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Medicine

अलगाव, cryopreservation और संस्कृति नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए मानव भ्रूणावरण उपकला कोशिकाओं

Published: December 21, 2014 doi: 10.3791/52085
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2
1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest University Health Sciences, 2The Ritchie Centre, Monash Institute of Medical Research, Monash University

Introduction

इस तरह के नाल के रूप में प्रसवकालीन सूत्रों का कहना है, अपरा झिल्ली, गर्भनाल और एमनियोटिक द्रव से ली गई कोशिकाओं पुनर्योजी चिकित्सा 1,2 के लिए कोशिकाओं का एक संभावित स्रोत के रूप में शोधकर्ताओं और चिकित्सकों से ध्यान आकर्षित किया है। इस ब्याज के लिए कारण इन प्रकार की कोशिकाओं के सभी plasticity और immunomodulatory क्षमता 3, उनके संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए मौलिक हैं कि संपत्तियों के कुछ डिग्री के अधिकारी हैं।

hAECs पुनर्योजी सेलुलर सामग्री का एक प्रचुर मात्रा में संभावित स्रोत उपलब्ध कराने, शब्द या पूर्व अवधि भ्रूणावरण झिल्ली 4 से प्राप्त किया जा सकता है कि एक विषम उपकला आबादी हैं। एक सेलुलर चिकित्सा के रूप में अपील hAECs बनाने के गुण है कि उनके multipotency, कम प्रतिरक्षाजनकता, और विरोधी भड़काऊ गुण शामिल हैं। hAECs (अत्यधिक, इन विट्रो में और vivo में दोनों multipotent mesodermal प्रजातियों में फर्क करने में सक्षम होने के लिए cardiom पाया गया हैyocytes, myocytes, osteocytes, adipocytes), endodermal प्रजातियों (अग्नाशय कोशिकाओं, यकृत कोशिकाओं, फेफड़ों की कोशिकाओं) और बहिर्जनस्तरीय प्रजातियों (बाल, त्वचा, तंत्रिका कोशिकाओं और astrocytes) 5-10।

Reassuringly, उनके multipotency hAECs या तो फार्म ट्यूमर दिखाई देते हैं या vivo में ट्यूमर के विकास को बढ़ावा देने के लिए नहीं है के बावजूद। इसके अलावा, hAECs भी वर्ग द्वितीय मानव ल्युकोसैट एंटीजन (HLAs) 8 के निम्न स्तर व्यक्त विशेषाधिकार प्राप्त प्रतिरक्षा हैं। इस संपत्ति की संभावना प्रतिरक्षा सक्षम बंदर, खरगोश, गिनी सूअरों, चूहों, और सूअरों 11-13 का उपयोग अध्ययन में प्रदर्शन के रूप में, अल्लोजीनिक और xenogenic प्रत्यारोपण के बाद प्रतिरक्षा अस्वीकृति से बचने के लिए अपनी क्षमता underlies। hAECs शक्तिशाली immunomodulatory और प्रतिरक्षादमनकारी गुणों को प्रदर्शित करने और इस प्रकार autoimmune रोग के उपचार में संभावित नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण व्यावहारिक लाभ प्रदान करते हैं। hAECs दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली पर immunomodulatory कार्यों को लागू करने के लिए माना जाता है। परimmunomodulatory के स्राव को 14 कारकों के माध्यम से सुझाव दिया तंत्र, के ई है।

पूर्व नैदानिक ​​पशु रोग मॉडल में hAECs की वर्तमान अनुप्रयोगों स्ट्रोक, एकाधिक काठिन्य, जिगर की बीमारी, मधुमेह और पुराने और तीव्र फेफड़ों के रोगों के उपचार में शामिल हैं। शोधकर्ताओं के कारण उनके अद्वितीय गुण पोस्ट-स्ट्रोक मस्तिष्क में सूजन के इलाज के लिए hAECs का प्रयोग करने में दिलचस्पी दिखाई है। HAECs, वे टीका लगाना कर सकते हैं जहां रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने के लिए 60 दिनों के लिए जीवित है, न्यूरॉन्स में अंतर, सूजन कम होती है और मस्तिष्क संबंधी बीमारियों 15 के पशु मॉडल में क्षतिग्रस्त केंद्रीय तंत्रिका तंत्र ऊतक के उत्थान को बढ़ावा देने के कर सकते हैं कि सबूत नहीं है।

hAECs लक्ष्य और मल्टीपल स्केलेरोसिस के विकास और प्रगति में योगदान देने वाले कई रोग रास्ते रिवर्स करने की क्षमता प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, पूर्व नैदानिक ​​जानवरों के अध्ययन से यह परिणाम hAECs जोरदार प्रतिरक्षादमनकारी हैं सुझाव है कि औरसंभवतः परिधीय प्रतिरक्षा सहिष्णुता प्रेरित चल रही है और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं पलट सकता है। hAECs भी विवो में तंत्रिका कोशिकाओं में अंतर और neurotrophic का एक विशाल सरणी 16 कारकों का स्राव के माध्यम से अंतर्जात neuroregeneration बढ़ाने की क्षमता है करने के लिए दिखाया गया है।

मानव और कृंतक भ्रूणावरण उपकला कोशिकाओं पहले से ही पशु मॉडल में जिगर की बीमारी के इलाज के लिए उनके चिकित्सीय प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है। कम hepatocyte apoptosis के साथ साथ यकृत रोग, जिगर में व्यवहार्य hAECs के engraftment को hAEC प्रत्यारोपण सीसा, के एक कार्बन टेट्राक्लोराइड क्षति प्रेरण मॉडल, और यकृत में सूजन और फाइब्रोसिस 17 की कमी हुई।

hAECs इंसुलिन और ग्लूकोज ट्रांसपोर्टरों सहित व्यक्त अग्नाशय के कारकों के लिए प्रेरित किया जा सकता है। कई अध्ययनों से मधुमेह चूहों 18 में रक्त शर्करा के स्तर को बहाल करने के लिए hAECs के लिए क्षमता की जांच की है। चूहों में प्राप्तhAECs, दोनों पशु शरीर के वजन और रक्त शर्करा का स्तर कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद सामान्य स्तर तक कम किया है। इन अध्ययनों से मधुमेह के इलाज के लिए hAECs के उपयोग के लिए एक मजबूत मामला प्रस्तुत करते हैं।

hAECs वयस्क और नवजात मॉडल 19 दोनों में रोकथाम और प्रयोगात्मक तीव्र और जीर्ण फेफड़ों की चोट की मरम्मत में एक सिद्ध भूमिका है। इन अध्ययनों hAECs सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane प्रवाहकत्त्व नियामक (CFTR), सिस्टिक फाइब्रोसिस 20 के साथ रोगियों में उत्परिवर्तित है कि आयन चैनल सहित कई फेफड़ों जुड़े प्रोटीन, व्यक्त कार्यात्मक फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं में इन विट्रो में अंतर पाया। HAECs घायल वयस्क और नवजात फेफड़ों के लिए दिया जाता है साथ ही, जब वे न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज और लिम्फोसाइटों 21-23 सहित फेफड़े ल्युकोसैट भर्ती, कम करने, मेजबान प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मॉडुलन के माध्यम से अपने विरोहक प्रभाव डालती है।

उनकी बहुतायत को देखते हुए,सुरक्षा रिकॉर्ड, और कई बीमारियों के लिए सिद्ध नैदानिक ​​अनुप्रयोगों, hAECs का उपयोग कर क्लिनिकल परीक्षण अनिवार्य है। नैदानिक ​​परीक्षणों में hAEC उपचारों के अनुवाद को तेज करने के लक्ष्य के साथ, हम वर्तमान विनिर्माण आचरण अच्छा है (cGMP) के दिशा निर्देशों के अनुसार पशु उत्पाद मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग कर, क्लिनिकल परीक्षण के लिए उपयुक्त ढंग से संस्कृति hAECs, अलग-थलग cryopreserve और करने के तरीके विकसित ।

हम इस प्रोटोकॉल हम पशु व्युत्पन्न अभिकर्मकों 6 का उपयोग कर hAECs अलग करने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल कर रहे थे कि एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल आधारित है। हम पशु उत्पाद मुक्त अभिकर्मकों के साथ पशु व्युत्पन्न उत्पादों को बदलने के लिए मूल प्रोटोकॉल बदल दिया, और बाद में अनुकूलन सेल उपज, व्यवहार्यता और पवित्रता का अनुकूलन करने के लिए प्रदर्शन किया था। हमारा लक्ष्य मानव चिकित्सीय परीक्षण के लिए कक्ष निर्माण के लिए नियामक मानकों का पालन होता है कि एक प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए किया गया था।

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Protocol

नोट: अपरा अवधि वैकल्पिक शल्यक्रिया वर्गों के लिए एक प्राथमिकता के साथ, सिंगलटन स्वस्थ गर्भधारण से एकत्र किया जाना चाहिए। लिखा, सूचित सहमति उनके नाल के संग्रह के लिए दी जानी चाहिए। अपने प्रासंगिक मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के अनुमोदन के सभी संग्रह और मानव ऊतकों का उपयोग करना चाहिए।

भ्रूणावरण उपकला कोशिकाओं के 1. अलगाव

  1. एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर एक बाँझ सतह पर नाल रखें।
  2. बाँझ हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HbSS) का उपयोग करना, नाल सतह और झिल्ली से जितना संभव हो उतना खून धो लें।
  3. गर्भनाल का सामना करना पड़ के साथ रखा अपरा के साथ, यंत्रवत् भ्रूणावरण और जरायु झिल्ली के बाहरी छोर अलग।
  4. अलग कर लेते हैं, तो मैन्युअल रूप से गर्भनाल की ओर, झिल्ली के किनारे के आसपास काम कर रहे हैं, नाल का जरायु झिल्ली से भ्रूणावरण झिल्ली पट्टी।
    नोट: caref रहोउल भ्रूणावरण से जरायु झिल्ली contaminating के किसी टुकड़े को दूर करने के लिए।
  5. बाँझ कैंची का प्रयोग, 250 मिलीलीटर HBSS युक्त कंटेनर सील एक 500 मिलीलीटर में गर्भनाल और जगह के आधार से लगभग 2 सेमी भ्रूणावरण झिल्ली में कटौती।
  6. भ्रूणावरण झिल्ली युक्त सीलबंद बोतल झटकों से अच्छी तरह धो लें।
  7. एक 15 सेमी पेट्री डिश में संग्रह बाँझ संदंश का उपयोग कंटेनर, और जगह से भ्रूणावरण झिल्ली को हटा दें।
  8. खूनी या फटे टुकड़े discarding, (संदंश के साथ खड़ी आयोजित जब) लगभग 5 सेमी लंबे टुकड़ों में भ्रूणावरण झिल्ली कट।
  9. एक 500 मिलीलीटर में जगह कंटेनर सील और 250 मिलीलीटर HBSS के साथ लगभग 3-5 बार धोने या भ्रूणावरण झिल्ली कोई दूषित रक्त के साथ पारदर्शी हो जाता है जब तक।
    नोट: कोई खून उपस्थित समाधान पचाने एंजाइमी की क्षमता को कम कर सकते हैं।
  10. देखभाल करने के लिए ले जा रही है, समाधान पचाने एंजाइमी के 50 मिलीग्राम से युक्त एक कंटेनर में भ्रूणावरण झिल्ली के सभी टुकड़ों को स्थानांतरणHBSS के भार को कम से कम।
  11. किसी भी शेष रक्त को हटाने के लिए कोमल आंदोलन के साथ 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान या गर्म कमरे में समाधान पचाने एंजाइमी में भ्रूणावरण टुकड़े सेते हैं।
  12. एक नया बाँझ कंटेनर में समाधान और जगह पचाने एंजाइमी से भ्रूणावरण झिल्ली टुकड़े निकालें।
  13. ताजा एंजाइमी की 100 मिलीलीटर भ्रूणावरण झिल्ली का हल पचाने और एक पानी के स्नान या कोमल मिलाते (पहली पाचन) के साथ गर्म कमरे में 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते जोड़ें।
  14. भ्रूणावरण झिल्ली टुकड़े निकालें और एंजाइमी झिल्ली के एक टुकड़े से नाली का हल पचाने की अनुमति देने के लिए नए कंटेनर देखभाल में जगह है।
    नोट: इस कंटेनर के अंदर रिम साथ भ्रूणावरण टुकड़े खींच कर प्राप्त किया जा सकता है।
  15. ताजा एंजाइमी की 100 मिलीलीटर भ्रूणावरण झिल्ली टुकड़े करने के लिए समाधान को पचाने और कोमल मिलाते (दूसरी पाचन) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान या गर्म कमरे में 60 मिनट सेते जोड़ें।
  16. सेल suspensi दर्रा10 मिनट के लिए 1000 XG पर एक 70 माइक्रोन फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से कदम 1.14 से पर।
  17. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन आधारित एंजाइम अवरोध करनेवाला युक्त 4 मिलीलीटर HBSS में सेल गोली resuspend। धीरे से एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ बार-बार विंदुक।
    नोट: दूसरा डाइजेस्ट से कोशिकाओं के प्रसंस्करण का एक ही स्तर पर कर रहे हैं जब तक इस स्तर पर कोशिकाओं बर्फ पर छोड़ा जा सकता है।
  18. भ्रूणावरण झिल्ली टुकड़े निकालें और एंजाइमी झिल्ली के एक टुकड़े से नाली का हल पचाने की अनुमति देने के लिए नए कंटेनर देखभाल में जगह है।
    नोट: इस कंटेनर के अंदर रिम साथ भ्रूणावरण टुकड़े खींच कर प्राप्त किया जा सकता है।
  19. 10 मिनट के लिए 1000 XG पर एक 70 माइक्रोन फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से कदम 1.18 से सेल निलंबन से गुजरती हैं।
  20. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन आधारित एंजाइम अवरोध करनेवाला युक्त 4 मिलीलीटर HBSS में सेल गोली resuspend। धीरे से एक 1 मिलीलीटर पी के साथ बार-बार पिपेटएक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए ipette।
  21. दो हज़म या वैकल्पिक रूप से पूल कोशिकाओं कोशिकाओं की गिनती के बाद जब तक अलग हो सेल हज़म रहते हैं।
    नोट: इस उच्च व्यवहार्यता कोशिकाओं के साथ संभावित कम व्यवहार्यता कोशिकाओं के मिश्रण से बचाता है।
  22. 10-20 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए HBSS जोड़ें और व्यवहार्यता को मापने के लिए trypan नीले रंग का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती करते हैं।
  23. फ्लो द्वारा उपकला कोशिका फेनोटाइप पुष्टि करें। विरोधी EpCAM पीई का उपयोग कर उचित एंटीबॉडी कॉकटेल अप (1: 2 के कमजोर पड़ने) विरोधी CD90-PeCy5 (1: 250) और विरोधी CD105-एपीसी (1: 100) HBSS में।
  24. 25 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में एक से कोशिकाओं या एंटीबॉडी कॉकटेल में दोनों हज़म के एक सबसेट Resuspend।
  25. प्रवाह cytometry, दाग निर्धारण नियंत्रण युक्त एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के लिए (जैसे। आईजीजी एक निर्धारण नियंत्रण पीई + विरोधी CD90-PeCy5 + विरोधी CD105-एपीसी)। सेट-अप प्रवाह के लिए बेदाग ~ 1 x 10 6 कोशिकाओं रखें।
  26. एंटीबॉडी में कोशिकाओं को सेते60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कॉकटेल।
  27. धो कोशिकाओं प्रवाह cytometry के लिए मिलीलीटर प्रति 5-10,000,000 कोशिकाओं पर HBSS और resuspend में 3x।
  28. फ्लो और नोट परिणामों प्रदर्शन करते हैं। सेल को अलग (EpCAM सकारात्मक और CD90 / CD105 नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत) की पवित्रता क्रमशः 90-95% और <1% होने की उम्मीद है।
  29. अंतिम आवेदन द्वारा निर्धारित रूप में उपयुक्त गुणवत्ता नियंत्रण या रिहाई के मानदंड के परीक्षण के लिए एक तरफ कोशिकाओं का एक उपयुक्त संख्या निर्धारित करें।
    नोट: यह रोग / वायरल स्क्रीनिंग, या अन्य सुरक्षा या जैविक मानदंड शामिल कर सकते हैं।
  30. शेष कोशिकाओं के लिए, cryopreservation प्रोटोकॉल का पालन करें, या वैकल्पिक रूप से (संस्कृति कदम 3.6 करने के लिए प्रत्यक्ष) संस्कृति में सीधे जगह है।

HAECs 2. cryopreservation

  1. डेटा या trypan नीले बहिष्कार के साथ मैनुअल गिनती प्रवाह cytometry का उपयोग सेल नंबर और व्यवहार्यता का निर्धारण।
  2. 5 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. Resuspend सेलपशु उत्पाद मुक्त cryopreservation मीडिया में मिलीलीटर प्रति 1-10,000,000 कोशिकाओं के बीच है।
  4. हे चक्राकार cryopreservation शीशियों में कोशिकाओं का एक उपयुक्त मात्रा पिपेट और ठंडा करने में लगभग होता है जहां एक नियंत्रित दर ठंड तंत्र में जगह 1 डिग्री सेल्सियस / मिनट तक -80 सी हासिल की है °।
  5. लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में शीशियों स्थानांतरण।

Cyropreserved hAECs 3. विगलन और संस्कृति

  1. तरल नाइट्रोजन से cryopreservation शीशियों निकालें और बर्फ पर जगह है।
    नोट: केवल हस्तांतरण के लिए - अगले कदम के लिए तेजी से आगे बढ़ें।
  2. बर्फ बनी हुई है की केवल एक छोटा सा टुकड़ा (~ 5 मिमी एक्स 5 मिमी) तक 37 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से cryopreservation शीशियों गला लें।
    नोट: यह सेल समाधान cryopreservation मीडिया में DMSO के जहरीले प्रभाव को कम करने के लिए गर्म नहीं है कि महत्वपूर्ण है।
  3. ठंड (~ 4 डिग्री सेल्सियस) सीरम मुक्त मीडिया के साथ cryopreservation मीडिया 10 गुना पतला, बूंद-वार एक उपयुक्त आकार में जोड़ाडी ट्यूब या कंटेनर।
  4. आरटी पर 5 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. मिलीलीटर प्रति 1 लाख कोशिकाओं की एक अनुमानित एकाग्रता के लिए, सीरम मुक्त माध्यम में Resuspend। Trypan नीले बहिष्कार के साथ स्वचालित या मैनुअल गिनती का उपयोग करते हुए सेल नंबर और व्यवहार्यता का निर्धारण। उम्मीद की व्यवहार्यता के बाद पिघलना पूर्व cryopreservation व्यवहार्यता की तुलना में 5-10% से भी कम हो जाएगा।
  6. प्लेट मानक सेल संस्कृति का इलाज प्लास्टिक के बर्तन पर कोशिकाओं, या वैकल्पिक रूप से उपयोग प्रकार मैं कोट संस्कृति सतहों कोलेजन।
  7. प्रकार मैं कोलेजन कोटिंग के लिए नीचे प्रोटोकॉल का पालन करें
    1. मानव प्लेसेंटा (25 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी और 50 μl हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ 15 मिलीग्राम कोलेजन) से एसिड घुलनशील प्रकार मैं कोलेजन तैयार करें।
    2. Parafilm के साथ बीकर कवर और कोलेजन किस्में भंग कर रहे हैं जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर मामूली हलचल।
    3. 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर बाँझ फिल्टर कोलेजन समाधान।
    4. विआयनीकृत पानी के साथ फ़िल्टर्ड कोलेजन स्टॉक 01:10 पतला। यह पतला शेयर काम कर conce हैकोटिंग प्लास्टिक और झिल्ली सतहों के लिए ntration समाधान।
    5. कोलेजन कोट प्लास्टिक, 37 डिग्री सेल्सियस पर आरटी पर 2 घंटे के लिए कांच और झिल्ली सतहों, या हे / एन 2-8 डिग्री सेल्सियस पर।
    6. लेपित सतह से अधिक तरल पदार्थ निकालें, और यह हे / एन शुष्क करने की अनुमति देते हैं।
    7. कोशिकाओं और मध्यम शुरू करने से पहले बाँझ टिशू कल्चर ग्रेड पानी या HBSS के साथ कुल्ला।
  8. प्लेट सीरम मुक्त माध्यम में 25,000 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर hAECs, और लगाव 72-96 घंटे के लिए उत्पन्न करने के लिए अनुमति देते हैं।
  9. कुर्की के बाद, ध्यान से aspirating और सीरम मुक्त मध्यम का एक उपयुक्त मात्रा हर 2-3 दिनों के साथ जगह से मीडिया बदल जाते हैं।
  10. नीचे प्रोटोकॉल का उपयोग बीतने कोशिकाओं
    1. महाप्राण सेल संस्कृति मीडिया और बाँझ HBSS के 1x मात्रा के साथ धोने
    2. कोशिकाओं सेल संस्कृति सतह से detaching मनाया जाता है जब तक एंजाइमी की 1x मात्रा में जोड़ें समाधान को पचाने और 5-15 मिनट के लिए सेते हैं, या।
    3. , समाधान कोशिकाओं से युक्त पचाने सीई सुनिश्चित करने एंजाइमी लीजिएLLS बार बार सेल संस्कृति सतह के खिलाफ समाधान पचाने एंजाइमी pipetting द्वारा सेल संस्कृति सतह से अलग कर रहे हैं
    4. 5 मिनट के लिए 700 XG पर अपकेंद्रित्र।
    5. 1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन आधारित एंजाइम अवरोध करनेवाला युक्त HBSS के लिए एक उपयुक्त मात्रा में सेल गोली Resuspend। धीरे से एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 1ml विंदुक के साथ बार-बार विंदुक।
    6. 1 लाख कोशिकाओं / एमएल की एक अनुमानित एकाग्रता के लिए सीरम मुक्त मध्यम जोड़ें। Trypan नीले बहिष्कार के साथ स्वचालित या मैनुअल गिनती का उपयोग करते हुए सेल नंबर और व्यवहार्यता का निर्धारण।
    7. प्लेट सीरम मुक्त माध्यम में 25,000 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर hAECs, और मानक संवर्धन तरीकों के साथ जारी है।

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Representative Results

इस प्रक्रिया को सही ढंग से पालन किया जाता है, 120 मिलियन hAECs के एक औसत उपज 80-160,000,000 कोशिकाओं का एक विशिष्ट श्रेणी के साथ, उम्मीद की जानी चाहिए। इन पैदावार से, 83 ± 4% की एक औसत व्यवहार्यता की उम्मीद की जा सकती है। नैदानिक ​​विधि में वृद्धि की औसत उपज और थोड़ा कम व्यवहार्यता के कारण सीरम प्रोटीन की कमी के कारण शायद यह भी पशु व्युत्पन्न उत्पाद की तुलना में अधिक trypsin गतिविधि की वजह से हो सकता है और हो सकता है। पृथक hAECs <1% CD90, CD105 mesenchymal मार्कर सकारात्मक कोशिकाओं के साथ 92% EpCAM सकारात्मक कोशिकाओं के एक औसत कोशिका की सतह प्रोफ़ाइल है। इन मार्कर क्रमशः उपकला 24,25 और mesenchymal 26 प्रजातियों के लिए अपनी विशिष्टता की वजह से चयन किया गया था। यह प्रक्रिया (चित्रा 1) को पूरा करने के लिए लगभग 4-5 घंटे लग सकते हैं।

Cryopreservation शीशियों और अंतिम सेल उपज की संख्या के आधार पर 20-60 मिनट की आवश्यकता है। हम पहले cryopreservation मीडिया की एक सीमा का परीक्षण किया और पाया हैकि कई पशु उत्पाद मुक्त मीडिया हालांकि इष्टतम DMSO के एकाग्रता लगभग 5-10% है, उपयुक्त प्रदर्शन करते हैं। आमतौर पर एक व्यवहार्यता के बाद पिघलना पूर्व cryopreservation व्यवहार्यता से 5-10% कम होने की उम्मीद कर सकते हैं, और इस नुकसान अनुभवहीन उपयोगकर्ता (चित्रा 2) के लिए काफी अधिक हो सकता है।

सेल संस्कृति लक्षण, भेदभाव, या इन विट्रो प्रक्रियाओं में अन्य विशिष्ट सक्षम करने के लिए hAECs के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। इन कोशिकाओं को शुरू में 50-80% की दक्षता (व्यक्तिगत अवलोकन) के साथ सेल सतहों को देते हैं। इसके बाद मार्ग के साथ 70-90% तक बढ़ जाती है। अनुलग्नक ऐसे कोलेजन प्रकार मैं, या इसी तरह के उत्पादों के रूप में सतह कोटिंग सामग्री के उपयोग के साथ वृद्धि हो सकती है। hAECs सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया में उनके उपकला फेनोटाइप (चित्रा 3) बनाए रखें। हम दोहराया बीतने निम्नलिखित कोशिका की सतह मार्कर प्रोफाइल में महत्वपूर्ण परिवर्तन पाया है। इसके अतिरिक्त, के बाद लगभग 5 मार्ग hAECs eith कर सकते हैंएर वार्धक्य तक पहुँचने, या mesenchymal संक्रमण के लिए उपकला के साथ संगत morphological परिवर्तन के माध्यम से जाना। दोहराया पारित होने के बाद, hAECs एक सामान्य कुपोषण, लंबे टेलोमेर लंबाई और कोशिका चक्र वितरण बनाए रखें। इन गुणों के परिवर्तन या tumorigenicity का एक कम जोखिम का संकेत मिलता है। प्रतिरक्षा विनियामक और विरोधी भड़काऊ गुण रखने के अलावा, hAECs तीन प्राथमिक रोगाणु परतों की सेल प्रजातियों प्रतिनिधि (चित्रा 4) में फर्क, इन विट्रो में और vivo में अत्यधिक multipotent होना दिखाया गया है।

चित्रा 1
चित्रा 1:। अपेक्षित सेल उपज, व्यवहार्यता और पवित्रता नैदानिक ​​अलगाव प्रोटोकॉल के लिए इसी तरह के सेल पैदावार और व्यवहार्यता मानक पशु उत्पाद युक्त तरीकों की तुलना में पशु-उत्पाद मुक्त अभिकर्मकों का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। एक ठेठ अलगाव> 90% EpCAM और <1% CD90 / CD105 सकारात्मक होना चाहिएकोशिकाओं। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2:।। सीरम युक्त और सीरम मुक्त cryopreservation मीडिया के लिए पोस्ट पिघलना व्यवहार्यता और चयापचय 10% DMSO युक्त FBS के की तुलना में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पशु उत्पाद मुक्त cryopreservation मीडिया समान या वृद्धि के बाद पिघलना व्यवहार्यता और चयापचय दिखाया करने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 3
चित्रा 3: सीरम मुक्त और सीरम युक्त सेल संस्कृति में hAECs की विशिष्ट लगाव और विकास प्रोफाइलऊपरी मध्यम। पशु उत्पाद मुक्त संस्कृति मीडिया उपयुक्त सेल लगाव, प्रसार, और उपकला phenotype के रखरखाव दिखाया। हालांकि सीरम मुक्त मीडिया के आगे विकास सीरम युक्त मीडिया के बराबर परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। स्केल सलाखों 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4:। HAECs की multipotent भेदभाव जल्दी पारित होने पर, hAECs तीन प्राथमिक जनन स्तर के कई सेल प्रजातियों प्रतिनिधि में अंतर करने के लिए दिखाया गया है। इन प्रजातियों में शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं; न्यूरॉन्स, बाल और त्वचा कोशिकाओं, फेफड़ों के उपकला, cardiomyocytes, हेपाटोसाइट्स, अग्नाशय कोशिकाओं, osteocytes और adipocytes। (चित्रा 27 से अनुकूलित)

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Discussion

इस पद्धति की सफलता में एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है कि कई महत्वपूर्ण पैरामीटर शामिल हैं। HAECs के अलगाव से पहले अप करने के लिए तीन घंटे के लिए नाल या भ्रूणावरण का संग्रहण हालांकि यह ऊतक के रूप में जल्द से जल्द कार्रवाई की है कि सिफारिश की है, रसद या समयबद्धन प्रयोजनों के लिए वांछनीय हो सकता है। ऊतक संग्रहित किया जा रहा है, यह भंडारण भ्रूणावरण झिल्ली के विच्छेदन और वाशिंग निम्न प्रदर्शन किया जा सिफारिश की है। भ्रूणावरण 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ HBSS युक्त एंटीबायोटिक दवाओं में संग्रहित किया जा सकता है, हालांकि सेल व्यवहार्यता विस्तारित भंडारण समय के साथ कम कर सकते हैं। हम, और दूसरों को सेल उपज और व्यवहार्यता में परिवर्तनशीलता मिल गया है, और यह अधिमानतः सीजेरियन सेक्शन द्वारा दिया स्वस्थ अवधि जन्मों से एकत्र कर रहे हैं कि नाल की सिफारिश की है इस परिवर्तनशीलता को कम से कम करने के लिए।

हम रक्त कोशिकाओं के साथ भ्रूणावरण झिल्ली के प्रदूषण एंजाइम गतिविधि के निषेध और सेल उपज में कमी में परिणाम होगा कि पाया। इसलियेप्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम नाल की पूरी तरह से धोने और भ्रूणावरण झिल्ली की सिफारिश की है। यह यह नीचे की ओर एंजाइम अवरोध से बचने के लिए / सफेद स्पष्ट दिखाई देता है जब तक भ्रूणावरण ऊतक धोया जा सिफारिश की है। उपकला कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत सजातीय आबादी के अलगाव लक्षण वर्णन और गुणवत्ता नियंत्रण के परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण है।

Mesenchymal कोशिकाओं के साथ सेल उपज की कम पैदावार, व्यवहार्यता या संदूषण होती है, तो समस्या निवारण के लिए किया जा सकता है कि कई संशोधनों कर रहे हैं। सेल की पैदावार कम कर रहे हैं, यह enzymatic गतिविधि के कारण रक्त या सीरम संदूषण के लिए हिचकते किया गया था कि संभावना है। यह और अधिक व्यापक और अतिरिक्त धोने कदम और / या discarding खूनी या दूषित भ्रूणावरण टुकड़े के साथ हल किया जा सकता है। एनजाइम ऊष्मायन समय भी बढ़ाया जा सकता है, लेकिन इस सेल व्यवहार्यता के लिए हानिकारक हो सकता है। Mesenchymal कोशिकाओं के साथ व्यवहार्यता या संदूषण डाइजेस्ट समय कम से बचा जा सकता है की कमी हुई। हालांकि, थीयह भी कोशिकाओं की कुल उपज कम हो सकती है। 30 मिनट से 2 घंटे से लेकर टाइम्स इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन बार वांछित सेल पवित्रता और कुल उपज / व्यवहार्यता के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस तकनीक की एक सीमा में वृद्धि सेल उपज या व्यवहार्यता एक दूसरे की कीमत पर आ सकता है। इसके अतिरिक्त, सीरम मुक्त घटकों वर्तमान में enzymatic गतिविधि के लिए जोखिम निम्नलिखित सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के रूप में प्रभावी नहीं हैं।

प्रकोष्ठों तापमान नियंत्रित तरल नाइट्रोजन प्रणाली में भंडारण से सेल व्यवहार्यता या चयापचय के नुकसान में किसी भी प्रमुख कमी के बिना cryopreserved हो सकता है। यह एक साधारण isopropanol से भरे cryopreservation डिवाइस से एक राज्य के अत्याधुनिक नियंत्रित दर ठंड प्रणाली को लेकर कर सकते हैं। हमारे ज्ञान करने के लिए, इस प्रणाली में hAECs के लिए इष्टतम ठंड दर सेल व्यवहार्यता और बाद पिघलना चयापचय की उपयुक्त रखरखाव में एक डिग्री सेल्सियस / मिनट परिणामों की हालांकि मानक दर निर्धारित नहीं किया गया है। विगलन ओ के दौरानएफ cryopreserved कोशिकाओं, DMSO के लिए सेल जोखिम को कम करने के लिए एक न्यूनतम करने के लिए विगलन समय रखने के लिए महत्वपूर्ण है। कक्षों देते हैं और हौसले से अलग संवर्धन कोशिकाओं की तुलना में cryopreservation और विगलन के बाद एक कम दर पर पैदा हो सकता है।

संस्कृति कोशिकाओं सेल नंबर या और / या इन विट्रो हेरफेर में बहाव के लक्षण वर्णन के लिए बढ़ाने के लिए करने के लिए नैदानिक ​​आवेदन के लिए यह वांछनीय हो सकता है। पाठकों विट्रो हेरफेर में उनके विशिष्ट इन कोशिकाओं के नैदानिक ​​आवेदन पत्र में शामिल नियामक रास्ते को बदल सकता है कैसे समझना चाहिए। हम इस तरह के EpiLife के रूप में एक पशु उत्पाद मुक्त संस्कृति के माध्यम hAECs के रखरखाव और विस्तार के लिए उपयुक्त था कि जांच की। हालांकि, यह इस तरह के सेल प्रकार के लिए वृद्धि की विकास दर हासिल करने के लिए वृद्धि कारक सांद्रता अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है। एक मानव कोलेजन कोटिंग मैट्रिक्स का उपयोग करके संस्कृति के दौरान सेल के पालन के मुद्दे, चढ़ाना क्षमता बढ़ जाती है। हालांकि, लंबे समय तक ई निम्नलिखितएंजाइमी पाचन के लिए xposure चढ़ाना दक्षता उप इष्टतम किया जाएगा।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल वर्तमान विनिर्माण आचरण अच्छा है (cGMP) के दिशा निर्देशों के अनुसार पशु उत्पाद मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करते हुए मानव भ्रूणावरण उपकला कोशिकाओं (hAECs) के अलगाव और संस्कृति की सुविधा के लिए विकसित किया गया है। वैकल्पिक अलगाव तरीकों की तुलना में इस पद्धति का लाभ, उपयुक्त सेल पैदावार, viabilities और विकास क्षमता को बनाए रखते हुए इन कोशिकाओं, मनुष्य के लिए हानिकारक पशु रोगज़नक़ों पहुंचाने के जोखिम के बिना cryopreserved और सुसंस्कृत, विशेषता, अलग किया जा सकता है। क्लिनिकल परीक्षण के लिए पूर्व नैदानिक ​​जानवरों के अध्ययन से आगे बढ़ शोधकर्ताओं के लिए, इन तरीकों में काफी नियामक मंजूरी में तेजी लाने के जोखिम को कम करने और उनके चिकित्सीय सेल की आबादी की गुणवत्ता में सुधार होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection Kit
Stripping tray Fisher Scientific 13-361B
Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm Fisher Scientific S17329 
Scissors - Sharp/Blunt Straight Fisher Scientific NC0562592 
Sterile latex gloves  Fisher Scientific 19-014-643 
Protective Apparel
Protective Apparel (Gown) U-line S-15374-M
Isolation gowns U-line S-15374-M
Sterile latex gloves  Fisher Scientific 19-014-643 
General purpose face mask Cardinal Health AT7511
Bonnets Medline CRI1001
Shoe covers U-line S-7873W
Media and Reagents
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175095 without calcium or magnesium
TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) Sigma Aldrich T3449
Soybean Trypsin Inhibitor  1g/50mL Sigma Aldrich T6522
Cryostor CS5 BioLife Solutions 205102
Trypan blue reagent Life Technologies 15250-061
Anti-EpCam-PE Miltenyi Biotec 130 - 091-253
PE-isotype control Miltenyi Biotec 130-098-845
Anti-CD90-PeCy5 BD Pharmingen 555597
PeCy5-isotype control BD Pharmingen 557224
Anti-CD105-APC BD Pharmingen 562408
APC-isotype control BD Pharmingen 340754
Collagen Type VI Sigma Aldrich C7521
Consumables
50 ml graduated pipette BD/Falcon 356550
10 ml graduated pipette BD/Falcon 356551
5 ml graduated pipette BD/Falcon 356543
50 ml falcon tubes BD/Falcon 352070
15 ml falcon tubes BD/Falcon 352096
15 cm Petri dishes Corning 351058
70 μm filters BD/Falcon 352350
0.22 μm filters Millipore SLGV033RS
1 ml Pipette tips Fisherbrand 02-707-401
200 μl Pipette tips Fisherbrand 02-707-409
20 ml Syringe BD/Medical 309661
Plastic spatula Fisher Scientific 14-245-97 
Plastic weighing boat Fisher Scientific 02-202-102 
Cryo vials Nunc 377267
Equipment
Mr Frosty Fisher Scientific A451-4 
Biohazard Cabinet

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चिकित्सा अंक 94 भ्रूणावरण झिल्ली एमनियोटिक सेल उपकला सेल थेरेपी प्रसवकालीन अपरा स्टेम
अलगाव, cryopreservation और संस्कृति नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए मानव भ्रूणावरण उपकला कोशिकाओं
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Murphy, S. V., Kidyoor, A., Reid, T., Atala, A., Wallace, E. M., Lim, R. Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (94), e52085, doi:10.3791/52085 (2014).

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