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Medicine

臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化

doi: 10.3791/52085 Published: December 21, 2014

Introduction

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そのような胎盤などの周産期の供給源に由来する細胞は、胎盤膜、臍帯および羊水は再生医療1,2のための細胞の潜在的な供給源として研究者や臨床医から注目を集めている。この関心の理由は、これらの細胞型すべてが可塑性および免疫調節機能3、彼らの潜在的な治療への応用の基礎となる性質をある程度持っていることである。

HAECを回生細胞物質の豊富な潜在的な源を提供する、用語または早産羊膜4に由来することができる不均一な上皮細胞集団である。細胞療法として魅力HAECをを作る特性は、それらの多能、低い免疫原性、および抗炎症性を含む。 HAECをはcardiom(中胚葉系統に分化する能力、in vitroおよびin vivoの両方非常に多能性であることが判明しているyocytes、筋細胞、骨細胞、脂肪細胞)、内胚葉系統(膵臓細胞、肝細胞、肺細胞)および外胚葉系統(毛髪、皮膚、神経細胞とアストロサイト)5-10。

安心させる、彼らの多分化のHAECをもかかわらず、腫瘍を形成またはin vivoで腫瘍の発達を促進するためのいずれか表示されません。さらに、HAECを、クラスIIヒト白血球抗原(HLAは)8の低いレベルで発現する、特権免疫がある。このプロパティは、おそらく免疫適格サル、ウサギ、モルモット、ラット、およびブタ11-13を用いた研究において実証されるように、同種および異種移植後の免疫拒絶を回避する能力の基礎となる。 HAECを、強力な免疫調節および免疫抑制のプロパティを表示し、したがって、自己免疫疾患の治療における潜在的な臨床応用のための重要な実用的な利点を提供する。 HAECをは、先天性および適応免疫システムの両方に免疫調節機能を発揮すると考えられている。上のメカニズムのeは、免疫調節因子の14の分泌を介して行われ、提案した。

前臨床動物疾患モデルでHAECを、現在のアプリケーションは、脳卒中、多発性硬化症、肝疾患、糖尿病、慢性及び急性の肺疾患の治療が含まれる。研究者は、彼らの独特の特性に起因する脳卒中後の脳の炎症を処置するためにHAECをを使用することに関心を示している。 HAECを、彼らは、生着までの60日間生存、ニューロンへの分化、炎症を減少させ、神経疾患15の動物モデルにおいて、損傷した中枢神経系組織の再生を促進することができ、血液脳関門を通過することができるという証拠がある。

HAECを、多発性硬化症の発症および進行に寄与する複数の病理学的経路を標的とし、逆転する機能を提供します。例えば、前臨床動物試験からの結果は、HAECを強く免疫抑制性であることを示唆していると潜在的に末梢免疫寛容を誘導し、継続的な炎症反応を逆にすることができます。 HAECをまた、インビボで神経細胞に分化し、神経栄養因子16の広大な配列の分泌を介して内因性の神経再生を増強する能力を有することが示されている。

ヒト及びげっ歯類羊膜上皮細胞は、既に、動物モデルにおける肝疾患の治療のためのそれらの治療有効性を実証している。縮小肝細胞アポトーシスに伴う肝臓中の生存HAECを生着に肝疾患、HAEC移植リードの四塩化炭素による損傷誘発モデルにおいて、肝線維症、炎症および17を減少させた。

HAECを、インスリンとグルコーストランスポーターなどの表現膵臓の要因に刺激することができる。いくつかの研究は、糖尿病マウス18で血中グルコースレベルを復元するHAECをする可能性を検討した。投与したマウスでは、HAECをは、両方の動物の体重および血中グルコースレベルは、細胞の注射後に正常レベルに低下した。これらの研究は、糖尿病の治療のためのHAECを使用するための強力なケースを提示する。

HAECを、成人および新生児モデル19の両方で実験的な急性および慢性の肺損傷の防止と修復において実績のある役割を担っている。これらの研究は、HAECをが嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレータ(CFTR)、嚢胞性線維症を有する患者20に変異しているイオンチャネルを含む複数の肺癌関連タンパク質を発現する機能的な肺上皮細胞にin vitroで分化することがわかった。 HAECを負傷が成人および新生児の肺に送達された場合も、それらは、好中球、マクロファージおよびリンパ球21-23を含む肺白血球補充を、還元、宿主免疫細胞の調節を介して、それらの修復効果を発揮する。

彼らの豊富を考えると、安全記録、および複数の疾患のための実証済みの臨床応用、HAECをを使用した臨床試験は避けられない。臨床治験にHAEC療法の翻訳を加速させることを目標に、私たちは現在の適正製造基準(cGMPの)ガイドラインに従って動物製品の無試薬を用いて、臨床試験のための適当な方法で培養HAECをし、分離し凍結保存とする方法を開発。

私たちは、このプロトコルを私たちは動物由来の試薬​​6を使用してHAECをを分離することに成功し使用していた以前に公開されたプロトコルをベース。我々は、動物製品を含まない試薬で動物由来の製品を置き換えるために、元のプロトコルを変更し、その後の最適化は、細胞収量、生存率および純度を最適化するために行った。私たちの目標は、ヒト臨床試験用電池製造のための規制基準に準拠したいプロトコルを開発することであった。

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Protocol

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注:胎盤用語選択科目帝王切開の設定に合わせて、シングルトン健康妊娠から収集する必要があります。書かれ、インフォームドコンセントは、胎盤の収集のために与えられるべきである。あなたの関連する人間の研究倫理委員会の承認のヒト組織のすべての収集と利用をする必要があります。

羊膜上皮細胞の単離

  1. クラスII生物学的安全キャビネット内で無菌の表面に胎盤を置きます。
  2. 無菌ハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)を用いて、胎盤の表面及び膜からできるだけ多くの血液を洗浄する。
  3. 臍帯を上にして置かれ、胎盤では、機械的に羊膜と絨毛膜の膜の外縁を分離する。
  4. 分離後は、手動で臍帯に向けて、膜のエッジの周りの作業、胎盤の絨毛膜膜から羊膜を取り除く。
    注:carefこと羊膜から絨毛膜を汚染する任意の部分を削除するには、UL。
  5. 無菌のハサミを使用して、250ミリリットルHBSSを含有する容器を密封された500ミリリットル中に臍帯と場所のベースから約2cmの羊膜をカット。
  6. 羊膜膜を含む密閉ボトルを振ることにより徹底的に洗ってください。
  7. 滅菌ピンセットを使用して収集容器から羊膜膜を外し、15センチメートルペトリ皿に置く。
  8. 流血や破れの部分を破棄し、(ピンセットで垂直に保持時)約5cm、長片に羊膜をカット。
  9. 500ミリリットル内の場所は、コンテナを密封し、250ミリリットルHBSS約3〜5倍または羊膜膜が無汚染血液と半透明になるまで洗浄した。
    注:任意に存在する血液の酵素消化溶液の効率を低下させることができる。
  10. に注意しながら、溶液を消化する酵素を50 mlを入れた容器に羊膜のすべての部分を転送するHBSSのキャリーオーバーを最小限に抑える。
  11. 残りの血液を除去するために穏やかに攪拌しながら15分間37℃の水浴または暖かい部屋でソリューションを消化酵素の中で羊膜断片をインキュベートする。
  12. 新しい滅菌容器内の溶液と場所を消化酵素のから羊膜片を除去します。
  13. 羊膜膜へのソリューションを消化し、水浴または穏やかに振盪(最初の消化)と暖かい部屋で60分間37℃でインキュベート新鮮な酵素の100ミリリットルを追加します。
  14. 羊膜膜片を取り出し、酵素による、膜の各部分から排水するソリューションを消化できるように、新しいコンテナ世話に入れる。
    注:これは、容器の内側縁に沿って羊膜片をドラッグすることによって達成することができる。
  15. 羊膜膜片に対する解決策を消化し、穏やかに振盪(第二の消化)を用いて37℃の水浴または暖かい部屋で60分間インキュベートする新鮮な酵素の100ミリリットルを追加します。
  16. セルを渡しsuspensiステップ1.14から10分間千×gで70μmのフィルターと遠心分離機を経て上に。
  17. 削除し、上清を捨て、および1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含む4ミリリットルHBSSで細胞ペレットを再懸濁します。穏やかに単一細胞懸濁液を得た1mlピペットで繰り返しピペット。
    注:第消化物からの細胞は、同様の処理段階になるまで、この段階で、細胞を氷上に放置することができる。
  18. 羊膜膜片を取り出し、酵素による、膜の各部分から排水するソリューションを消化できるように、新しいコンテナ世話に入れる。
    注:これは、容器の内側縁に沿って羊膜片をドラッグすることによって達成することができる。
  19. 10分間の千×gで70μmのフィルターと遠心分離機を通してステップ1.18から細胞懸濁液を渡します。
  20. 削除し、上清を捨て、および1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含む4ミリリットルHBSSで細胞ペレットを再懸濁します。静かに1ミリリットルpで繰り返しピペット単一細胞懸濁液を得るipette。
  21. 2つのダイジェストまたは代わりのプール細胞は、細胞数の後まで分離した細胞ダイジェストを保つ。
    注:これは高い生存細胞と、潜在的に低い生存性細胞の混合を防ぐことができます。
  22. 10〜20ミリリットルの最終容量にHBSSを追加し、生存能力を測定するためにトリパンブルーを用いて細胞数を行う。
  23. フローサイトメトリーによる上皮細胞表現型を確認してください。抗EpCAM-PEを用いて適切な抗体カクテルを作る(1:2希釈)抗CD90-PeCy5(1:250)および抗CD105-APC(1:100)HBSS中。
  24. 25×10 6細胞/ mlの濃度で一つまたは抗体カクテルの両方の消化物からの細胞のサブセットを再懸濁する。
  25. フローサイトメトリー、ステインアイソタイプコントロールを含む抗体カクテルと1×10 6細胞(例えば。のIgG 1アイソタイプコントロール-PE +抗CD90-PeCy5 +抗CD105-APC)。セットアップフローサイトメーター用の染色されていない〜1×10 6細胞を保管してください。
  26. 抗体で細胞をインキュベート60分間4℃でカクテルをお楽しみいただけます。
  27. 洗浄細胞は、フローサイトメトリーのために、1ml当たり5から10000000個の細胞でHBSS再懸濁で3倍。
  28. フローサイトメトリーとノート結果を実行します。細胞分離株(のEpCAM陽性およびCD90 / CD105陰性細胞の割合)の純度は、それぞれ90〜95%と<1%であることが期待される。
  29. 最終的なアプリケーションによって決定されるよう、適切な品質管理やリリース基準のテストのために取って細胞の適切な数を設定します。
    注:これは、疾患/ウイルスのスクリーニング、または他の安全性又は生物学的基準を含むことができる。
  30. 残りの細胞では、低温保存プロトコールに従うか、あるいは(培養工程3.6への直接)文化に直接配置します。

HAECを2.凍結保存

  1. トリパンブルー排除を使用してデータまたは手動カウント、フローサイトメトリーを用いて細胞数および生存率を決定します。
  2. 5分間700×gで遠心分離する。
  3. 再懸濁細胞動物性製品の無凍結保存培地1ml当たり1から10000000細胞間の秒。
  4. O-環状凍結保存バイアルに細胞の適切な量をピペット冷却℃/分まで-80°C〜が達成され、およそ1を発生する装置を凍結し、制御された速度に入れる。
  5. 長期保存のために液体窒素中にバイアルを移す。

凍結保存HAECを3.解凍と文化

  1. 液体窒素から凍結保存バイアルを取り出し、氷上に置きます。
    注:転送の場合のみ - 次のステップに急速に進んでください。
  2. 氷が残る唯一の小片(〜5mm角)になるまで37℃で急速に凍結バイアルを解凍する。
    注:細胞溶液は、凍結保存培地中のDMSOの毒性効果を減少させるために加温しないことが重要である。
  3. 冷(1~4℃)で無血清培地に凍結保存培地を10倍に希釈し、適当な大きさに滴下D管やコンテナ。
  4. RTで5分間700×gで遠心分離する。
  5. 1mlあたり100万個の細胞のおよその濃度を、無血清培地中で再懸濁し、。トリパンブルー排除で自動化または手動の計数を用いて細胞数および生存率を決定します。予想される生存解凍後は、事前に凍結保存の生存率よりも5〜10%減となります。
  6. 代わりにプレート標準的な細胞培養処理プラスチックウェア上の細胞、または、私はコート培養表面に型コラーゲンを使用しています。
  7. I型コラーゲンコーティングについては、以下のプロトコルに従う
    1. ヒト胎盤(25ミリリットル脱イオン水と50μlの氷酢酸と15 mgのコラーゲン)から酸可溶性I型コラーゲンを準備します。
    2. パラフィルムでビーカーを覆い、コラーゲン鎖が溶解するまで37℃で適度に撹拌した。
    3. 0.22μmのフィルターを用いて無菌濾過コラーゲン溶液。
    4. 脱イオン水でろ過したコラーゲン株式1:10に希釈する。この希釈された株式は、作業conceですプラスチックと膜表面をコーティングするためのntrationソリューション。
    5. 2〜8℃、37℃、またはO / NでのコラーゲンRTで2時間コートプラスチック、ガラス、膜の表面を。
    6. コー​​ティングされた表面から余分な流体を除去し、それがO / Nを乾燥させます。
    7. 細胞および培地を導入する前に無菌の組織培養グレードの水またはHBSSで洗い流してください。
  8. プレート無血清培地中で25000細胞/ cm 2の密度でHAECを、そして、添付ファイルが72〜96時間起こさせる。
  9. 添付ファイルの後、慎重に吸引し、無血清培地の適切な音量2〜3日ごとに交換することによってメディアを変更。
  10. 以下のプロトコルを使用して継代細胞
    1. 吸引し、細胞培養培地および滅菌HBSSの1倍容量で洗浄
    2. 細胞は、細胞培養表面から離脱観察されるまで、酵素の1倍体積を加える溶液を消化し、5〜15分間インキュベートし、または。
    3. CEのを確実にする、細胞を含む酵素消化液の収集LLSを繰り返し、細胞培養表面に対する酵素消化物溶液をピペッティングすることにより細胞培養表面から剥がれた
    4. 5分間700×gで遠心分離する。
    5. 1mg / mlの大豆ベースの酵素阻害剤を含有するHBSSの適切な体積で細胞ペレットを再懸濁する。穏やかに単一細胞懸濁液を得るために、1ミリリットルピペットで繰り返しピペット。
    6. 100万個の細胞/ mlのおおよその濃度になるように無血清培地を加える。トリパンブルー排除で自動化または手動の計数を用いて細胞数および生存率を決定します。
    7. プレート無血清培地中で25000細胞/ cm 2の密度でHAECを、そして、標準的な培養方法を続行。

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Representative Results

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この手順が正しく実行されると、1.2億HAECを、平均収量は80から160000000セルの典型的な範囲で、期待されるべき。これらの収率で、83±4%の平均生存率が期待できる。臨床的方法で増加し、平均収率およびわずかに低い生存率に起因血清タンパク質の欠如のために、おそらく、動物由来の製品よりも高いトリプシン活性に起因する、とすることができる。単離されたHAECをは<1%CD90、CD105間葉マーカー陽性細胞と92%のEpCAM陽性細胞の平均細胞表面プロファイルを有する。これらのマーカーは、それぞれ、上皮24,25および間葉26系統のために、それらの特異性に選択した。このプロセスは、( 図1)を完了するのに約4~5時間を取ることができる。

凍結保存は、バイアルと最終細胞収量の数に応じて20〜60分を必要とします。我々は以前凍結保存培地の範囲をテストし、発見した多くの動物製品を含まない培地は、適切に実行することは、しかし、最適なDMSO濃度は約5~10%である。通常、1は、生存能力の解凍後は、プレ凍結保存の生存率よりも5〜10%減であることを期待することができ、そして、この損失は、経験の浅いユーザ( 図2)のために大幅に大きくすることができる。

細胞培養は、 インビトロの手順特性化、分化、または他の特定を可能にするためにHAECを行うことができる。これらの細胞は、最初に50〜80%の効率(個人的な観察)を細胞表面に付着する。これは、その後の継代で70〜90%まで増加する。添付ファイルは、I型コラーゲン、または同様の製品などの表面コーティング材料の使用によって増加させることができる。 HAECを無血清培養培地での上皮表現します( 図3)を維持する。我々は、繰り返し継代後の細胞表面マーカープロフィールの有意な変化を発見した。さらに、後に約5継代のHAECをはeithできるER老化に達する、または間葉移行上皮と一致して形態変化を経る。繰り返し通過後、HAECを、正常な核型、長いテロメアの長さと細胞周期分布を維持する。これらのプロパティは、変換または腫瘍形成性の低いリスクを示す。免疫調節性および抗炎症特性を有することに加えて、HAECを、3つの主要な胚葉の細胞系統の代表( 図4)に分化する、インビトロおよびインビボでの多能性の高いことが示されている。

図1
図1:期待細胞収量、生存率および純度の臨床分離プロトコルの同様の細胞収率および生存率は、標準的な動物製品を含有する方法と比較して、動物副産物ない試薬を用いて達成することができる。典型的な分離は、> 90%のEpCAMのと、<1%のCD90 / CD105陽性のあるべき細胞。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:血清含有および無血清凍結保存培地のための解凍後の生存率と代謝が 10%のDMSOを含むFBSと比較すると、市販の動物性製品の無凍結保存培地は、同様のまたは増大解凍後の生存率および代謝を示した。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。

図3
図3:無血清および血清含有細胞CULでHAECをの典型的な付着と成長のプロフィールトゥーレ媒体。動物製品を含まない培養培地は、適切な細胞接着、増殖、および上皮表現型の維持を示した。しかし、無血清培地の更なる発展は、血清含有培地と同等の結果を達成するために必要とされる。スケールバーは500μmで表す。

図4
図4:HAECをの多能分化は、初期継代では、HAECを、3つの主要胚葉の複数の細胞系統を代表に分化することが示されている。これらの系統が含まれるが、これらに限定されない。ニューロン、髪や皮膚細胞、肺上皮、心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞、骨細胞と脂肪細胞。 (図27から適応)

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Discussion

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この方法の成功に重要な影響を与えることができるいくつかの重要なパラメータがある。 HAECを単離する前に、最大3時間胎盤または羊膜の貯蔵はロジスティックまたはスケジューリングの目的のために望ましいことがある、しかしそれは、組織ができるだけ早く処理されることをお勧めします。組織を保存する場合は、ストレージが羊膜膜の解剖と洗浄後に実施することをお勧めします。羊膜は、4℃で抗生物質を含有する滅菌HBSSに格納することができるが、細胞生存率が延長貯蔵時間と共に減少することができる。我々は、その他の細胞収率および生存率の変動を発見し、それは、好ましくは、帝王切開により送達健康用語出生から収集される胎盤を推奨され、この可変性を最小限にする。

我々は、血液細胞と羊膜膜の汚染は、酵素活性の阻害および細胞収率の低下をもたらすことを見出した。従ってプロトコルにおける重要なステップは、胎盤と羊膜膜の徹底的な洗浄が推奨されている。それが下流の酵素阻害を回避するために、明確な/白表示されるまで、羊膜組織を洗浄することをお勧めします。上皮細胞の比較的均質な集団の単離は、特徴付けおよび品質管理試験のために重要である。

間葉系細胞との細胞収率の低い収率、生存率や汚染が発生した場合、トラブルシューティングを行うことができるいくつかの変更がある。細胞収量が低い場合には、酵素活性は、血液または血清汚染を抑制された可能性がある。これは、より完全な、追加の洗浄工程および/または廃棄血性または汚染された羊膜片を解決することができる。酵素インキュベーション時間も増加させることができるが、これは細胞生存度に有害であり得る。間葉細胞は、ダイジェスト時間を減少させることによって回避することができると生存能力又は汚染を減少させた。しかし、THIsは、細胞の全収率を減少させることができる。 30分〜2時間の範囲の時間は、このプロトコルのために使用することができる。これらの時間は、所望の細胞の純度及び全収率/生存率のために最適化される必要がある。この技術の1つの制限は、細胞収率または生存を増加させると互いを犠牲にして得ることである。さらに、無血清成分は​​、現在、酵素活性への曝露後の細胞生存率を維持するのに有効ではない。

細胞は、温度制御された液体窒素システムの記憶によって、細胞生存率または代謝の損失の大きな低下なしに凍結保存することができる。これは、単純なイソプロパノールを充填した低温保存装置から最先端の速度制御冷凍システムの範囲とすることができる。我々の知る限りでは、このシステムでHAECをするための最適な凍結速度は、細胞生存率および解凍後の代謝の適切なメンテナンスで1℃/分の結果が標準速度、決定されていない。解凍O間、F凍結保存した細胞を、DMSOへの細胞の露出を減らすために最小限に解凍時間を維持することが重要である。細胞が付着し、新たに単離した細胞を培養することに比べて凍結保存および解凍以下の低速度で増殖することができる。

臨床応用のためには、細胞数または下流の特徴付けのために、および/ ​​またはインビトロ操作中を増加させるために細胞を培養することが望ましい場合がある。読者は、 インビトロ操作での特定は、これらの細胞の臨床応用に関与する調節経路を変更することがありますどのように理解しておく必要があります。我々は、EpiLifeなどの動物製品を含まない培養培地はHAECを維持および拡大に適していたことを調べた。しかし、このような細胞型の増大成長率を達成するために成長因子濃度を最適化するために必要とされる。ヒトコラーゲンコーティングマトリックスを用いて、培養中の細胞付着の問題は、めっき効率を高める。しかし、長時間のE以下酵素消化へxposureめっき効率が次善になる。

要約すると、このプロトコルは、現在の適正製造基準(cGMPの)ガイドラインに従って、動物製品を含まない試薬を用いてヒト羊膜上皮細胞(HAECを)の単離および培養を容易にするために開発された。代替的な単離方法に比べてこの方法の利点は、適切な細胞収量、生存及び成長性を維持しながら、これらの細胞は、ヒトに潜在的に有害な動物病原体を送達するリスクなしに凍結保存培養し、単離し、特徴づけることができることである。臨床試験の前臨床動物研究から移動の研究のために、これらの方法は、非常に、規制当局の承認を加速するリスクを減少させ、それらの治療的細胞集団の品質を向上させる。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection Kit
Stripping tray Fisher Scientific 13-361B
Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm Fisher Scientific S17329 
Scissors - Sharp/Blunt Straight Fisher Scientific NC0562592 
Sterile latex gloves  Fisher Scientific 19-014-643 
Protective Apparel
Protective Apparel (Gown) U-line S-15374-M
Isolation gowns U-line S-15374-M
Sterile latex gloves  Fisher Scientific 19-014-643 
General purpose face mask Cardinal Health AT7511
Bonnets Medline CRI1001
Shoe covers U-line S-7873W
Media and Reagents
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175095 without calcium or magnesium
TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) Sigma Aldrich T3449
Soybean Trypsin Inhibitor  1g/50mL Sigma Aldrich T6522
Cryostor CS5 BioLife Solutions 205102
Trypan blue reagent Life Technologies 15250-061
Anti-EpCam-PE Miltenyi Biotec 130 - 091-253
PE-isotype control Miltenyi Biotec 130-098-845
Anti-CD90-PeCy5 BD Pharmingen 555597
PeCy5-isotype control BD Pharmingen 557224
Anti-CD105-APC BD Pharmingen 562408
APC-isotype control BD Pharmingen 340754
Collagen Type VI Sigma Aldrich C7521
Consumables
50 ml graduated pipette BD/Falcon 356550
10 ml graduated pipette BD/Falcon 356551
5 ml graduated pipette BD/Falcon 356543
50 ml falcon tubes BD/Falcon 352070
15 ml falcon tubes BD/Falcon 352096
15 cm Petri dishes Corning 351058
70 μm filters BD/Falcon 352350
0.22 μm filters Millipore SLGV033RS
1 ml Pipette tips Fisherbrand 02-707-401
200 μl Pipette tips Fisherbrand 02-707-409
20 ml Syringe BD/Medical 309661
Plastic spatula Fisher Scientific 14-245-97 
Plastic weighing boat Fisher Scientific 02-202-102 
Cryo vials Nunc 377267
Equipment
Mr Frosty Fisher Scientific A451-4 
Biohazard Cabinet

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References

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臨床応用のためのヒト羊膜上皮細胞の単離、凍結保存と文化
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Murphy, S. V., Kidyoor, A., Reid, T., Atala, A., Wallace, E. M., Lim, R. Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (94), e52085, doi:10.3791/52085 (2014).More

Murphy, S. V., Kidyoor, A., Reid, T., Atala, A., Wallace, E. M., Lim, R. Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (94), e52085, doi:10.3791/52085 (2014).

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