Summary
Wir beschreiben, wie Makrophagen C. visualisieren neoformans (Cn) Interaktionen in Echtzeit, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Prozess der nicht-lytischen Exozytose mit digitalen Lichtmikroskopie. Unter Verwendung dieser Technik einzeln infizierten Makrophagen untersucht, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens festzustellen ist.
Abstract
Viele Aspekte der Infektion von Makrophagen durch Cryptococcus neoformans wurden ausgiebig untersucht und gut definiert. Jedoch eine bestimmte Interaktion, die nicht klar verstanden wird, ist nicht-lytischen Exozytose. In diesem Verfahren werden Hefezellen in den extrazellulären Raum durch eine schlecht verstandenen Mechanismus, der sowohl die Makrophagen und Cn lebensfähigen Blätter freigegeben. Hier beschreiben wir, wie man eine große Anzahl von infizierten Makrophagen individuell für eine 24-Stunden-Infektionsperiode von Zeitraffer-Mikroskopie zu folgen. Infizierten Makrophagen werden in einer Wärmekammer mit einem CO 2 Atmosphäre in einem Mikroskop, die die gleichen Bedingungen wie einem Zellkulturbrutschrank bietet angebracht gebracht. Live digitalen Mikroskopie kann Informationen über die dynamischen Wechselwirkungen zwischen einem Wirt und Pathogen, die nicht von statischen Bildern ist. In der Lage, jede infizierte Zelle visualisieren können Hinweise darauf, wie Makrophagen behandeln Pilzinfektionen stellen, und umgekehrt. Diese Technik isa leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung der Dynamik, die hinter einem komplexen Phänomen sind.
Introduction
Die Phasen der Pilzinfektion zwischen Cryptococcus-Zellen und Makrophagen sind gut dokumentiert 1-3. Nach Hefezellen werden durch Makrophagen aufgenommen werden, kann eine Vielzahl von Wechselwirkungen auftreten: der Makrophagen kann lysieren Freigabe seiner Pilzbelastung in den extrazellulären Raum, oder es könnte die Infektion, indem die Hefe-Zellen innerhalb der Grenzen seiner zellulären Membran 4 zu steuern. Nichtlytischen Exozytose, ein Verfahren, bei dem ein Makrophage getilgt einige oder alle der Cryptococcus-Zellen in die Umgebung oder eine benachbarte Zelle, und beide Wirt und Pathogen lebensfähig bleiben 5: jedoch seit einigen Jahren ein neues Ergebnis wurde unabhängig durch zwei Gruppen beschrieben -8. Mehrere Studien haben versucht, die molekularen Mechanismen hinter dieser Interaktion zu verstehen, aber wir haben noch nicht über einen vollen Griff auf, was treibt dieses Phänomen.
Die Fähigkeit, Bilder in Echtzeit zu erfassen und anschließend analysieren mehrere infizierened Makrophagen ermöglicht es, viele Fragen zu den physikalischen Eigenschaften umliegenden nicht-lytischen Exozytose in Bezug auf Timing, Raumkapazität, Veränderung der Morphologie und auch Stress von Makrophagen während einer Pilzinfektion zu beantworten. Indem die Zellen in einer Umgebung, die vergleichbar mit der von einem Inkubator untergebracht ist, so können wir die dynamische Natur der Makrophagen-Pilzzelle Wechselwirkungen erblicken. Forscher haben diese Technik verwendet, um verschiedene Komponenten dieses Prozesses zu studieren. Die Rolle der Phagosom in diesem Prozess wurde deutlich gemacht mit Fluoreszenzfärbung und Aktin Blockern 9, während eine andere Gruppe verwendet diese Methode, um zu zeigen, dass nicht-lytischen Exozytose wurde in Zellen, die hatten die Waschkeimbildungsproteindomänen gelöscht 10 blockiert. Die Wirkung der Cytokine Signaling hat auch festgestellt worden mit Echtzeit-Mikroskopie 11. Dieses Verfahren ist nicht beschränkt auf C. neoformans, wie es auch mit Candida albicans beobachtet, another Pilzkrankheitserreger, der die Fähigkeit, Makrophagen 12 infizieren. Diese Ergebnisse sind Beispiele dafür, wie dieses Verfahren eine Fülle von Informationen zu einem Bereich, den wir wissen so wenig über ist.
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Protocol
Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institut für Tierwissenschaften an der Albert-Einstein-College of Medicine durchgeführt.
1. Wachstumsbedingungen von C. neoformans H99 (Serotyp A)
- Wachsen einzelne C. neoformans (Cn) Kolonien auf Sabouraud-Agar-Platten.
- Ein Tag vor dem Experiment, wählen Sie eine Kolonie und zu impfen 10 ml Sabouraud-Bouillon.
- Ermöglichen Kultur über Nacht bei 37 ° C wachsen bei einer Geschwindigkeit von 250 UpM schüttelnd.
2. Isolierung und Herstellung von primären Knochen Makrophagen aus C57 / Bl6 Mäuse
- Euthanize Mäuse indem Tier in einer CO 2-Kammer bis sie nicht mehr atmen. Als zweite Maßnahme, zervikal den Hals verrenken vor Beginn der Dissektion. Sterilisieren ganzen Körper mit 70% igem Alkohol.
- Entfernen Sie die beiden Oberschenkelknochen und Schienbein und Knochen statt in sterilen DMEM.
- Entfernen Sie überschüssiges Gewebe und Muskulatur mit desilicat wischt, bis Knochen sind absolut sauber.
- Legen Sie nur intakte Knochen in eine Petrischale mit 70% igem Alkohol und Inkubation für 3 min zu assoziierten Mikroorganismen abzutöten. Entfernen Sie Knochen und in Petrischale mit sterilem DMEM.
- Schneiden Sie vorsichtig die Enden der Knochen. Halten Knochen über eine leere 50 ml konischen Röhrchen auf Eis gestellt und vorsichtig bündig 10 ml kaltem DMEM mit einer 25 G-Nadel durch die einzelnen Knochen.
HINWEIS: Jede Maus wird 4 Knochen (2 Oberschenkelknochen, Schienbeinknochen 2) zu erhalten. Daher sollte man der Maus etwa 40 ml der Zellsuspension zu erhalten. - Zentrifuge Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 650 x g beträgt.
- Während dieser Zentrifugation vorbereiten und Filter sterilisieren Knochenmark-Makrophagen Zuführen Medien DMEM mit 20% L929, 10% fötales Kälberserum, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-Glutamin besteht , 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1% 2-Mercaptoethanol.
- Resuspendieren resultierende Pellet mit 10 ml Zuführen Medien. Geben Zelle suspensIonen durch eine 70 um Zell Sieb, um Zellklumpen zu stören und zu entfernen große Trümmer.
- Platte 1 ml der Zellsuspension in 10 ml Medium Zuführen in Petrischalen, die für die Gewebekultur Verwendung (für insgesamt 10 Platten) angegeben sind.
- Sodass die Zellen bei 37 ° C mit 10% CO 2 anhaften. 5 ml frisch Fütterung Medien am 3. Tag Am Tag 7, komplett ersetzen die Futter Medien und Makrophagen sind bereit, verwendet werden.
- Der Tag vor dem Experiment, nehmen Makrophagen aus Platte, indem Sie beim Einzug von Medien und fügen 5ml eines sanften Zelle Stripping Reagenz bis zum Teller.
- Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C und Makrophagen entfernen mit sanften Pipettieren.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 650 × g für 10 min.
- Pellet in 1 ml Zuführen Medien. Mit Hilfe eines 1:20 Verdünnung wird die Konzentration von Makrophagen durch Pipettieren von 10 ul Zellsuspension auf einer Hämocytometers.
- Mit 14 mm Glasboden Petrischalen, Teller einKonzentration von 1 x 10 5 Makrophagen direkt auf das innere Wohl die ein Maximum von 200 ul hält, so ist Vorsicht geboten, dieses Volumen nicht überschreiten, wie in Abbildung 4 dargestellt.
- Damit sich die Zellen an die Petrischale aus Glas, indem man das Geschirr in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde zu halten.
- 1-2 ml der Fütterung Medien mit LPS supplementiert mit 1 mg / ml IFNg und bei 500 U / ml und ermöglichen Zellen über Nacht inkubiert.
3. Co-Inkubation von primären murinen Makrophagen und C. neoformans
- Am Tag des Experiments zu entfernen 1 ml einer Übernachtkultur angeimpft und Pellet Hefezellen durch Zentrifugation für 5 min bei 420 x g beträgt.
- Waschen Sie die Zellen 3 mal mit sterilem PBS auf Medien und extrazellulären Cryptococcus Produkte wie das Polysaccharid glucuronoxylomannan (GXM) an der oben genannten Geschwindigkeit und Zeit zu entfernen.
- Resuspendieren Zellpellet in 1 ml sterilem PBS und eine 1: 100-Verdünnung. Je 10 ul ter Verdünnung auf einem Hämocytometers und zählen Zellen. Hinzufügen Hefezellen bei einer MOI von 1: 5. Zum Beispiel, wenn es 1 x 10 5 Makrophagen / gut, machen Sie eine Zellsuspension von 5 x 10 6 / ml Cn und 100 l dieser Lösung für einen Gesamtbetrag von 5 x 10 5 Cn.
- Hinzufügen des berechneten Volumens Cryptococcus Zellsuspension zu 1 ml Medium mit der Zuführung mAb 18B7-Antikörper in einer Konzentration von 10 ug / ml. Inkubieren Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 min.
- Fütterung entfernen Medien aus Glasboden Petrischale und waschen 1x mit sterilem PBS. 100 l opsonisiertes Cn direkt gut.
- Sodass die Zellen für 2 h bei 37 ° C mit 10% CO 2 inkubiert.
- Nach Co-Inkubation, überprüfen Sie mit dem Mikroskop, dass Makrophagen haben Cn verinnerlicht. Berücksichtigt internalisiert werden sollte Cryptococcus-Zellen deutlich innerhalb der Grenzen des Makrophagen ersichtlich.
- Waschpetrischale 3x mit sterilem PBS auf jegliche extracellula entfernenR Cn.
- 1-2 ml der Fütterung Medien ohne Zugabe von mAb 18B7 und Einrichten Mikroskop.
4. Visualisierung nichtlytischen Exocytosis in Echtzeit mittels digitaler Lichtmikroskopie
HINWEIS: Um diese Experimente durchführen, ein Mikroskop, das mit einem angehängten Brutraum, die CO 2 Lieferung und ein Heizungseinheit erforderlich beinhaltet kommt.
- Vor dem Experiment, vorwärmen die Inkubationskammer für mindestens 30 min auf 37 ° C. Sicherzustellen, dass die CO 2-Einheit liest 5% zu Beginn des Experiments.
- Ort Glasboden Petrischale auf Mikroskop-Plattform, Deckel mit CO 2 Deckel, und schließen Sie alle Türen, keine Wärme entweicht gewährleisten.
- Verwendung der 10X-Objektiv mit dem Mikroskop im Phasenkontrast, sich auf eine klare Bereich der infizierten Makrophagen. Bezogen auf das Experiment, das Ziel zu bestimmen, wie viele Makrophagen untersucht werden müssen, verwendet.
- Einrichten Mikroskop-Software zu take eine Bild alle 4 Minuten für eine 24-Stunden-Zeitraum.
- Nach 24 Stunden wird das Experiment Abschluss erreicht haben und insgesamt 361 Bilder werden gesammelt worden sein. Exportieren Sie diese Bilder als .jpegs bei einer 5%-Kompression. Mit Image J Software, Bilder als visuelle Stapel bei 5 Bildern pro Sekunde. Wenn der Film braucht, um für die Veröffentlichung oder eine Präsentation zu sehen, speichern Sie sie entweder als AVI-oder MOV-Datei je nach dem Format am besten für den Betrachter.
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Representative Results
Die Bilder, die diese Technik kann in einer Vielzahl von Möglichkeiten, Informationen rund um das, was passiert, nachdem Zellen phagozytiert C. sammeln analysierende neoformans. Wie in Figur 1 zu sehen ist, gibt es etwa 100 Makrophagen, die entweder infiziert oder nicht infiziert sind. Jede dieser Makrophagen gibt dem Zuschauer die Möglichkeit, Wirt-Pathogen-Interaktionen auf einer mikroskopischen Ebene sehr zu studieren. Wie die Figuren 2 und 3 zeigen, gibt es unterschiedliche Ergebnisse, die zwischen einem Makrophagen und Hefezelle auftreten können, und sogar zwischen Makrophagen Makrophagen. Makrophagen können als zogen nichtlytischen Exozytose, Zell-Zell-Übertragung oder andere zelluläre Prozess die auftreten können, erzielt werden. Der Zeitpunkt dieser Ereignisse während der Infektion kann auch basierend auf den Parametern, die eingestellt werden, wenn der Film aufgenommen wird festgestellt werden.
Abbildung 1:. Feld Infizierte Makrophagen Diese Abbildung zeigt einen ganzen Bereich der individuell infizierten Makrophagen zu Beginn einer 24-Stunden-Infektionsperiode. Es ist zu beachten, dass das Feld ist frei von extrazellulären Cn werden und noch wichtiger, wie klar es ist, die Makrophagen infiziert sind (wie von einer großen Pfeilspitze angedeutet) und welche enthalten keine Pilzzellen (wie durch einen kleinen Pfeil gekennzeichnet). Maßstab entspricht 50 um.
Film 1 : Visualisierung der Makrophagen-C neoformans 24 h Infektionsdauer. Die anfängliche Bild des Films zeigt viele Makrophagen im gesamten Feld mit einige, die nicht infizierten sind und einige, die unterschiedliche Mengen von Cryptococcus-Zellen phagozytiert haben. Als der Film fortschreitet, werden die Zellen are alle beweglichen und gesehen werden kann über das Feld bewegen. Wir sind in der Lage, jede dieser Makrophagen folgen, um zu sehen, welche Art von zellulären Prozess, den sie durchlaufen.
Abbildung 2:. Primären murinen Makrophagen durchmacht nichtlytischen Exocytosis Eine infizierte Makrophagen (Panel A, von einem weißen Pfeilspitze angedeutet) ist zu sehen, unterziehen die Anfangsphase der nicht-lytischen Exozytose. Das Phagosom beginnt zu vergrößern (Panel BC) und die Pilzbelastung beginnt sich zu verschieben. Mehrere Cn Zellen werden dann in den extrazellulären Raum freigesetzt, wie sie in der DE-Panels gesehen werden. Eine zweite infizierten Makrophagen Panel F, von einem weißen Pfeilspitze angegeben ist, erfährt auch eine nicht-lytische Exozytose-Ereignis (Steuerung GH). Am Ende des Prozesses werden die beiden Makrophagen leer gelassen (Panel I) wie durch die weißen Pfeilspitzen gezeigt. Maßstab repräsentiert 25 um.
Movie 2 :. Visualisierung primären murinen Makrophagen durchmacht nichtlytischen Exocytosis In diesem Film ist es klar, dass die Cryptococcus-Zellen sind innerhalb der Grenzen einer infizierten Makrophagen. Der Makrophage wird aufgeregt und eine Hefezelle ist zu sehen, in der angehende Phagosom. Cryptococcus-Zellen werden dann schnell in die Umgebung ausgelöscht. Eine zweite infizierte Makrophagen erfährt nichtlytischen Exozytose und mehr Hefezellen werden in den extrazellulären Raum freigesetzt. Die Wirtszellen lebensfähig nach Cryptococcus Exozytose bleiben, wie durch ihre Fähigkeit, sich weiter zu bewegen angegeben.
Abbildung 3:. Primären murinen Makrophagen durchmacht Zell-Zell-Überweisung weiterer process, die mit diesem Protokoll erfasst werden kann, ist Zell-Zell-Transfer, die bei Cryptococcus-Zellen werden von einem Makrophagen zu einer benachbarten Makrophagen übertragen auftritt. Zwei infizierte Makrophagen sind in unmittelbarer Nähe zu einander durch weißen Pfeilspitzen (Teil A) angegeben und bewegen sich noch näher an Zell-Zell-Transfer (Feld B) zu initiieren. Ein durch die roten Pfeile angegebenen Zell-Zell-Brücke zwischen den beiden, so daß die Makrophagen Cryptococcus Zellen nicht an die Umgebung während der Übertragung (Tafel C, E) freiliegen. Nachdem die Übertragung abgeschlossen ist, werden die Zellen brechen (Teil D, F). Maßstab repräsentiert 25 um.
Film 3 :. Visualisierung Zell-Zell-Übertragung zwischen infizierten Makrophagen Gelegentlich wird Makrophagen in einer Weise, die Übertragung von Cryptococcus-Zellen zwischen Wirtszellen erleichtert interagieren. Die Hefezellen werden nicht exponiertan die extrazelluläre Umgebung und den Wirtszellen lebensfähig bleiben. In diesem Film zwei infizierten Makrophagen zu erstellen Zell-Zell-Brücken bei zwei verschiedenen Gelegenheiten Shuttle Cryptococcus Zellen von einem Makrophagen zu einem anderen.
Abbildung 4: schematische Darstellung, Vorbereitung von Zellen.
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Discussion
Hier haben wir eine Methode, mit der Pilz-Makrophagen-Interaktionen können aufgezeichnet und in Echtzeit über einen 24-Stunden-Zeitraum analysiert werden beschrieben. Unser Labor hat dieses Protokoll verwendet, um viele der zeitlichen Aspekte des nicht-lytischen Exozytose zu studieren und wird auch weiterhin in Echtzeit-Mikroskopie zu verwenden, um die morphologischen Komponenten, die diesen Prozess umgeben ermitteln.
Für diese Technik, um optimale Ergebnisse zu erhalten, sollte besonderes Augenmerk auf bestimmte Schritte im Protokoll gegeben werden. Die Zelldichte, die in der Nacht zuvor plattiert ist, ist wichtig, weil zu viele Zellen einen Film, der nicht nutzbar ist, wie die Betrachtung der Bewegung und Wechselwirkungen von einzelnen Zellen behindert zu schaffen, während zu wenig Zellen können Daten, die nicht signifikant nachgeben. Das Ziel ist es, ein gleichmäßig beabstandeten Bereich der Makrophagen, so daß einzelne Makrophagen kann für die Dauer der Infektion Periode folgen erzielen. Im gleichen Vene, Waschen entfernt die extrazelluläre Cn ist ein entscheidender Schritt für die Ex-zellulären Cn wird mit der Zeit, die das Feld zu verdunkeln und zu einem Verlust der Sichtbarkeit der Makrophagen konnte teilen. Abhängig von der Länge des Films kann der Rahmen außerhalb des Fokus die Bilder unbrauchbar zu studieren und daher zu verschiedenen Zeitpunkten während der Infektion überprüft werden muss, die Aufzeichnung verschieben.
Wie beschrieben, gibt es verschiedene Möglichkeiten, diese Technik kann modifiziert werden, um innerhalb der Parameter der anderen Experimente zu passen. Viele verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe und Marker können verwendet werden, um Membran und phagosomalen Dynamik hervorheben, aber man sollte vorsichtig sein und Foto Bleich die Auswirkungen dieser auf die Fitness der Zellen haben können. Eine Reihe von Zelltypen kann als J774.1 Makrophagen-ähnlichen Zellen, Monozyten oder Amöben in Zusammenhang mit anderen Pilzstämme verwendet, so werden die Differenzen, die auftreten, zu untersuchen. Wir empfehlen die Verwendung eines Ziels von 10X, weil unsere Experimente erfordern die Datenerfassung von einer großen Menge von Zellen, jedoch eine höhere verwendenZiel um nur ein paar Zellen zu studieren. Das Timing, das jedes Bild aufgenommen wird ebenfalls eingestellt werden. Aufnehmen eines Bildes alle 4 min für 24 Stunden ergibt einen Film, der in etwa 1 Minute läuft in der Länge, wenn alle Frames komprimiert wurden. Erhöhen der Aspekte (die Dauer der Infektion oder die Zeit zwischen Frames) erhöht sich die Menge von Dateien, die gespeichert werden müssen, die ein Problem für einige Laboratorien sein können.
Nichtlytischen Exocytose ist ein unglaublich dynamischer Prozess, der während der Infektion rasch und in verschiedenen Zeitintervallen erfolgt. Daher versucht Makrophagen unterziehen diese Interaktion mit anderen Methoden, wie Übertragung und Rasterelektronenmikroskopie erfassen kann extrem selten sein. Aufgrund der Art, wie Proben werden fixiert und verarbeitet, kann man nicht sicher, daß das, was gesehen wird definitiv nicht-lytischen Exozytose gegenüber anderen zellulären Prozessen wie Lyse oder Apoptose. Auch ein Markenzeichen der nichtlytischen Exozytose ist, dass Wirt und Pathogen über bleiben BLE danach die etwas, das nicht von festen Bildern abgeleitet werden, da diese Verfahren nur Momentaufnahmen eines Prozesses erzeugen zu einem bestimmten Zeitpunkt ist.
Während dieses Protokoll kann unzählige Bilder von zellulären Prozessen zu schaffen, gibt es einige Einschränkungen bei der Verwendung dieser Technik, um Host-Pathogen-Interaktionen zu studieren. Die niedrige Ziel wir verwenden, um eine große Menge an Makrophagen zu einer Zeit Studie nicht für eine hohe Bildauflösung erlaubt genug, um die Wechselwirkung zwischen der Phagosomen und der Zellmembran, die nicht sehr gut verstanden ist Aspekt nichtlytischen Exozytose zu visualisieren. Sobald alle Bilder aufgezeichnet wurden, kann die post-Analyse der nach vielen Makrophagen sehr mühsam und zeitaufwendig sein. Makrophagen, auch diejenigen, verklebt auf Glas, sehr beweglich sein und wird in und aus dem Rahmen sehr schnell zu bewegen. Dies kann es schwierig einzelnen Makrophagen von Anfang bis Ende, insbesondere diejenigen, die nahe der Peripherie des Rahmens zu folgen.
jove_content "> Trotz dieser Einschränkungen ist das Protokoll kann in einer Vielzahl von Möglichkeiten, die viele verschiedene Aspekte der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen verwendet werden.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass wir keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde zum Teil durch NIH Auszeichnungen 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
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