Introduction
Cellules dérivées de sources périnatales, comme le placenta, les membranes placentaires, le cordon ombilical et le liquide amniotique ont attiré l'attention des chercheurs et des cliniciens comme une source potentielle de cellules pour la médecine régénérative 1,2. La raison de cet intérêt est que ces types de cellules possèdent toutes un certain degré de plasticité et immunomodulateur capacité 3, propriétés qui sont fondamentales à leurs applications thérapeutiques potentielles.
HAECs sont une population hétérogène qui épithéliale peut être dérivé de terme ou avant terme membrane amniotique 4, fournissant une source potentielle abondante de matériel cellulaire régénérative. Les propriétés qui rendent HAECs faisant appel en tant que thérapie cellulaire comprennent leur multipotence, une faible immunogénicité, et des propriétés anti-inflammatoires. HAECs se sont révélés être très multipotentes in vitro et in vivo, capable de se différencier en lignées mésodermiques (cardiomyocytes, myocytes, ostéocytes, adipocytes), lignées endodermiques (cellules pancréatiques, les cellules hépatiques, les cellules pulmonaires) et lignages ectodermiques (cheveux, peau, cellules neurales et astrocytes) 5-10.
Rassurant, malgré leurs HAECs de multipotence ne semblent pas soit de former des tumeurs ou de promouvoir le développement de la tumeur in vivo. En outre, sont également HAECs immunitaire privilégié, exprimant de faibles niveaux de classe II antigènes de leucocytes humains courante (AcVC) 8. Cette propriété sous-tend probablement leur capacité à échapper rejet immunitaire après transplantation allogénique et xénogénique, comme l'a démontré dans des études sur des singes immunitaires compétentes, lapins, cobayes, rats et cochons 11-13. HAECs afficher immunomodulateur puissant et des propriétés immunosuppressives et offrent ainsi des avantages pratiques importants pour les applications cliniques potentielles dans la thérapie de la maladie auto-immune. HAECs sont soupçonnés d'exercer des fonctions immunomodulatrices sur les deux systèmes immunitaires innées et adaptatives. Sure des mécanismes suggérés, est par la sécrétion de facteurs immunomodulateur 14.
Les applications actuelles de HAECs dans les modèles de maladies animales précliniques comprennent le traitement des accidents vasculaires cérébraux, la sclérose en plaques, une maladie du foie, le diabète et les maladies pulmonaires chroniques et aiguës. Les chercheurs ont montré intérêt à utiliser pour traiter HAECs post-AVC inflammation du cerveau en raison de leurs propriétés uniques. Il est prouvé que HAECs peut traverser la barrière hémato-encéphalique où ils peuvent se greffer, survivre jusqu'à 60 jours, se différencier en neurones, diminuer l'inflammation et favoriser la régénération des tissus du système nerveux central endommagé dans des modèles animaux de maladies neurologiques 15.
HAECs offrent la possibilité de cibler de multiples voies et inverser pathologiques qui contribuent au développement et à la progression de la sclérose en plaques. Par exemple, les résultats provenant d'études animales précliniques suggèrent que HAECs sont fortement immunosuppressive etpeut potentiellement induire une tolérance immunitaire périphérique et inverser les réponses inflammatoires en cours. HAECs se sont également avérés avoir la capacité de se différencier en cellules neurales in vivo et améliorer neurorégénération endogène par la sécrétion d'une vaste gamme de facteurs neurotrophiques 16.
Les cellules épithéliales amniotiques humaines et de rongeurs ont déjà prouvé leur efficacité thérapeutique pour le traitement de maladie du foie chez des modèles animaux. Dans un modèle de maladie du foie, la transplantation d'haec conduisent à la prise de greffe de HAECs viables dans le foie, accompagnée d'une réduction de l'apoptose des hépatocytes dommages induction tétrachlorure de carbone, et une diminution de l'inflammation et de la fibrose hépatique 17.
HAECs peut être stimulée à des facteurs pancréatiques exprimées notamment insuline et de glucose transporteurs. Plusieurs études ont étudié le potentiel de HAECs pour rétablir les niveaux de glucose dans le sang chez les souris diabétiques 18. Chez les souris recevantHAECs, deux poids et la glycémie niveaux du corps des animaux a diminué à des niveaux normaux après l'injection des cellules. Ces études présentent un dossier solide pour l'utilisation de HAECs pour le traitement du diabète sucré.
HAECs ont un rôle avéré dans la prévention et la réparation de lésion pulmonaire aiguë et chronique expérimentale dans les deux adultes et néonatales 19 modèles. Ces études ont révélé que HAECs différencient in vitro dans des cellules epitheliales pulmonaires fonctionnel exprimant de multiples protéines pulmonaires associées, y compris Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), le canal ionique qui est muté chez les patients atteints de fibrose kystique 20. En outre, lorsque HAECs sont livrés à l'adulte lésée et du poumon néonatal, ils exercent leurs effets par l'intermédiaire de la modulation de réparation des cellules immunitaires de l'hôte, ce qui réduit le recrutement des leucocytes pulmonaire, y compris les neutrophiles, les macrophages et les lymphocytes 21-23.
Compte tenu de leur abondance,dossier de sécurité, et les applications cliniques éprouvées pour plusieurs maladies, les essais cliniques utilisant HAECs est inévitable. Dans le but d'accélérer l'application des thérapies haec en cliniques-essais, nous avons développé des méthodes pour isoler, la cryoconservation et HAECs de la culture d'une manière appropriée pour les essais cliniques, en utilisant des réactifs de libre-produits d'animaux conformément aux pratiques de fabrication actuelles bonnes (cGMP) des lignes directrices .
Nous avons fondé ce protocole un protocole déjà publié que nous utilisions avec succès pour isoler HAECs utilisant des réactifs d'origine animale 6. Nous avons modifié le protocole original pour remplacer les produits d'origine animale avec des réactifs de libre-produits animaux, et l'optimisation ultérieure a été effectuée pour optimiser le rendement de la cellule, la viabilité et la pureté. Notre objectif était de développer un protocole qui serait conforme aux normes réglementaires pour la fabrication de cellules pour des essais cliniques humains.
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Protocol
REMARQUE: Les placentas doivent être collectées auprès des grossesses saines uniques, avec une préférence pour les césariennes électives terme. Écrit, le consentement éclairé doit être donné pour la collecte de leur placenta. Votre comité d'éthique de la recherche sur les humains pertinent devrait approuver toute la collection et l'utilisation de tissus humains.
1. Isolement des cellules épithéliales Amnion
- Placez le placenta sur une surface stérile dans une enceinte de sécurité biologique de classe II.
- Utilisation écheveaux stériles solution saline équilibrée (HBSS), laver autant de sang que possible de la surface de placenta et les membranes.
- Avec le placenta placé avec le cordon ombilical vers le haut, séparer mécaniquement le bord externe de l'amnios et chorion membranes.
- Une fois séparé, enlever manuellement la membrane amniotique de la membrane chorion du placenta, de travail autour du bord de la membrane, vers le cordon ombilical.
NOTE: Soyez CAREFul pour enlever les morceaux de contaminer membrane chorion de l'amnios. - Avec des ciseaux stériles, couper la membrane amniotique d'environ 2 cm de la base du cordon ombilical et le placer dans un récipient fermé 500 ml contenant 250 ml de HBSS.
- Laver soigneusement en agitant la bouteille scellée contenant la membrane amniotique.
- Retirer la membrane amniotique du récipient de collection à l'aide de pinces stériles, et les placer dans un plat 15 cm Petri.
- Couper la membrane amniotique en morceaux d'environ 5 cm de long (lorsqu'on la tient verticalement avec une pince), en écartant morceaux sanglants ou déchirés.
- Placer dans un récipient scellé 500 ml et laver avec 250 ml de HBSS environ 3-5 fois ou jusqu'à ce que la membrane amniotique devient translucide sans contaminer le sang.
NOTE: Toute présence de sang peut réduire l'efficacité de la solution enzymatique digérer. - Transférer tous les morceaux de membrane amniotique dans un récipient contenant 50 ml de la solution enzymatique digérer, en prenant soin deminimiser report de HBSS.
- Incuber les pièces amnios dans enzymatique digèrent solution dans un bain d'eau ou salle chaude à 37 ° C pendant 15 min en agitant doucement pour enlever tout reste de sang.
- Retirez les morceaux de membrane amnios de la solution enzymatique digérer et placer dans un nouveau récipient stérile.
- Ajouter 100 ml de solution enzymatique frais digérer à la membrane amniotique et incuber à 37 ° C pendant 60 min dans un bain d'eau ou salle chaude avec agitation douce (première digestion).
- Retirez les morceaux de membrane amnios et le placer dans une nouvelle prise de conteneurs soins pour permettre à la digestion enzymatique solution se écouler depuis chaque pièce de la membrane.
NOTE: On peut y parvenir en faisant glisser les pièces amnios le long du bord intérieur du récipient. - Ajouter 100 ml de solution enzymatique frais digérer les morceaux de membrane amnios et incuber 60 min dans un bain d'eau ou salle chaude à 37 ° C avec agitation douce (seconde digestion).
- Passez le suspensi cellulaireà partir de l'étape à travers un filtre 1,14 um et 70 centrifuger à 1000 g pendant 10 min.
- Retirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de HBSS contenant un inhibiteur à base de soja 1 mg / ml enzyme. Pipeter doucement plusieurs fois avec une pipette de 1 ml pour obtenir une suspension cellulaire unique.
NOTE: A ce stade, les cellules peuvent être laissées sur la glace jusqu'à ce que les cellules de la seconde digestion sont au même stade de transformation. - Retirez les morceaux de membrane amnios et le placer dans une nouvelle prise de conteneurs soins pour permettre à la digestion enzymatique solution se écouler depuis chaque pièce de la membrane.
NOTE: On peut y parvenir en faisant glisser les pièces amnios le long du bord intérieur du récipient. - Faire passer la suspension de cellules provenant de l'étape à travers un filtre 1,18 um et 70 centrifuger à 1000 g pendant 10 min.
- Retirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de HBSS contenant un inhibiteur à base de soja 1 mg / ml enzyme. Pipette doucement à plusieurs reprises avec un 1 ml de pipette pour obtenir une suspension cellulaire unique.
- Piscine cellules des deux recueils ou encore les garder digère cellulaires séparés qu'après le nombre de cellules.
NOTE: Cela empêche le mélange des cellules de viabilité potentiellement faibles avec des cellules de haute viabilité. - Ajouter HBSS à un volume final de 10 à 20 ml et effectuer le nombre de cellules en utilisant du bleu trypan pour mesurer la viabilité.
- Confirmez le phénotype des cellules épithéliales par cytométrie de flux. Compléter à l'aide des cocktails d'anticorps appropriés anti-EpCAM-PE (dilution 1: 2) anti-CD90-PECy5 (1: 250) et anti-CD105-APC (1: 100) dans du HBSS.
- Remettre en suspension un sous-ensemble de cellules de l'une ou des deux produits de digestion dans le cocktail d'anticorps à une concentration de 25 x 10 6 cellules / ml.
- Pour la cytométrie de flux, une tache x 10 6 cellules avec des cocktails d'anticorps contenant contrôles isotypiques (ex. Contrôle-PE IgG + 1 isotype anti-CD90-PECy5 + anti-CD105-APC). Gardez ~ 1 x 10 6 cellules non colorées pour cytomètre de flux set-up.
- Incuber les cellules à un anticorpscocktails à 4 ° C pendant 60 min.
- Laver les cellules 3x dans HBSS et remettre en suspension de 5 à 10 millions de cellules par ml pour cytométrie de flux.
- Effectuer cytométrie de flux et les résultats de note. La pureté de l'isolât de cellule (le pourcentage d'EpCAM positif et CD90 / CD105 cellules négatives) devrait être de 90 à 95% et <1%, respectivement.
- Mettez de côté un nombre approprié de cellules pour tester les critères de contrôle de la qualité ou de libération appropriées tel que déterminé par application finale.
NOTE: Cela peut inclure la maladie / dépistage viral, ou autre sécurité ou des critères biologiques. - Pour les cellules restantes, suivre le protocole de cryoconservation, ou encore placer directement dans la culture (directe à la culture étape 3.6).
2. Cryoconservation de HAECs
- Déterminer le nombre et la viabilité cellulaire en utilisant la cytométrie de flux de données ou de comptage manuel avec exclusion au bleu trypan.
- Centrifuger à 700 g pendant 5 min.
- Remettre en suspension cellulaires entre 1-10000000 cellules par ml chez l'animal médias de cryoconservation produit-libre.
- Pipeter un volume approprié de cellules dans des flacons de cryoconservation O-anneaux et placer dans un appareil de congélation à vitesse contrôlée dans lequel le refroidissement se produit à environ 1 ° C / min jusqu'à -80 ° C soit atteinte.
- Transfert flacons dans l'azote liquide pour le stockage à long terme.
3. La décongélation et la culture de Cyropreserved HAECs
- Retirer flacons de cryoconservation de l'azote liquide et placer sur la glace.
NOTE: Pour le transfert seulement - procéder rapidement à l'étape suivante. - Décongeler les flacons de cryoconservation rapidement à 37 ° C jusqu'à ce que seulement un petit morceau (~ 5 mm x 5 mm) de glace reste.
NOTE: Il est important que la solution de cellules ne réchauffe pas pour réduire les effets toxiques de DMSO dans les médias de cryoconservation. - Diluer médias de cryoconservation 10 fois avec (~ 4 ° C) les médias sans sérum froid, goutte à goutte dans une taille appropriée ajoutéetube d ou conteneur.
- Centrifuger à 700 g pendant 5 min à température ambiante.
- Remettre en suspension dans du milieu exempt de sérum, à une concentration approximative de 1 million de cellules par ml. Déterminer le nombre et la viabilité cellulaire en utilisant un comptage automatique ou manuel avec exclusion au bleu trypan. Prévue viabilité post-dégel sera 5-10% de moins que pré-cryoconservation viabilité.
- cellules de la plaque sur la culture traitée articles en plastique cellulaire standard, ou encore utiliser collagène de type I sur les surfaces de culture de manteau.
- Pour collagène de type I revêtement suivre le protocole ci-dessous
- Préparer acide soluble collagène de type I à partir de placenta humain (15 mg de collagène avec 25 ml d'eau désionisée et 50 ul d'acide acétique glacial).
- Couvrir bécher avec Parafilm et remuez modérément à 37 ° C jusqu'à brins de collagène sont dissous.
- Solution de collagène filtre stérile en utilisant un filtre de 0,22 um.
- Diluer le collagène filtrée stocks 1:10 avec de l'eau déminéralisée. Ce stock est diluée la conce travailntration solution pour les surfaces en matière plastique et la membrane de revêtement.
- Collagène couche plastique, les surfaces en verre et la membrane pendant 2 heures à la température ambiante à 37 ° C, ou O / N à 2-8 ° C.
- Retirer l'excès de liquide de la surface revêtue, et laisser sécher O / N.
- Rincer à l'eau stérile de qualité culture de tissu ou HBSS avant d'introduire cellules et le milieu.
- HAECs Plate à une densité de 25 000 cellules / cm2 dans un milieu sans sérum, et permettent l'attachement à se produire pour 72-96 h.
- À la suite de l'attachement, changer de support par aspiration avec précaution et le remplacer par un volume de milieu sans sérum approprié tous les 2-3 jours.
- Passage cellules utilisant le protocole ci-dessous
- Aspirer milieux de culture de cellules et laver avec 1x volume de HBSS stérile
- Ajouter le volume 1x solution de digestion enzymatique et incuber pendant 5 à 15 min, ou jusqu'à ce que les cellules sont observées détachant de la surface de culture cellulaire.
- Récupérer enzymatique digérer solution contenant des cellules, assurant CElls sont détachées de la surface de culture de cellules en pipetant plusieurs fois la solution de digestion enzymatique sur la surface de culture cellulaire
- Centrifuger à 700 g pendant 5 min.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume de HBSS contenant un inhibiteur approprié à base de soja 1 mg / ml de l'enzyme. Pipeter doucement plusieurs fois avec une pipette de 1 ml pour obtenir une suspension cellulaire unique.
- Ajouter du milieu sans sérum à une concentration approximative de 1 million de cellules / ml. Déterminer le nombre et la viabilité cellulaire en utilisant un comptage automatique ou manuel avec exclusion au bleu trypan.
- HAECs Plate à une densité de 25 000 cellules / cm2 dans un milieu sans sérum, et continuent avec les méthodes de culture standard.
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Representative Results
Lorsque cette procédure est correctement suivie, un rendement moyen de 120 millions de HAECs devrait se attendre, avec une gamme typique de 80 à 160.000.000 cellules. De ces rendements, une viabilité moyenne de 83 ± 4% peut être attendue. Le rendement augmenté et la viabilité moyenne légèrement inférieure à la méthode clinique peut être due à l'activité de la trypsine élevé que le produit d'origine animale, et peut-être également en raison de l'absence de protéines sériques. HAECs isolés ont un profil de surface de cellule moyenne de 92% de cellules positives à EpCAM <1% CD90, CD105 cellules positives pour le marqueur mésenchymateux. Ces marqueurs ont été sélectionnés en raison de leur spécificité pour épithéliales et mésenchymateuses 24,25 26 lignées respectivement. Ce processus peut prendre environ 4-5 heures pour compléter (Figure 1).
La cryoconservation nécessite de 20 à 60 min en fonction du nombre de flacons et le rendement de la cellule finale. Nous avons déjà testé une gamme de supports de cryoconservation et trouvéque des médias libres de produits-plusieurs animaux exécutent convenablement, mais la concentration de DMSO optimale est d'environ 5-10%. Typiquement on peut se attendre l'après-dégel de viabilité soit 5-10% de moins que pré-cryoconservation viabilité, et cette perte peut être significativement plus grande pour l'utilisateur inexpérimenté (Figure 2).
La culture cellulaire peut être réalisée avec HAECs pour permettre la caractérisation, la différenciation ou l'autre spécifique dans les procédures in vitro. Ces cellules se fixent initialement à la surface des cellules avec une efficacité de 50 à 80% (observation personnelle). Cela augmente à 70-90% avec des passages subséquents. Attachement peut être augmentée par l'utilisation de matériaux de revêtement de surface telles que le collagène de type I des produits similaires, ou. HAECs maintiennent leur phénotype épithélial dans les milieux de culture sans sérum (Figure 3). Nous avons trouvé des changements significatifs dans les profils de marqueurs de surface cellulaire suivants passage répété. En outre, après environ cinq passages HAECs peuvent Either atteindre la sénescence, ou passer par des changements morphologiques compatibles avec la transition épithélio-mésenchymateuses. Après passage répété, HAECs maintenir un caryotype normal, la longueur des télomères longs et la distribution du cycle cellulaire. Ces propriétés indiquent un faible risque de transformation ou de tumorigène. En plus de posséder des propriétés de régulation anti-inflammatoires et immunitaires, HAECs se sont révélés être très multipotentes in vitro et in vivo, se différencier en lignées cellulaires représentatives des trois feuillets embryonnaires primaires (Figure 4).
Figure 1:. Rendement prévu cellulaire, de la viabilité et de la pureté de protocole d'isolement clinique cellules et la viabilité des rendements similaires peuvent être obtenus en utilisant des produits animaux libres réactifs par rapport aux méthodes contenant le produit animaux standard. Un isolement typique devrait être> 90% EpCAM et <1% CD90 / CD105 positifcellules. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:.. Poster dégel viabilité et le métabolisme pour les médias de cryoconservation sérum contenant et sans sérum rapport à FBS contenant 10% de DMSO, disponibles dans le commerce des médias de cryoconservation animaux produit-libre ont montré la viabilité post-dégel similaire ou accru et le métabolisme Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: l'attachement et la croissance typique profil de HAECs en cul de cellules sans sérum et contenant du sérumture moyenne. milieux de culture produit-libre les animaux ont montré fixation appropriée cellulaire, la prolifération, et l'entretien de phénotype épithélial. Cependant le développement de milieux sans sérum est nécessaire pour obtenir des résultats égaux aux médias contenant du sérum. Barres d'échelle représentent 500 um.
Au début du passage, il a été démontré HAECs de se différencier en de multiples lignées cellulaires représentatives des trois feuillets embryonnaires primaires de différenciation multipotentes HAECs: Figure 4.. Ces lignées comprennent, mais ne sont pas limités à; les neurones, les cellules de cheveux et la peau, épithélium pulmonaire, cardiomyocytes, les hépatocytes, cellules pancréatiques, ostéocytes et les adipocytes. (Figure adaptée de 27)
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Discussion
Il ya plusieurs paramètres critiques qui peuvent avoir un impact important dans le succès de cette méthodologie. Stockage du placenta ou amnios jusqu'à 3 heures avant l'isolement du HAECs peut être souhaitable à des fins logistiques ou d'horaires, il est toutefois recommandé que le tissu est traité dès que possible. Si le tissu doit être stocké, il est recommandé que le stockage est effectué après dissection et de lavage de la membrane amniotique. Amnios peut être stocké dans HBSS contenant des antibiotiques stériles à 4 ° C, mais la viabilité des cellules peut diminuer avec le temps de stockage prolongé. Nous, et d'autres avons trouvé variabilité du rendement et la viabilité cellulaire, et de minimiser cette variabilité, il est recommandé que le placenta sont recueillies auprès de naissances à terme en bonne santé, de préférence, accouchement par césarienne.
Nous avons trouvé que la contamination de la membrane amniotique avec les globules entraîne l'inhibition de l'activité enzymatique et une diminution du rendement de la cellule. Doncune étape critique dans le protocole est un lavage soigneux du placenta et la membrane amniotique est recommandé. Il est recommandé que le tissu de l'amnios être lavé jusqu'à ce qu'il apparaisse blanc / clair pour éviter l'inhibition de l'enzyme en aval. Isolement d'une population relativement homogène de cellules épithéliales est important pour les tests de caractérisation et contrôle de la qualité.
Si de faibles rendements, la viabilité ou la contamination du rendement cellulaire avec des cellules mésenchymateuses se produit il ya plusieurs modifications qui peuvent être effectuées pour le dépannage. Si les rendements cellulaires sont faibles, il est probable que l'activité enzymatique est inhibée en raison de la contamination du sang ou du sérum. Cela peut être résolu avec des étapes de lavage plus approfondies et supplémentaires et / ou de jeter des morceaux de amnios sanglantes ou contaminés. Enzyme temps d'incubation peut également être augmentée, mais cela peut être préjudiciable à la viabilité des cellules. Diminution de la viabilité ou de la contamination avec des cellules mésenchymateuses peuvent être évités en diminuant le temps de digestion. Cependant, this peut également diminuer le rendement total de cellules. Les temps allant de 30 min à 2 heures peuvent être utilisées pour ce protocole. Ces temps doivent être optimisés pour la pureté cellulaire souhaité et le rendement total / viabilité. Une limitation de cette technique est que l'augmentation du rendement ou de la viabilité cellulaire peuvent se faire au détriment de l'autre. En outre, les composants sans sérum ne sont actuellement pas aussi efficace de maintenir la viabilité des cellules après une exposition à l'activité enzymatique.
Les cellules peuvent être cryoconservés sans diminution importante de la viabilité des cellules ou de la perte de métabolisme par stockage dans un système d'azote liquide à température contrôlée. Cela peut aller d'un dispositif de cryoconservation de l'isopropanol rempli simple à un système state-of-the-art contrôlée vitesse de congélation. À notre connaissance, le taux de congélation optimale pour HAECs dans ce système n'a pas été déterminée, mais le taux standard de 1 ° C / min résultats dans l'entretien convenable de la viabilité des cellules et le métabolisme post-dégel. Pendant la décongélation of cellules congelées, est important pour garder le temps de décongélation au minimum pour réduire l'exposition des cellules au DMSO. Les cellules peuvent se fixer et proliférer à un rythme plus faible après cryoconservation et la décongélation par rapport à la culture de cellules fraîchement isolées.
Pour une application clinique, il peut être souhaitable de cultiver des cellules pour augmenter le nombre de cellules ou en aval pour la caractérisation et / ou la manipulation in vitro. Les lecteurs doivent comprendre comment leur propre manipulation in vitro pourrait modifier les voies de régulation impliqués dans l'application clinique de ces cellules. Nous avons étudié qu'un milieu de culture animale produit-libre comme EpiLife était approprié pour le maintien et l'expansion de HAECs. Cependant, il est nécessaire d'optimiser les concentrations de facteurs de croissance pour obtenir des vitesses de croissance accrues pour ce type cellulaire. Le problème de l'adhérence des cellules au cours de la culture en utilisant une matrice de collagène humain revêtement, augmente l'efficacité de plaquage. Toutefois, à la suite e prolongéexposition à une digestion enzymatique de l'efficacité de placage sera sous-optimale.
En résumé, ce protocole a été développé pour faciliter l'isolement et la culture de cellules humaines épithéliales amniotiques (de HAECs) en utilisant des réactifs de libre-produits animaux conformément aux pratiques de fabrication actuelles (cGMP) de bonnes lignes directrices. L'avantage de cette méthode par rapport aux méthodes d'isolement de rechange, ce est que ces cellules peuvent être isolées, caractérisé, cryoconservé et mis en culture sans risque de délivrer des agents pathogènes animaux potentiellement nocifs pour l'être humain, tout en maintenant des rendements cellulaires appropriées, les viabilités et le potentiel de croissance. Pour les chercheurs mobiles provenant d'études animales précliniques aux essais cliniques, ces méthodes seront grandement accélérer l'approbation réglementaire, réduire les risques et améliorer la qualité de leur population cellulaire thérapeutique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
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