Summary
Vi beskriver hur du visualisera macrophage- C. neoformans (Cn) interaktioner i realtid, med särskild tonvikt på processen för icke-lytisk exocytos med digital ljusmikroskop. Genom att använda denna teknik för sig infekterade makrofager kan studeras för att utröna olika aspekter av detta fenomen.
Abstract
Många aspekter av infektion av makrofager från Cryptococcus neoformans har studerats omfattande och väldefinierade. Men en viss interaktion som inte är klart icke-lytisk exocytos. I denna process är jästceller släpps ut i det extracellulära utrymmet genom en dåligt förstådd mekanism som lämnar både makrofag och Cn livskraftig. Här beskriver vi hur man följer ett stort antal individuellt infekterade makrofager för en 24 tim infektionsperioden med tids förföll mikroskopi. Infekterade makrofager är inrymda i en värmekammare med en CO 2 atmosfär fäst vid ett mikroskop som ger samma förhållanden som en cell-odlingsinkubator. Live digital mikroskopi kan ge information om det dynamiska samspelet mellan en värd och patogen som inte är tillgänglig från statiska bilder. Att kunna visualisera varje infekterad cell kan ge ledtrådar till hur makrofager hanterar svampinfektioner, och vice versa. Denna teknik isa kraftfullt verktyg för att studera den dynamik som ligger bakom ett komplext fenomen.
Introduction
Stegen i en svampinfektion mellan kryptokock celler och makrofager är väldokumenterade 1-3. Efter jästceller intas av makrofager, kan en mängd olika interaktioner inträffa: makrofagen kan lysera släpper sin svamp belastning i det extracellulära utrymmet, eller det kan kontrollera infektionen genom att hålla jästcellerna inom gränserna för dess cellulära membran 4. Men flera år sedan ett nytt utfall beskrevs självständigt av två grupper: icke-lytisk exocytos, en process i vilken en makrofag strukits några eller alla av de kryptokockcellerna in i den omgivande miljön eller en angränsande cell och både värd och patogen förbli livskraftig 5 -8. Flera studier har försökt att förstå de molekylära mekanismerna bakom denna interaktion, men vi har fortfarande inte ett fullt grepp om vad som driver detta fenomen.
Förmågan att ta bilder i realtid och därefter analysera flera infekteraed makrofager gör att man kan svara på många frågor om de fysiska egenskaperna kring icke-lytisk exocytos när det gäller timing, spatial förmåga, förändring i morfologi och även stress av makrofager under en svampinfektion. Genom att låta de celler som skall inrymmas i en miljö som är jämförbar med den i en inkubator, kan vi skymta den dynamiska karaktären hos makrofag-svampcellinteraktioner. Forskare har använt denna teknik för att studera olika komponenterna i denna process. Roll phagosome i denna process gjordes synliga med hjälp av fluorescerande färgning och aktin blockerande medel 9, medan en annan grupp använde denna metod för att visa att icke-lytisk exocytos blockerades i celler som har haft WASH kärnproteindomäner utgår 10. Effekten av cytokin signalering har också påvisas med hjälp realtid mikroskopi 11. Denna process är inte begränsad till C. neoformans som det har också observerats med Candida albicans, another svamppatogen som har förmågan att infektera makrofager 12. Dessa fynd är exempel på hur denna metod kan ge en mängd information till ett område som vi vet så lite om.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbete gjordes i enlighet med regler och riktlinjer för Institutet för djurstudier vid Albert Einstein College of Medicine.
1. Tillväxtvillkor C. neoformans H99 (serotyp A)
- Väx individuell C. neoformans (Cn) kolonier på Sabouraud agarplattor.
- En dag före experimentet, välja en koloni och inokulera 10 ml Sabouraud buljong.
- Låt kulturen växa över natten vid 37 ° C under skakning vid en hastighet av 250 rpm.
2 Isolering och Beredning av primär Bone Makrofager från C57 / BL6 Möss
- Euthanize möss genom att placera djuret i en CO 2 kammare tills inte längre andas. Som en andra åtgärd, cervikalt ur led halsen innan dissekering. Sterilisera hela kroppen med 70% etylalkohol.
- Ta bort båda lårben och skenben och placera benen i sterilt DMEM.
- Ta bort överflödig vävnad och muskler med hjälp av delicate våtservetter tills benen är helt rena.
- Placera endast intakta ben i en petriskål innehållande 70% etylalkohol och inkubera i 3 min för att döda associerade mikroorganismer. Ta bort ben och plats i petriskål med steril DMEM.
- Försiktigt skära ändarna av ben. Håll benet över en tom 50 ml koniska rör placeras på is och försiktigt spola 10 ml kall DMEM med en 25 G nål genom varje ben.
OBS: Varje mus kommer att ge fyra ben (2 lårben, skenben 2). En mus bör därför ge ungefär 40 ml cellsuspension. - Centrifugera cellsuspensionen vid rumstemperatur under 10 min vid 650 x g.
- Under denna centrifugering, förbereda och filter sterilisera benmärg makrofag utfodring medier som består av DMEM kompletterat med 20% L929, 10% fetalt kalvserum, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-glutamin , 1% icke-essentiella aminosyror, 0,1% 2-merkaptoetanol.
- Resuspendera erhållna pelleten med 10 ml mata media. Passera cell Suspension genom ett 70 ìm cell sil för att störa cellklumpar och tar bort större partiklar.
- Platta 1 ml cellsuspension i 10 ml utfodring medier i petriskålar som anges för vävnadsodling användning (totalt 10 plattor).
- Låt cellerna att hålla sig vid 37 ° C med 10% CO2. Tillsätt 5 ml av färsk matning media på dag 3 dag 7, helt ersätta matnings media och makrofager är redo att användas.
- Dagen före experimentet, lossa makrofager från plattan genom att ta bort utfodring media och tillsätt 5 ml av en mild cellstripp reagens till tallrik.
- Inkubera i 5-10 minuter vid 37 ° C och avlägsna makrofager med försiktig pipettering.
- Pelletera celler genom centrifugering vid 650 xg under 10 min.
- Resuspendera pelleten i 1 ml utfodring medier. Med användning av en 1:20 spädning, beräkna koncentrationen av makrofager genom att pipettera 10 ul av cellsuspension på en hemocytometer.
- Med hjälp av 14 mm glas botten petriskålar, plåt enkoncentration av 1 x 10 5 makrofager direkt på det inre såväl som rymmer högst 200 l, så ta försiktighet inte överstiga denna volym som visas i Figur 4.
- Låt cellerna att vidhäfta till glaspetriskål genom att placera skålarna i en 37 ° C inkubator under en timme.
- Lägg 1-2 ml mata media kompletterade med LPS vid 1 mg / ml och IFNg vid 500 u / ml och tillåta cellerna att inkubera över natten.
3 Co-inkubation av primär Murina makrofager och C. neoformans
- På dagen för experimentet, ta bort 1 ml över natten ympade kultur och pelletsjästceller genom centrifugering i 5 minuter vid 420 x g.
- Tvätta cellerna 3 gånger med steril PBS för att ta bort media och extracellulära kryptokockprodukter som polysackarid glucuronoxylomannan (GXM) med den hastighet och tid som nämns ovan.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml steril PBS och göra en 1: 100 spädning. Pipettera 10 pl tHan utspädning på en hemocytometer och räkna cellerna. Lägg jästceller vid ett MOI av 1: 5. Till exempel, om det finns ett x 10 5 makrofager / brunn, gör en cellsuspension av 5 x 10 6 / ml Cn och tillsätt 100 pl av denna lösning till ett totalt belopp av 5 x 10 5 Cn.
- Lägg beräknade volymen av kryptocellsuspension till 1 ml utfodring media med mAb 18B7 antikroppen vid en koncentration av 10 mikrogram / ml. Inkubera cellsuspensionen vid rumstemperatur under 5 min.
- Ta mata media från glas botten petriskål och tvätta 1x med steril PBS. Tillsätt 100 pl opsoniserad Cn direkt till väl.
- Låt cellerna att inkubera i 2 h vid 37 ° C med 10% CO2.
- Efter samtidig inkubation, kontrollera genom mikroskop som makrofager har internalis Cn. För att betraktas som internaliseras, bör kryptokock celler tydligt ses inom ramarna för makrofagen.
- Tvätta petriskål 3x med steril PBS för att avlägsna all extracellular Cn.
- Lägg 1-2 ml mata media utan tillsats av mAb 18B7 och ställa in mikroskopet.
4 Visualisering Icke-lytisk Exocytos i realtid Använda Digital Light mikroskopi
OBS: För att utföra dessa experiment, ett mikroskop som kommer med en bifogad inkubering kammare som innehåller CO2 leverans och en värmeenhet krävs.
- Före experimentet, för-värma inkubering kammare under minst 30 min till 37 ° C. Se till att CO 2 enheten läser 5% vid början av experimentet.
- Placera glas botten petriskål på mikroskop plattform, täck med CO2 lock och stäng alla dörrar för att garantera att inga värme rymningar.
- Använda 10X objektivet med mikroskopet i fas kontrast, fokusera på ett tydligt område infekterade makrofager. Utifrån experimentet avgöra det mål som används av hur många makrofager behöver studeras.
- Ställ in mikroskop programvara för att take en bild varje 4 min för en 24 h period.
- Efter 24 timmar, ska experimentet har nått fullbordan och totalt 361 bilderna har samlats in. Exportera dessa bilder som .jpegs på en 5% kompression. Använda Bild J programvara, visa bilder som en visuell Stack på 5 bilder per sekund. Om filmen måste ses för publicering eller en presentation, spara den som antingen en AVI eller MOV-fil, beroende på vilket format som fungerar bäst för betraktaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bilder som denna teknik producerar kan analyseras på en mängd olika sätt att samla information kring vad som händer efter celler har fagocyteras C. neoformans. Som framgår av Figur 1, finns det cirka 100 makrofager som antingen infekterade eller oinfekterade. Var och en av dessa makrofager ger betraktaren en möjlighet att studera värd-patogen interaktioner på en mycket mikroskopisk nivå. Som Figurerna 2 och 3 visar, finns det olika utfall som kan uppstå mellan en makrofag och jästcell, och även mellan makrofag-makrofag. Makrofager kan görs som genomgår icke-lytisk exocytos, cell-cell överföring, eller någon annan cellulär process som kan inträffa. Tidpunkten för sådana händelser under infektionen kan också fastställas utifrån de parametrar som ställs in när filmen spelas in.
Figur 1:. Fält av infekterade makrofagerna Denna bild visar ett helt fält av individuellt infekterade makrofager i början av en 24 tim infektionsperiod. Det bör noteras att fältet är fritt för extracellulärt Cn och ännu viktigare, hur tydligt det är vilka makrofager är smittade (vilket indikeras av en stor pil) och som inte innehåller några svampceller (vilket indikeras av en liten pil). Skala stapel representerar 50 pm.
Film 1 : Visualisering av Macrophage- C. neoformans 24 hr Infektion Perioden. Den inledande bildrutan i filmen visar många makrofager i hela området med några som är oinfekterade och några som har fagocyterats varierande mängder av kryptokockceller. Eftersom filmen fortskrider, cellerna are alla rörliga och kan ses röra sig på området. Vi har möjlighet att följa alla dessa makrofager för att se vilken typ av cellulär process de genomgår.
Figur 2:. Primär Murina Makrofag genomgår icke-lytisk Exocytos En infekterad makrofag (panel A, visas med en vit pil) ses genomgår början stadier av icke-lytisk exocytos. Den phagosome börjar förstoring (panel BC) och svamp lasten börjar skifta. Flera Cn celler sedan ut i det extracellulära utrymmet som kan ses i paneler DE. En andra smittade makrofag i Panel F, indikeras av en vit pilspets, genomgår också en icke-lytisk exocytos händelse (Panel GH). Vid slutet av processen, är båda makrofager lämnas tomt (panel I), såsom visas med de vita pilarna. Skala stapel representerar 25 pm.
Film 2 :. Visualisering Primary Murina Makrofag genomgår icke-lytisk Exocytos I den här filmen, är det tydligt att de kryptokock cellerna är inom ramarna för en infekterad makrofag. Den makrofag blir upprörd och en jästcell kan ses spirande inom phagosome. Krypto Cellerna sprids sedan snabbt strukits ut i den omgivande miljön. En andra smittade makrofag genomgår icke-lytisk exocytos och fler jästceller släpps ut i det extracellulära utrymmet. Värdcellema förbli livskraftig efter krypto exocytos vilket framgår av deras förmåga att fortsätta gå.
Figur 3:. Primär Murina Makrofag genomgår Cell-Cell Transfer annan process som kan fångas med hjälp av detta protokoll är cell-cellöverföring som sker när kryptokock celler överförs från en makrofag till en angränsande makrofag. Två infekterade makrofager finns i nära anslutning till varandra markeras med vita pilar (Panel A) och flytta ännu närmare för att initiera cell-cellöverföring (panel B). En cell-cell-bro indikeras av de röda pilhuvuden bildas mellan de två makrofager så att de kryptokockcellerna inte är utsatta för den omgivande miljön under överföringen (panel C, E). När överföringen är klar, cellerna bryta sig loss (panel D, F). Skala stapel representerar 25 pm.
Film 3 :. Visualisera Cell-Cell Överföring mellan infekterade makrofagerna Ibland kommer makrofager samverkar på ett sätt som underlättar överföring av krypto cell mellan värdceller. Jästcellerna exponeras intetill den extracellulära miljön och värdcellerna förblir livskraftiga. I den här filmen, två infekterade makrofager skapar cell-cell broar på två separata tillfällen till transferkryptokock celler från en makrofag till en annan.
Figur 4: Schematisk visning beredning av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit en metod med vilken svamp-makrofag interaktioner kan spelas in och analyseras i realtid under en 24 timmarsperiod. Vårt laboratorium har använt detta protokoll för att studera många av de tidsmässiga aspekter av icke-lytisk exocytos och kommer att fortsätta att använda realtids mikroskopi att fastställa de morfologiska komponenter som omger denna process.
För denna teknik för att ge perfekt resultat, bör särskild uppmärksamhet ägnas åt vissa steg i protokollet. Den celltäthet som är klädd kvällen innan är viktigt eftersom för många celler kan skapa en film som inte är användbar som visning av rörelsen och interaktioner mellan enskilda celler hindras, medan för få celler kan ge uppgifter som inte är signifikant. Målet är att uppnå en jämnt fördelade inom makrofager så att enskilda makrofager kan följas under hela infektionen perioden. I samma anda, tvätta bort den extracellulära Cn är ett kritiskt steg som extracellular Cn kommer att dela med tiden vilket kan skymma området och leda till en förlust av synlighet makrofagerna. Beroende på längden på filmen, kan ramen flytta ur fokus, vilket gör bilderna oanvändbara för att studera och därför måste den inspelning som ska kontrolleras vid olika punkter under infektionen.
Såsom beskrivits, finns det olika sätt denna teknik kan modifieras för att passa inom parametrarna för andra experiment. Många olika fluorescerande färgämnen och markörer kan användas för att markera membran och phagosomal dynamik men man bör vara försiktig med fotoblekning och påverka denna kan ha på hälsotillståndet för cellerna. En mängd olika celltyper kan också användas såsom J774.1 makrofag-liknande celler, monocyter eller amöbor i samband med andra svampstammar för att studera skillnaderna som kan uppstå. Vi föreslår att du använder ett mål 10X eftersom våra försök att behöva samla in en stor mängd celler uppgifter, men man kan använda en högremålet att studera bara några celler. Tidpunkten att varje bild är tagen kan också justeras. Att ta en bild var 4 min för 24 timmar ger en film som går ungefär 1 minut i längd när alla ramar har komprimerats. Öka antingen aspekt (hur länge infektion eller tiden mellan ramar) ökar mängden filer som behöver lagras som kan vara ett problem för vissa laboratorier.
Icke-lytiska exocytos är en otroligt dynamisk process som sker snabbt och vid olika tidsintervall under infektion. Därför kan försöka fånga makrofager som genomgår denna interaktion med hjälp av andra metoder såsom överföring och svepelektronmikroskop vara extremt sällsynt. På grund av karaktären av hur proverna är fasta och bearbetas, kan man inte vara säker på att det som visas är definitivt icke-lytiska exocytos kontra andra cellulära processer såsom lys eller apoptos. Dessutom är ett kännetecken för icke-lytisk exocytos som värd och patogen kvar via ble efteråt vilket är något som inte kan härledas från fasta bilder, eftersom dessa metoder endast kan producera ögonblicksbilder av en process vid en given tidpunkt.
Även om detta protokoll kan ge otaliga bilder av cellulära processer, finns det vissa begränsningar i att använda denna teknik för att studera värd patogen interaktioner. Den låga mål vi använder för att studera en stor mängd makrofager vid en tid inte tillåter en tillräckligt hög upplösning för att visualisera interaktion mellan phagosome och det cellulära membranet, som inte är en väl förstådd aspekt av icke-lytisk exocytos. När alla bilderna har spelats in, kan efteranalys av följande många makrofager vara mycket tröttande och tidskrävande. Makrofager, även de vidhäftade till glas, kan vara mycket motila och kommer att röra sig in och ut ur ramen väldigt snabbt. Detta kan göra det svårt att följa enskilda makrofager från början till slut, särskilt de som är nära periferin av ramen.
jove_content "> Trots dessa begränsningar, är detta protokoll kan användas i en mängd olika sätt att studera de många olika aspekter av värd-patogen interaktioner.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att vi inte har några konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning stöds delvis av NIH utmärkelser 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud Dextrose Agar | BD | DF0109-17-1 | |
| Sabouraud Dextrose Broth | BD | DF0382-17-9 | |
| Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Atlanta Biologicals | S12450 | |
| NCTC 109 | Invitrogen | 21340-039 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| HEPES Buffer | Corning Cellgro | 25-060-Cl | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
| Non-essential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-Cl | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Toxic |
| 3003 Tissue Culture Petri Dishes | Fisher Scientific | 08772E | |
| CellStripper | Corning Cellgro | 25-056-Cl | |
| Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| LPS | Sigma | L3137 | |
| Mouse IFN-g | Roche | NC 9222016 | |
| mAb 18B7 | Non-commerical antibody produced in our lab | ||
| Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber | Zeiss |
References
- Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
- Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
- Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
- Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
- Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
- Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
- Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).
