Summary
私たちは、マクロファージCを可視化する方法を説明しますネオフォルマンス （CN）デジタル光学顕微鏡を用いて非溶解性エキソサイトーシスの過程で特定の重点を置いて、リアルタイムで相互作用。この技術を用いて個別に感染したマクロファージは、この現象のさまざまな側面を確認するために研究することができる。
Abstract
クリプトコッカス·ネオフォルマンスによるマクロファージの感染の多くの側面が広く研究と明確に定義されています。しかし、明確に理解されていない一つの特定の相互作用は、非溶解性エキソサイトーシスである。このプロセスでは、酵母細胞は、マクロファージ及びCnの生存の両方を残すあまり理解機構によって細胞外空間に放出される。ここでは、時間の経過顕微鏡による24時間の感染期間ごとに個別に感染したマクロファージを大量に従う方法について説明します。感染したマクロファージは、細胞培養インキュベーター中と同じ条件を提供し、顕微鏡に取り付けられたCO 2雰囲気で加熱室に収納されている。ライブデジタル顕微鏡は、静止画像からは使用できませんホストと病原体との間の動的相互作用に関する情報を提供することができる。各感染細胞を可視化することができれば、マクロファージは真菌感染、およびその逆を処理する方法の手がかりを提供することができます。この技術iは複雑な現象の背後にある力学を研究する上でのsa強力なツール。
Introduction
クリプトコッカス細胞とマクロファージ間の真菌感染症のステージはよく1-3文書化されています。酵母細胞は、マクロファージによって摂取された後、相互作用の多様が発生することがあります。マクロファージは、細胞外空間に、その真菌負荷を解放する溶解もあれば、その細胞膜4の範囲内で酵母細胞を維持することによって感染を制御することができる。非溶解性エキソサイトーシス、マクロファージは、周囲の環境や隣接セルへクリプトコッカス細胞の一部またはすべてを抹消し、ホストおよび病原体の両方が5生存し続けるするプロセス：しかし、数年前に新しい結果が二つのグループによって独立して記述された-8。いくつかの研究は、この相互作用の背後にある分子メカニズムを理解しようとしましたが、私たちはまだこの現象をドライブかについての完全な理解していません。
リアルタイムで画像をキャプチャし、その後、複数の未感染を分析する能力マクロファージ編は、1つのタイミング、空間的な能力、真菌感染中のマクロファージの形態の変化、さらにはストレスに関して、非溶解性エキソサイトーシスを取り巻く物理的特性についての多くの質問に答えることができます。細胞がインキュベーターに匹敵する環境内に収容されるようにすることによって、私たちはマクロファージ真菌細胞相互作用の動的性質を垣間見ることができる。研究者は、このプロセスのさまざまなコンポーネントを研究するためにこの技術を使用している。別のグループは非溶解性エキソサイトーシスは、タンパク質ドメインの核WASH 10を削除して持っていた細胞内でブロックされたことを示すために、このメソッドを使用しながら、このプロセスにおけるファゴソームの役割は、蛍光染色およびアクチンブロッキング剤9を使用して明らかにされました。サイトカインシグナル伝達の効果もリアルタイム顕微鏡11を用いて確認された。このプロセスは、C.に限定されるものではないそれはまた、 カンジダ·アルビカンス、anotheで観察されたようネオフォルマンスマクロファージ12に感染する能力を有する真菌病原体rを。 これらの知見は、この方法は私達がそんなに少し知っ領域に豊富な情報を提供する方法の例です。
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Protocol
全ての動物作業はアルバート·アインシュタイン医科大学の動物研究所の規制やガイドラインに従って行われた。
Cの 1。成長条件ネオホルマンス H99（血清型A）
- 個別のC.を育てるサブロー寒天プレート上ネオフォルマンス （CN）コロニー。
- ある日、実験前に1つのコロニーを選択し、サブローブロス10mlを接種。
- 文化は速度250rpmで振盪し、37℃で一晩成長させる。
C57BL / 6マウスから2離と初代骨マクロファージの調製
- もはや呼吸するまでCO 2チャンバー内に動物を配置することによってマウスを安楽死させる。第二の対策として、cervically解剖を開始する前に、首を脱臼。 70％エチルアルコールで身体全体を滅菌する。
- 大腿骨と脛骨の両方を削除し、滅菌DMEM中で骨を置く。
- ドを使用して余分な組織や筋肉を削除する骨が完全にきれいになるまでlicateワイプ。
- 70％のエチルアルコールを含むペトリ皿にだけ無傷の骨を置き、関連する微生物を殺すために3分間インキュベートする。骨を削除し、滅菌したDMEMでペトリ皿に配置します。
- 慎重に骨の端をカット。各骨を25 Gの針を用いて氷上に置い空の50mlコニカルチューブと冷たいDMEMを慎重にフラッシュ10ミリリットル以上の骨を持ってください。
注：各マウスは4骨（大腿骨2、2脛骨）が得られます。したがって1マウスの細胞懸濁液を約40ミリリットルが得られるはずです。 - 650のx gで10分間、室温で遠心細胞懸濁液。
- この遠心分離の間、準備し、フィルタ骨髄マクロファージは20％L929、10％ウシ胎児血清、10％NCTC-109、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％HEPES、1％L-グルタミンを補充したDMEMで構成されて媒体を供給する殺菌、非必須アミノ酸、1％、0.1％2 - メルカプトエタノール。
- メディアを送り、10 mlの再懸濁し、得られたペレット。セルsuspensを渡す細胞塊を破壊し、大きな破片を除去するために70μmのセルストレーナーを通してイオン。
- プレート（10プレートの合計）組織培養用に指定されているペトリ皿にメディアを供給する10mlの中に細胞懸濁液1ml。
- 細胞を10％のCO 2、37℃で接着させる。完全にメディアやマクロファージが使用される準備ができている給餌を交換し、7日目、3日目に新鮮な給餌メディアの5ミリリットルを追加します。
- 実験前の日は、給餌培地を除去することによってプレートからマクロファージを外し、プレートに試薬をリッピング優しい電池の5ミリリットルを追加します。
- 37℃で5〜10分間インキュベートし、穏やかにピペッティングしてマクロファージを削除します。
- 10分間650×gでの遠心分離によって細胞をペレット化。
- 給餌培地1mlに再懸濁ペレット。 1:20希釈を使用して、血球計数器上に細胞懸濁液10μlをピペッティングすることにより、マクロファージの濃度を算出。
- 14ミリメートルのガラスを使用すると、ペトリ皿、プレートaを底直接200μlの最大を保持している内側のウェルに1×10 5マクロファージの濃度は、そのように、図4に示すように、このボリュームを超えないように十分注意してください。
- 細胞は1時間37℃のインキュベーター中に皿を置くことによって、ガラスシャーレに付着させる。
- 500 U / mlで1 mg / mlのとのIFNgにLPSを添加した培地を供給する1-2 mlを加え、細胞を一晩インキュベートすることができます。
3プライマリマウスマクロファージおよびCの同時インキュベーションネオフォルマンス
- 実験の日に、420×gで5分間遠心分離することにより、一晩接種し、培養し、ペレット酵母細胞の1ミリリットルを削除します。
- 上記の速度と同時にメディアや多糖類glucuronoxylomannan（GXM）様細胞外クリプトコッカス生成物を除去する滅菌PBSで細胞を3回洗浄する。
- 100希釈：滅菌PBS 1ml中に再懸濁細胞ペレットとは、1を加えます。 tはピペット10μlの彼は血球計数器上に希釈し、細胞をカウントします。 5：1のMOIで酵母細胞を追加します。例えば、1×10 5マクロファージが存在する場合、/ウェル、CNの5×10 6 / mlの細胞懸濁液を作製し、5×10 5 Cnの総額については、この溶液100μlを加える。
- 10μg/ mlの濃度でのmAb 18B7抗体による給餌培地1mlにクリプトコッカス細胞懸濁液の計算されたボリュームを追加する。 5分間室温で細胞懸濁液をインキュベートする。
- ガラスからの給電メディアを取り出し、ペトリ皿底し、滅菌PBSで1倍を洗う。ウェルに直接オプソニンCnの100μlのを追加します。
- 細胞を10％CO 2で37℃で2時間インキュベートすることを許可する。
- 同時インキュベーションの後、マクロファージはCnとを内在化していることを顕微鏡で確認してください。内在化とみなされるには、クリプトコッカス細胞は明らかにマクロファージの範囲内で見られるべきである。
- 任意およびすべてのextracellulaを除去するための無菌のPBSで洗浄するシャーレ3倍R Cnは。
- モノクローナル抗体18B7を添加せずにメディアを供給する1〜2mlのを追加し、顕微鏡を設定します。
4。デジタル光学顕微鏡を利用したリアルタイムでの非溶解性エキソサイトーシスの可視化
注：これらの実験を実行するには、CO 2の配信と加熱ユニットを含む添付インキュベートするチャンバーが付属して顕微鏡が必要となります。
- 実験の前に、37℃で少なくとも30分間インキュベートするチャンバをあらかじめ温め。 CO 2ユニットは実験開始時に5％を読み取っていることを確認してください。
- 置きガラスは、CO 2を蓋でカバーし、全く熱逃げないことを保証するために、すべてのドアを閉じて、顕微鏡プラットフォーム上でペトリ皿底。
- 位相差顕微鏡で10×対物レンズを用いて、感染したマクロファージのクリアフィールドに焦点を当てる。実験に基づいて、研究する必要がどのように多くのマクロファージが使用する目的を決定する。
- TAに顕微鏡ソフトウェアをセットアップします24時間の期間のために、画像ごとに4分KE。
- 24時間後、実験が完了に達しているし、361画像の総数が収集されているであろう。 5％の圧縮で.jpegsとしてこれらの画像をエクスポートします。画像Jソフトウェアを使用して、毎秒5フレームでビジュアル·スタックとして画像を表示します。映画は出版物またはプレゼンテーションのために表示する必要がある場合は、.AVIまたはフォーマットは、視聴者に最も適したかに応じてのMOVファイルのどちらとして保存します。
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Representative Results
この技術は、生成した画像は、細胞がC.貪食された後に何が起こるか、周囲の情報を収集するためのさまざまな方法で分析することができるネオフォルマンスは、 図1に見られるように、感染したまたは感染していないのいずれかである約100マクロファージである。これらのマクロファージのそれぞれは、視聴者に非常にミクロなレベルでの宿主 - 病原体相互作用を研究する機会を与えてくれます。 図2及び図3のように、マクロファージおよび酵母細胞の間で、さらにはマクロファージマクロファージとの間で発生する可能性が異なる結果があります。マクロファージは、非溶解性エキソサイトーシス、細胞 - 細胞伝達、または発生する可能性のある他の細胞過程を経るとしてスコアすることができます。感染の間のこのようなイベントのタイミングは、映画が記録されているときに設定されたパラメータに基づいて確認することができる。
図1：感染マクロファージのフィールドこの図では、24時間の感染期間の開始時に個別に感染したマクロファージのフィールド全体を示している。これは、より重要なことに、それはマクロファージ（大きな矢印で示されるように）感染される（小さい矢印で示すように）は、真菌細胞を含まないれているどのようにクリアフィールドは、細胞外Cnを含まないことに留意されるべきである。スケールバーは50μmでを表します。
ムービー1 ：マクロファージCの可視化ネオホルマンス 24時間の感染期間。ムービーの最初のフレームは、感染していないとクリプトコッカス細胞の変化する量を貪食しているものもいくつか持つフィールドの多くのマクロファージを示しています。映画が進行するにつれて、細胞は、AREすべての運動性とフィールド動き回る見ることができます。私たちは、彼らが受ける細胞プロセスの種類を見るために、これらのマクロファージのそれぞれに追従することができます。
図2：一次マウスマクロファージ受け非溶解性エキソサイトーシス （白い矢印で示されているパネルA）、感染したマクロファージは、非溶解性エキソサイトーシスの初期段階を受けて見られている。ファゴソームは、（パネルBC）と拡大し始め、真菌負荷がシフトし始める。パネルDEに見られるように、いくつかCnの細胞を、細胞外空間に放出される。白い矢印で示されたパネルFにおける第感染したマクロファージも、非溶解性エキソサイトーシス事象（パネルGH）を受ける。白矢印で示されるように、プロセスの終了時に、両方のマクロファージは、空（パネルI）残される。スケールバーは25μmでを表します。
ムービー2 ：可視化プライマリマウスマクロファージ受け非溶解性エキソサイトーシスは 、この映画では、クリプトコッカス細胞が感染したマクロファージの範囲内であることは明らかである。マクロファージは、攪拌となり、酵母細胞は、ファゴソーム内で出芽見ることができる。クリプトコッカス細胞はその後すぐに、周囲の環境に抹消されている。第二に感染したマクロファージは、非溶解エキソサイトーシスを受け、より多くの酵母細胞は、細胞外空間に放出される。移動継続するそれらの能力によって示されるように、宿主細胞は、クリプトコッカスエキソサイトーシスの後に生存し続ける。
図3：一次マウスマクロファージ受け、細胞-細胞伝達もうPROC。このプロトコルを使用してキャプチャすることができるエスはクリプトコッカス細胞が隣接マクロファージ一つのマクロファージから転送されたときに生じる細胞間転送です。二つ感染したマクロファージは、白矢印（パネルA）で示される互いに近接しており、細胞 - 細胞伝達（パネルB）を開始することさえ近づく。赤色の矢印によって示される細胞間橋クリプトコッカス細胞が移動（パネルC、E）の間に周囲の環境に曝されないように、2つのマクロファージとの間に形成される。転送が完了した後、細胞（パネルD、F）を脱却。スケールバーは25μmでを表します。
ムービー3 ：感染マクロファージ間の細胞-細胞伝達の可視際、マクロファージは、宿主細胞間クリプトコッカスセルの転送を容易にするような方法で相互作用する。酵母細胞が露出していない細胞外環境および宿主細胞に生存し続ける。このムービーでは、2つの感染マクロファージは1マクロファージから別のシャトルクリプトコッカス細胞への2つの別個の機会に、細胞間橋を作成します。
図4：細胞の概略を示す製剤。
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Discussion
ここでは、真菌 - マクロファージ相互作用が24時間の期間にわたってリアルタイムで記録し、分析することができる方法を記載している。私たちの研究室では、非溶解性エキソサイトーシスの時間的な側面の多くを研究するために、このプロトコルを使用しており、このプロセスを囲む形態学的要素を確認するために、リアルタイムの顕微鏡を使用し続けます。
この技術は理想的な結果をもたらすために、特別な注意がプロトコルにおける特定のステップに与えられるべきである。個別のセルの動きとの相互作用の視聴が妨げられるようにあまりにも少数の細胞が重要ではないデータを生成するかもしれない非常に多くの細胞が、使用できないムービーを作成することができますので、前の晩にメッキされているセル密度が重要です。目標は、個別のマクロファージが感染期間の間、続くことができるように、マクロファージの等間隔のフィールドを達成することである。その同じ静脈では、細胞外Cnを離れて洗浄して元のような重要なステップであるtracellular Cnは、フィールドを不明瞭にし、マクロファージの可視性の損失につながる可能性が時間をかけて分割します。映画の長さに応じて、フレームが勉強するの画像が使用できなくなるため、記録が感染中にさまざまな時点でチェックする必要が焦点から外れてシフトすることができます。
概説したように、この技術は他の実験のパラメータ内に適合するように変更することができるさまざまな方法がある。多くの異なる蛍光色素とマーカーは、膜とファゴソームダイナミクスを強調するために使用することができますが、1つは、フォトブリーチングの注意が必要です、これは、細胞の適応度に及ぼし得る影響を与える。多様な細胞型にも発生することがあり差異を研究するために、他の菌株と一緒にJ774.1マクロファージ様細胞、単球またはアメーバなどを用いることができる。私たちの実験は、細胞を大量にデータ収集を必要とするので、私たちは、しかし1は、より高い使用することができ、10倍の対物レンズを使用することをお勧めちょうど少数の細胞を研究するための客観的。各画像が取られるタイミングも調整することができる。 24時間ごとに1つのイメージ4分を取ることすべてのフレームが圧縮されている長さはおよそ1分を実行するムービーをもたらす。側面（感染期間またはフレーム間の時間）のいずれかを増加させることは、いくつかの研究室のために問題になることがあります保存することが必要なファイルの量を増加させる。
非溶解性エキソサイトーシスは、感染時に迅速かつさまざまな時間間隔で発生する非常に動的なプロセスである。したがって、このような透過および走査型電子顕微鏡などの他の方法を使用して、この相互作用を受けて、マクロファージを捕捉しようとすることは非常にまれであることができる。により試料が固定され、どのように処理されるかの性質上、人はどのような表示されていることは決定的にそのような溶解またはアポトーシスのような他の細胞プロセスに対して非溶解性エキソサイトーシスであることを確信することはできません。また、非溶解性エキソサイトーシスの特徴は、ホストと病原体が経由したままということですその後BLEこれらのメソッドは、与えられた瞬間に、プロセスのスナップショットを生成することができますので、固定された画像から推定することができないものである。
このプロトコルは、細胞プロセスの無数の画像を提供することができるが、宿主病原体相互作用を研究するためにこの技術を使用していくつかの制限がある。低い目標は、私たちはファゴソームと非溶解性エキソサイトーシスのよく理解され態様ではない、細胞膜との間の相互作用を可視化するために十分に高い解像度の画像を可能にしない、一度にマクロファージを大量に勉強するために使用する。すべての画像が記録されると、以下の多くのマクロファージの事後分析は、非常に退屈で時間がかかる可能性があります。マクロファージ、ガラスに付着しても、ものは、非常に運動することができ、非常に迅速において、フレームの外に移動します。これは、ハード最初から最後まで個人のマクロファージ、フレームの外周付近であることが特にに従うことを行うことができます。
jove_contentは ">これらの制限にもかかわらず、このプロトコルは、宿主 - 病原体相互作用の多くの異なる側面を研究するためのさまざまな方法で使用することができる。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、私たちは、競合金融利害やその他の利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究は、NIH賞5T32AI07506、5R01AI033774、5R37AI033142、5R01AI052733によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
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