Summary
אנו מתארים כיצד לחזות ג macrophage- neoformans (CN) אינטראקציות בזמן אמת, עם דגש ספציפי על התהליך של exocytosis לא אלים באמצעות מיקרוסקופ אור דיגיטלית. שימוש בטכניקה זו באופן אינדיבידואלי מקרופאגים נגועים ניתן ללמוד לברר היבטים שונים של תופעה זו.
Abstract
היבטים של הזיהום של מקרופאגים ידי neoformans קריפטוקוקוס רבים נחקרו רבים ומוגדרים היטב. עם זאת, אינטראקציה מסוימת שאינו מובנת באופן ברור הוא exocytosis לא אלים. בתהליך זה, תאי שמרים משתחררים למרחב החוץ תאי על ידי מנגנון הבין היטב שמשאיר את שני מקרופאג וCn קיימא. כאן, אנו מתארים כיצד לעקוב מספר גדול של מקרופאגים נגועים בנפרד לתקופה זיהום 24 שעות על ידי מיקרוסקופ-פקע זמן. מקרופאגים נגועים הם שוכנו בתא חימום עם CO 2 אווירה מחוברת למיקרוסקופ המספק את אותם תנאים כמו חממת טכנולוגיה של תרבית התאים. מיקרוסקופיה דיגיטלית חי יכולה לספק מידע על האינטראקציות הדינמיות בין מארח ופתוגן שאינו זמין מתמונות סטטיות. יכולת לדמיין כל תא נגוע יכול לספק רמזים באשר לאופן מקרופאגים להתמודד זיהומים פטרייתיים, ולהיפך. אני טכניקה זוכלי רב עוצמה sa בלימוד הדינמיקה שנמצאות מאחורי תופעה מורכבת.
Introduction
השלבים של זיהום פטרייתי בין תאים ומקרופאגים cryptococcal מתועדים היטב 1-3. לאחר תאי שמרים הם מעובדים על ידי מקרופאגים, מגוון רחב של אינטראקציות עלול להתרחש: מקרופאג עשוי lyse שחרור העומס פטרייתי שלה לתוך מרחב החוץ תאי, או שזה יכול לשלוט בזיהום על ידי שמירה על תאי שמרים בתוך גבולות קרום התא שלו 4. עם זאת, לפני כמה שנות תוצאה חדשה שתוארה באופן עצמאי על ידי שתי קבוצות: exocytosis לא אלים, תהליך שבו מקרופאג נמחק כל תאי cryptococcal או לסביבה או תא השכן והן המארח והפתוגן להישאר קיימא 5 -8. מספר מחקרים ניסו להבין את המנגנונים המולקולריים מאחורי אינטראקציה זו, אך עדיין אין לנו הבנה מלאה על מה שמניע את התופעה הזאת.
היכולת ללכוד תמונות בזמן אמת ולאחר מכן לאחר מכן לנתח להדביק מרובהעורך מקרופאגים מאפשר לענות על שאלות רבות על התכונות הפיזיות המקיפות exocytosis לא אלים בכל הקשור לעיתוי, יכולת מרחבית, שינוי במורפולוגיה ואפילו לחץ של מקרופאגים בזיהום פטרייתי. ידי מתן אפשרות לתאים להיות שוכנו בסביבה שדומה לזו של חממה, אנו יכולים להציץ באופי הדינמי של אינטראקציות תא מקרופאג פטרייתי. חוקרים השתמשו בטכניקה זו כדי ללמוד מרכיבים שונים של תהליך זה. התפקיד של phagosome בתהליך זה נעשה לכאורה באמצעות מכתים הניאון ויקטינו סוכני חסימה 9, בעוד שקבוצה אחרת השתמשה בשיטה זו כדי להראות שexocytosis לא אלים נחסם בתאים שהיו WASH nucleating תחומים חלבון נמחק 10. ההשפעה של איתות ציטוקינים גם הובררה באמצעות מיקרוסקופ בזמן אמת 11. תהליך זה אינו מוגבל לג neoformans כפי שגם נצפה עם קנדידה אלביקנס, another פתוגן פטרייתי שיש לו את היכולת להדביק מקרופאגים 12. ממצאים אלה הם דוגמאות לאופן ששיטה זו יכולה לספק שפע של מידע לאזור שאנחנו יודעים כל כך מעט על.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה של בעלי החיים שנעשתה בהתאם לתקנות והנחיות של המכון לבעלי חי לימודים אלברט איינשטיין המכללה לרפואה.
1 תנאי גידול של ג neoformans H99 (סרוטיפ)
- לגדול ג פרט מושבות neoformans (CN) על צלחות אגר Sabouraud.
- יום אחד לפני הניסוי, לבחור מושבה אחת ולחסן 10 מ"ל של מרק Sabouraud.
- מאפשר לתרבות לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס רועדת במהירות של 250 סל"ד.
.2 בידוד והכנת יסודי עצם המקרופאגים מC57 / עכברים BL6
- להרדים עכברים ידי הצבת בעלי חיים בתא CO 2 עד אין נשימה ארוכה יותר. כצעד שני, cervically לנקוע את הצוואר לפני תחילת נתיחה. לעקר את כל גוף עם 70% אתיל אלכוהול.
- הסר את שני עצמות הירך ועצמות שוקה והמקום בDMEM סטרילי.
- הסרת רקמה עודפת ושרירים באמצעות דהlicate מגבונים עד עצמות הן נקיות לחלוטין.
- מניחים את עצמות רק בשלמותה בצלחת פטרי המכילה 70% אתיל אלכוהול ודגירה במשך 3 דקות כדי להרוג מיקרואורגניזמים הקשורים. הסר עצמות ומניחים בצלחת פטרי עם DMEM סטרילי.
- לחתוך בזהירות קצות עצמות. החזק עצם מעל צינור חרוטי 50 מ"ל ריק מונח על קרח ובזהירות סומק 10 מ"ל של DMEM הקר באמצעות מחט G 25 דרך כל עצם.
הערה: כל עכבר יניב 4 עצמות (2 עצמות ירך, 2 tibias). לכן עכבר אחד אמור להניב כ 40 מ"ל של השעיה תא. - השעיה תא צנטריפוגה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות ב 650 x גרם.
- במהלך צנטריפוגה זו, להכין ומסנן לעקר מקרופאג מח עצם האכלת תקשורת אשר מורכבת מDMEM בתוספת 20% L929, 10% עוברי עגל בסרום, 10% NCTC-109, 1% העט סטרפטוקוקוס, 1% HEPES, 1% L-גלוטמין , 1% חומצות אמינו לא חיוניות, 0.1% 2-mercaptoethanol.
- גלולה וכתוצאה Resuspend עם 10 מ"ל של האכלת תקשורת. Pass suspens תאיון דרך מסננת 70 מיקרומטר תא לשבש גושי תאים ולהסיר חלקי לכלוך גדול.
- צלחת 1 מ"ל של השעיה תא לתוך 10 מ"ל של תקשורת האכלה בצלחות פטרי שצוינו לשימוש בתרבית רקמה (עבור הסכום כולל של 10 צלחות).
- לאפשר לתאים לדבוק ב37 מעלות צלזיוס עם 10% CO 2. הוסף 5 מ"ל של תקשורת האכלה טריות ביום 3 ביום 7, להחליף לחלוטין את תקשורת ההאכלה ומקרופאגים הם מוכנים לשימוש.
- היום לפני הניסוי, לנתק מקרופאגים מצלחת על ידי הסרת תקשורת האכלה ולהוסיף 5 מ"ל של תא עדין הפשטה מגיב לצלחת.
- דגירה של 5-10 דקות ב37 מעלות צלזיוס ולהסיר מקרופאגים עם pipetting העדין.
- תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב650 XG עבור 10 דקות.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של האכלת תקשורת. באמצעות דילול 1:20, לחשב את הריכוז של מקרופאגים ידי pipetting 10 μl של השעיה תא על haemocytometer.
- שימוש בזכוכית מ"מ 14 תחתית צלחות פטרי, צלחתריכוז של 1 x 10 5 מקרופאגים ישירות על גבי היטב הפנימיים המחזיק מרבי של 200 μl, כך לקחת בזהירות כך שלא יחרוג כרך זה, כפי שמוצג באיור 4.
- אפשר התאים לדבוק בצלחת פטרי הזכוכית על ידי הצבת את הכלים ב37 מעלות צלזיוס חממה במשך שעה 1.
- להוסיף 1-2 מ"ל של האכלת תקשורת בתוספת LPS ב1 מ"ג / מ"ל וIFNg ב500 u / ml ולאפשר לתאי דגירה לילה.
.3 Co-דגירה של ראשוניים Murine המקרופאגים וג neoformans
- ביום של ניסוי, להסיר 1 מ"ל של תאי תרבות ושמרי גלולה מחוסן לילה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב420 x גרם.
- שטוף תאים 3 פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר תקשורת ומוצרי cryptococcal תאיים כמו glucuronoxylomannan פוליסכריד (GXM) במהירות ובזמן שהוזכר לעיל.
- גלולה תא הגלולה ב 1 מ"ל של PBS סטרילי ולעשות דילול 1: 100. פיפטה 10 μl של tהוא הדילול על haemocytometer ולספור תאים. הוספת תאי שמרים במשרד פנים של 1: 5. לדוגמא, אם יש 1 x 10 5 מקרופאגים / טוב, להפוך את ההשעיה תא של 5 x 10 6 / מ"ל של Cn ולהוסיף של פתרון זה 100 μl לסכום כולל של 5 x 10 5 Cn.
- הוספת נפח מחושב של השעיה תא cryptococcal עד 1 מ"ל של תקשורת האכלה עם נוגדן מב 18B7 בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה השעיה תא בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- הסירו תקשורת האכלה מזכוכית עם תחתית צלחת פטרי ולשטוף 1x עם PBS סטרילי. הוסף 100 μl של Cn opsonized ישירות לטוב.
- לאפשר לתאי דגירה לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס עם 10% CO 2.
- לאחר שיתוף דגירה, לבדוק על ידי מיקרוסקופ שמקרופאגים הפנימו Cn. כדי להיחשב הפנים, צריכים לראות בבירור תאי cryptococcal בתחומי מקרופאג.
- 3x צלחת פטרי לשטוף עם PBS סטרילי כדי להסיר כל וכל extracellular Cn.
- להוסיף 1-2 מ"ל של האכלת תקשורת ללא התוספת של מב 18B7, ומיקרוסקופ להגדיר.
Exocytosis .4 חזותי לא אלים בזמן אמת ניצול דיגיטלי אור מיקרוסקופית
הערה: כדי לבצע ניסויים אלה, מיקרוסקופ שמגיע עם תא דוגרים מצורף הכולל CO משלוח 2 והסקה נדרש.
- לפני הניסוי, מראש לחמם את החדר דוגרים במשך דקות לפחות 30 ל37 מעלות צלזיוס. ודא שיחידת CO 2 קוראת 5% בתחילת הניסוי.
- זכוכית מקום תחתית צלחת פטרי על פלטפורמת מיקרוסקופ, לכסות עם CO 2 מכסה, ולסגור את כל הדלתות כדי להבטיח שאין בריחות חום.
- באמצעות מטרת 10X עם מיקרוסקופ בניגוד שלב, להתמקד בתחום ברור של מקרופאגים הנגועים. בהתבסס על הניסוי, לקבוע את המטרה בשימוש על ידי כמה מקרופאגים צריכים להיחקר.
- הגדרת תוכנת מיקרוסקופ כדי taKe תמונה כל 4 דקות לתקופה 24 שעות.
- לאחר 24 שעות, הניסוי הגיע להשלמת פרויקט וכן סך של 361 תמונות יהיה כבר נאסף. לייצא את התמונות האלה כ.jpegs בדחיסת 5%. שימוש בתוכנת J תמונה, להציג תמונות כסטאק חזותי ב5 פריימים לשנייה. אם הסרט צריך להיות שנצפו לפרסום או הצגה, לשמור אותו כאחד .avi או .mov קובץ תלוי באיזה פורמט עובד הכי טוב עבור הצופה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התמונות שטכניקה זו מייצרת ניתן לנתח במגוון רחב של דרכים לאיסוף מידע המקיף את מה שקורה אחרי התאים phagocytosed ג neoformans. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם כ 100 מקרופאגים שהם או נגועים או נגוע. כל אחד ממקרופאגים אלה מעניק לצופה הזדמנות ללמוד אינטראקציות מאכסן לפתוגן ברמה מאוד מיקרוסקופית. כאיורי 2 ו -3 מופע, יש תוצאות שונות שיכול להתרחש בין תא מקרופאג ושמרים, ואפילו בין מקרופאג-macrophage. יכולים להיות הבקיע המקרופאגים כעוברים exocytosis לא אלים, העברת תאי תאים, או כל תהליך תאי אחר שעלולים להתרחש. התזמון של אירועים כאלה במהלך הזיהום יכול גם להיות הוברר מבוסס על הפרמטרים שנקבעים כאשר מוקלט הסרט.
איור 1:. שדה של המקרופאגים נגועים נתון זה מראה את כל שדה של מקרופאגים נגועים בנפרד בתחילת תקופת זיהום 24 שעות. יש לציין כי השדה הוא ללא Cn תאי ויותר מכך, עד כמה ברור הוא שמקרופאגים נגועים (כפי שצוינו על ידי ראש חץ גדול) ושאינם מכילים תאים פטרייתי (כפי שצוין על ידי חץ קטן). סרגל קנה מידה מייצג 50 מיקרומטר.
סרט 1: ויזואליזציה של Macrophage- ג neoformans 24 תקופת זיהום שעה. המסגרת הראשונית של הסרט מראה מקרופאגים רבים ברחבי השדה עם כמה שהם נגוע וכמה שphagocytized כמויות משתנות של תאי cryptococcal. כפי שהסרט מתקדם, התאים ar דואר כל ניע וניתן לראות מסתובבים בשטח. אנו מסוגלים לעקוב אחרי כל אחד ממקרופאגים אלה כדי לראות איזה סוג של תהליך תאי שהם עוברים.
איור 2:. Exocytosis הראשי Murine מקרופאג עובר ללא ממס מקרופאג נגוע (לוח א ', שצוין על ידי ראש חץ לבן) נראה שעבר את השלבים הראשונים של exocytosis לא אלים. Phagosome מתחיל להגדלה (BC פנל) ופטריות העומס מתחיל להשתנות. לאחר מכן תאי Cn כמה משתחררים למרחב תאי כפי שניתן לראות בלוחות DE. מקרופאג שני נגוע בלוח F, שצוין על ידי ראש חץ לבן, גם הוא עובר אירוע exocytosis לא אלים (לוח GH). בסופו של התהליך, גם מקרופאגים נותרים ריק (לוח I), כפי שמוצגים על ידי ראשי החץ הלבנים. סרגל קנה מידה מייצג 25 מיקרומטר.
ss = "jove_content"> סרט 2:. exocytosis החזותי הראשוני Murine מקרופאג עובר לא אלים בסרט הזה, ברור שתאי cryptococcal הם בתוך הגבולות של מקרופאג נגוע. מקרופאג הופך נסער ושמרי תא ניתן לראות ניצנים בתוך phagosome. לאחר מכן תאי cryptococcal הם נמחקו במהירות לסביבה. מקרופאג נגוע שני עובר exocytosis לא אלים ויותר תאי שמרים משתחררים למרחב החוץ תאי. תאי המארח להישאר קיימא לאחר exocytosis cryptococcal כפי שצוינו על ידי היכולת שלהם להמשיך לנוע.
איור 3:. העברת Cell-Cell ראשי Murine מקרופאג עובר proc נוסףess שאפשר לתפוס את השימוש בפרוטוקול זה הוא העברת תאי תאים אשר מתרחשת כאשר תאי cryptococcal מועברים ממקרופאג אחד למקרופאג השכן. שני מקרופאגים נגועים נמצאים בסמיכות זה לזה שצוין על ידי ראשי חץ לבנים (לוח א ') ולהעביר עוד יותר ליזום העברת תאי תאים (לוח ב'). גשר תאי תאים שצוין על ידי ראשי החץ האדומים נוצר בין שני מקרופאגים כך שתאי cryptococcal אינם חשופים לסביבה במהלך ההעברה (לוח C, E). לאחר שההעברה הושלמה, התאים להתנתק (לוח D, F). סרגל קנה מידה מייצג 25 מיקרומטר.
סרט 3:. חזותי Cell-Cell העברה בין המקרופאגים נגועים בהזדמנות, מקרופאגים יהיו אינטראקציה באופן כזה שמאפשר העברה של תא cryptococcal בין תאי מארח. תאי השמרים אינם נחשפיםלסביבה תאית ותאי המארח להישאר קיימא. בסרט הזה, שני מקרופאגים נגועים ליצור גשרי תאי תאים בשתי הזדמנויות נפרדות לתאי cryptococcal הסעות ממקרופאג אחד למשנהו.
איור 4: הכנה מראה סכמטי של תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן יש לנו תארנו שיטה שבאמצעותה ניתן להקליט אינטראקציות פטרייתי-macrophage ומנותח בזמן אמת על פני תקופה 24 שעות. המעבדה שלנו השתמשה בפרוטוקול זה כדי ללמוד רב של ההיבטים זמניים של exocytosis לא אלים ותמשיך להשתמש במיקרוסקופ בזמן אמת כדי לברר את הרכיבים מורפולוגיים המקיפים את התהליך הזה.
לטכניקה זו כדי להניב תוצאות אידיאליים, תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן לצעדים מסוימים בפרוטוקול. צפיפות התאים שמצופית בלילה שלפני חשובה כי תאים רבים מדי יכולים ליצור סרט שאינו שמיש כהצגה של התנועה ויחסי הגומלין של תאים בודדים מתעכבת, ואילו מעט מדי תאים עשויים להניב נתונים שאינו משמעותי. המטרה היא להשיג שדה מחולק באופן שווה של מקרופאגים כך שניתן בעקבות מקרופאגים פרט לאורכה של תקופת הזיהום. באותה רוח, שטיפת Cn תאי היא שלב קריטי כמו לשעברtracellular Cn יחלק לאורך זמן אשר יכול לטשטש את השדה ולהוביל לאובדן של נראות של מקרופאגים. בהתאם לאורכו של הסרט, המסגרת יכולה לעבור מחוץ לפוקוס מה שהופך את תמונות לבלתי שמישות ללמוד ולכן, ההקלטה צריכה להיבדק בנקודות שונות במהלך הזיהום.
כפי שתואר, יש דרכים שונות בטכניקה זו ניתן לשנות כך שתתאים לפרמטרים של ניסויים אחרים. צבעים רבים ושונים ניאון וסמנים יכולים לשמש כדי להדגיש דינמיקת קרום וphagosomal אבל צריך להיות זהיר של הלבנת תמונה ומשפיעים זה יכול להיות בכושר של התאים. גם מגוון רחב של סוגי תאים יכול לשמש כגון J774.1 כמו מקרופאג-תאים, מונוציטים או אמבות בשיתוף עם זני פטריות אחרים כדי ללמוד את ההבדלים שעלולים להתרחש. אנו מציעים להשתמש במטרת 10X כי הניסויים שלנו, כרוכים באיסוף נתונים של כמות גדולה של תאים, אך אחד יכול להשתמש גבוה יותרמטרה ללמוד רק כמה תאים. העיתוי שכל תמונה שצולמה גם יכול להיות מותאם. אם ניקח תמונה כל 4 דקות ל24 שעות מניבה סרט שפועל בערך דקה 1 באורך כאשר כל המסגרות כבר דחוסות. גם היבט הגדלת (משך הזיהום או הזמן בין מסגרות) מגדיל את כמות קבצים שצריכים להיות מאוחסנים אשר עשוי להיות בעיה עבור חלק מעבדות.
exocytosis לא אלים הוא תהליך דינמי מאוד שמתרחש במהירות ובמרווחי זמן שונים במהלך הדבקה. לכן, מנסה ללכוד מקרופאגים עוברים אינטראקציה זה בשיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה שידור ואלקטרונים סורקים יכול להיות מאוד נדיר. בשל אופייה של איך דגימות קבועות ומעובד, אחד לא יכול להיות בטוח כי מה שנצפה הוא בודאות exocytosis לא אלים מול תהליכים תאיים אחרים כגון תמוגה או אפופטוזיס. כמו כן, סימן היכר של exocytosis לא אלים הוא שהמארח והפתוגן להישאר באמצעות ble לאחר מכן וזה משהו שלא ניתן להסיק מתמונות קבועות מאז שיטות אלה רק יכולות לייצר תמונות של תהליך ברגע נתון.
בעוד פרוטוקול זה יכול לספק אינספור תמונות של תהליכים תאיים, ישנן מספר מגבלות בשימוש בטכניקה זו כדי לחקור אינטראקציות הפתוגן מארח. המטרה הנמוכה אנו משתמשים כדי ללמוד כמות גדולה של מקרופאגים בפעם אחת אינו מאפשר תמונה ברזולוציה גבוהה מספיק כדי להמחיש את יחסי הגומלין בין phagosome וקרום התא, שאינו היבט הבין היטב של exocytosis לא אלים. ברגע שכל התמונות כבר נרשמו, בהודעה הניתוח של מקרופאגים רבים הבאים יכול להיות מאוד משעמם וגוזל זמן. המקרופאגים, גם אלה דבקו זכוכית, יכולים להיות מאוד נעימים וביעברו בתוך ומחוץ למסגרת מהר מאוד. זה יכול לעשות את זה קשה לעקוב אחרי מקרופאגים בודדים מהתחלה ועד הסוף, במיוחד אלה שנמצאים בסמוך לפריפריה של המסגרת.
jove_content "> למרות מגבלות אלה, זה הוא פרוטוקול ניתן להשתמש במגוון דרכים כדי ללמוד את ההיבטים שונים של אינטראקציות מאכסן לפתוגן.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין לנו אינטרסים כלכליים מתחרים או סכסוכים אחרים בעלי עניין.
Acknowledgments
מחקר זה מומן בחלקו על ידי הפרסים NIH 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
