forskellige celletyper J774.1 makrofag-lignende celler, monocytter eller amøber i sammenhæng med andre svampestammer at undersøge de forskelle, der kan forekomme. Vi foreslår at bruge et mål på 10X, fordi vores eksperimenter kræver indsamling af data af en stor mængde celler, men man kunne bruge en højereformål at studere nogle få celler. Timingen at hvert billede er taget, kan også justeres. Under et billede hver 4 min i 24 timer giver en film, der løber omtrent 1 minut i længde, når alle rammer er blevet komprimeret. Forøgelse enten aspekt (varigheden af infektion eller tiden mellem rammer) øger mængden af filer, der behøver at blive gemt, som kan være et problem for nogle laboratorier.
Ikke-lytiske eksocytose er en utrolig dynamisk proces, som sker hurtigt og ved forskellige tidsintervaller under infektion. Derfor kan prøver at fange makrofager gennemgår denne interaktion ved hjælp af andre metoder, såsom transmission og scanningselektronmikroskopi være yderst sjældne. På grund af arten af, hvordan prøver fikseret og behandlet, kan man ikke være sikker på, at hvad der ses på endeligt ikke-lytiske exocytose versus andre cellulære processer, såsom lyse eller apoptose. Også et adelsmærke for ikke-lytisk exocytose er, at vært og patogen forblive via ble bagefter hvilket er noget, som ikke kan udledes af faste billeder, da disse metoder kun kan producere snapshots af en proces på et givet tidspunkt.
Selv om denne protokol kan give utallige billeder af cellulære processer, der er nogle begrænsninger i at bruge denne teknik til at studere vært patogen interaktioner. Den lave mål, som vi bruger til at studere en stor mængde af makrofager på én gang giver ikke mulighed for en tilstrækkelig høj opløsning billede at visualisere samspillet mellem fagosomet og cellemembranen, hvilket ikke er et godt forstået aspekt af ikke-lytisk exocytose. Når alle billederne er blevet registreret, kan post-analyse af følgende mange makrofager være meget trættende og tidskrævende. Makrofager, selv dem klæbet til glas, kan være meget bevægelig, og vil bevæge sig ind og ud af rammen meget hurtigt. Dette kan gøre det vanskeligt at følge de enkelte makrofager fra start til slut, især dem, der er i nærheden af periferien af rammen.
jove_content "> trods af disse begrænsninger, er protokol kan anvendes i en række forskellige måder at studere de mange forskellige aspekter af værtspatogene interaktioner.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at vi ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet delvist af NIH Awards 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
