Introduction
이러한 태반과 같은 주 산기 소스, 태반 막, 탯줄과 양수에서 파생 된 세포는 재생 의학 1,2 세포의 잠재적 인 소스로 연구자와 임상의의 주목을 받고있다. 이 관심의 이유는이 세포 유형 모두 소성 및 면역 기능 3, 그들의 잠재적 인 치료 응용 프로그램에 대한 기본적인 특성을 어느 정도 가지고 있다는 것입니다.
hAECs 회생 세포 물질의 풍부한 전위 소스를 제공, 용어 또는 용어 사전 양막 멤브레인 (4)로부터 유도 될 수 상피 이종 집단이다. 세포 치료 매력적 hAECs을 속성은 자신의 다 능성, 낮은 면역 원성 및 항 염증 기능을 포함한다. hAECs은 (높은 시험 관내 및 생체 내 둘 다 능성 중배엽 계통으로 분화 할 수 cardiom를 밝혀졌다yocytes, 근육 세포, 골 세포, 지방 세포), 내배엽 계통 (췌장 세포, 간 세포, 폐 세포)와 외배엽 계통 (헤어, 피부, 신경 세포와 성상 세포) 5-10.
안심, 자신의 다 능성의 hAECs 어느 형태의 종양에 표시 또는 생체 내에서 종양 발생을 촉진하지 않습니다에도 불구하고. 또한, hAECs 또한 클래스 II 인간 백혈구 항원 (HLAs) 8의 낮은 수준을 표현, 특권 면역 있습니다. 이 속성은 가능성이 면역 능력 원숭이, 토끼, 기니피그, 쥐, 돼지 11 ~ 13을 사용하여 연구에서 입증 된 바와 같이, 동종 및 이종 이식 후 면역 거부를 회피 할 수있는 능력의 기초가. hAECs는 강력한 면역 조절 및 면역 속성을 표시함으로써자가 면역 질환 치료에 잠재적 인 임상 응용 프로그램에 대한 중요한 실용적인 장점을 제공한다. hAECs는 모두 선천성 및 후천성 면역 시스템에서 면역 기능을 발휘하는 것으로 추정된다. 에면역의 분비가 (14) 요인을 통해 제안 된 메커니즘의 전자입니다.
전임상 동물 질병 모델에서 hAECs 현재 애플리케이션은 뇌졸중, 다발성 경화증, 간 질환, 당뇨병 및 만성 폐 질환의 치료를 포함한다. 연구자들은 그들의 고유 한 속성에 뇌졸중 후 뇌 염증을 치료하는 hAECs를 사용에 관심을 보여 주었다. hAECs, 그들은 생착 할 수있는 혈액 뇌 장벽을 통과 최대 60 일 동안 생존, 뉴런으로 분화, 염증을 감소시키고 신경 질환 (15)의 동물 모델에서 손상된 중추 신경계 조직의 재생을 촉진 할 수 있다는 증거가있다.
hAECs 타겟팅 및 다발성 경화증의 발생 및 진행에 기여하는 여러 병리학 적 경로를 취소하는 기능을 제공한다. 예를 들면, 전임상 동물 실험의 결과 hAECs 강하게 면역 것을 제안하고잠재적으로 말초 면역 관용을 유도하고 지속적인 염증 반응을 취소 할 수 있습니다. hAECs는 또한 생체 내에서 신경 세포로 분화 및 신경성의 방대한 16 인자 분비를 통해 내인성 신경 재생을 향상시키는 능력을 갖는 것을 나타내고있다.
설치류 및 인간 양막 상피 세포는 이미 동물 모델에서 간 질환의 치료를위한 그들의 치료 효능을 증명하고있다. 감소 된 간세포 자멸사 수반 간 질환, 간에서의 생착 가능한 hAECs HAEC에 이식 리드의 사염화탄소 유도 손상 모델에서 간 염증 및 섬유증 및 17의 감소.
hAECs는 인슐린과 포도당 수송을 포함하여 표현 췌장 요인으로 자극 할 수있다. 몇몇 연구는 당뇨병 마우스 (18)에서 혈당 수준을 복원 hAECs 가능성을 조사 하였다. 마우스에서 수신hAECs는 모두 동물 체중 및 혈당 수준은 감염 후 세포의 정상 수준으로 감소 하였다. 이들 연구는 당뇨병의 치료를위한 hAECs의 사용을위한 강력한 바이다.
hAECs는 성인과 신생아 모델 19 두의 예방 및 실험 급성 및 만성 폐 손상의 수리 검증 역할을한다. 이러한 연구는 hAECs은 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR), 낭포 성 섬유증 (20) 환자에서 돌연변이 이온 채널 등 다양한 폐 관련 단백질을 발현하는 기능 폐 상피 세포로 체외에서 분화 것을 발견했다. hAECs가 부상당한 성인과 신생아 폐에 전달 될 때 또한, 그들은 호중구, 대 식세포와 림프구 21-23을 포함한 폐 백혈구 모집을 감소, 호스트 면역 세포의 변조를 통해 자신의 수복 효과를 발휘한다.
자신의 풍요 로움을 감안할 때,안전 기록, 여러 질병에 대한 입증 된 임상 적용, hAECs를 사용하여 임상 시험은 불가피하다. 임상 시험에 HAEC 치료의 번역을 촉진 목표로, 우리는 현재 좋은 제조 기준 (cGMP의) 지침에 따라 동물 제품 무료 시약을 사용하여, 임상 시험에 적합한 방식으로 문화 hAECs을 분리 cryopreserve과하는 방법을 개발 .
우리는이 프로토콜에게 우리가 동물 유래 시약 6을 사용 hAECs을 분리 성공적으로 사용하고 이전에 출판 된 프로토콜을 기반으로. 우리는 동물 제품 무료 시약 동물 유래 제품을 대체 할 수있는 원래의 프로토콜을 변경, 이후의 최적화는 세포 수율, 생존 및 순도를 최적화하기 위해 실시 하였다. 우리의 목표는 인간의 임상 시험에 대한 전지 제조에 대한 규제 기준을 준수 할 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다.
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Protocol
참고 : 태반이 용어 선택 과목 제왕 섹션의 설정에, 싱글 건강한 임신에서 수집해야합니다. 작성된 동의서들은 태반의 수집을 위해 주어져야한다. 귀하의 관련 인간의 연구 윤리위원회는 승인 모든 수집 및 인체 조직의 사용을해야한다.
양막 상피 세포의 1. 분리
- 클래스 II 생물 안전 캐비닛 내에서 멸균 표면에 태반을 놓습니다.
- 멸균에게 행크스 평형 염 용액 (HBSS)을 사용하여 태반 표면 및 막으로부터 가능한 한 많은 혈액을 세척한다.
- 탯줄이 위를 향하도록 배치 태반으로, 기계적으로 양막과 융모막 세포막의 바깥 쪽 가장자리를 구분합니다.
- 분리되면, 수동으로 탯줄, 멤브레인의 에지 주변에서 작업, 태반의 융모막 막에서 양막 멤브레인 스트립.
참고 : caref 될UL은 양막에서 융모막 막 오염의 조각을 제거합니다. - 멸균 가위를 사용하여, 250 ml의 HBSS를 포함하는 용기를 밀봉 한 500㎖의 탯줄과 장소의 기지에서 약 2cm를 양막 막 잘라.
- 양막 멤브레인을 포함하는 밀봉 된 병을 흔들어 깨끗이 씻으십시오.
- 15cm 페트리 접시에 수집 멸균 집게를 사용하여 컨테이너, 장소에서 양막 막을 제거합니다.
- 피 묻은거나 찢어 조각을 폐기, (집게 수직으로 개최 할 때) 약 5cm 긴 조각으로 양막 멤브레인을 잘라.
- 500 ml의에있는 장소는 용기를 밀봉하고 250 ml의 HBSS로 약 3 ~ 5 번 씻거나 양막 막 더 오염 혈액 반투명 될 때까지.
참고 : 모든 혈액에 존재하는 솔루션을 소화 효소의 효율을 감소시킬 수있다. - 주의하면서 소화 용액을 50 ml의 효소를 함유하는 용기에 양막 막 조각을 모두 전송HBSS의 이월을 최소화 할 수 있습니다.
- 남아있는 혈액을 제거하기 위해 교반과 함께 15 분 동안 37 ° C에서 물 목욕이나 따뜻한 방에서 솔루션을 소화 효소에 양막 조각을 품어.
- 새로운 멸균 용기에 솔루션과 장소를 소화 효소의 양막 조각을 제거합니다.
- 신선한 효소 100ml를 양막 멤브레인 용액을 소화하고 수욕 또는 부드러운 진탕 (제 1 분해) 따뜻한 방에서 60 분 동안 37 ℃에서 추가 배양한다.
- 양막 막 조각을 제거하고 효소가 세포막의 각 부분에서 배출 솔루션을 소화 할 수 있도록 새로운 컨테이너 돌보는에 배치합니다.
주 : 이것은 용기 내부 림을 따라 양막 조각을 드래그함으로써 달성 될 수있다. - 신선한 효소의 100 ml의 양막 막 조각에 솔루션을 소화하고 부드러운 흔들림 (초 소화) 37 ° C에서 물 목욕이나 따뜻한 방에서 60 분을 품어 추가.
- 셀 suspensi 전달10 분 동안 1,000 XG에 70 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 단계 1.14에서에.
- 제거하고 상층 액을 제거하고, 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 4 ml의 HBSS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 수득 1ml를 피펫으로 반복해서 피펫.
주 : 제 다이제스트로부터 세포가 동일한 처리 단계가 될 때까지이 단계에서 세포를 얼음에 남아있을 수있다. - 양막 막 조각을 제거하고 효소가 세포막의 각 부분에서 배출 솔루션을 소화 할 수 있도록 새로운 컨테이너 돌보는에 배치합니다.
주 : 이것은 용기 내부 림을 따라 양막 조각을 드래그함으로써 달성 될 수있다. - 10 분 동안 1,000 XG에 70 μm의 필터와 원심 분리기를 통해 단계 1.18에서 세포 현탁액을 전달합니다.
- 제거하고 상층 액을 제거하고, 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 4 ml의 HBSS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 1 ML의 페이지 반복적으로 피펫단일 세포 현탁액을 수득 ipette.
- 두 다이제스트 또는 대안에서 풀 세포는 세포 수 때까지 분리 된 세포 다이제스트을 유지합니다.
참고 :이 높은 생존 세포에 잠재적으로 낮은 생존 세포의 혼합을 방지 할 수 있습니다. - 10 ~ 20 ml의 최종 부피에 HBSS를 추가하고 생존 능력을 측정하기 위해 트리 판 블루를 사용하여 세포 수를 수행합니다.
- 유동 세포 계측법에 의한 상피 세포 표현형을 확인합니다. 안티는 EpCAM-PE 사용하여 적절한 항체 칵테일을 확인 (1 : 2 희석) 항 CD90-PeCy5 (1 : 250) 및 안티 CD105-APC (1 : 100) HBSS에.
- 25 × 106 세포 / ml의 농도로 하나의 세포 또는 항체 칵테일의 두 다이제스트의 서브 세트를 재현 탁.
- 유동 세포 계측법, 얼룩 이소 컨트롤을 포함하는 항체 칵테일 1 × 10 6 세포의 경우 (예. IgG의 1 이소 제어-PE + 안티 CD90-PeCy5 + 안티 CD105-APC). 설정 사이토 흐름에 대한 흠 ~ 1 × 10 6 세포를 보관하십시오.
- 항체 세포를 품어60 분 동안 4 ° C에서 칵테일.
- 워시 세포는 유동 세포 계측법 1 ㎖ 당 5-10000000 세포에서 HBSS 및 재현 탁에 3 배.
- 유동 세포 계측법 및 참고 결과를 수행합니다. 셀 분리 (는 EpCAM 양성 및 CD90 / CD105 음성 세포의 백분율)의 순도 및 각각 90-95% <1 %가 될 것으로 예상된다.
- 최종 응용 프로그램에 의해 결정되는 적절한 품질 관리 또는 방출 기준에 대한 테스트를 위해 따로 세포의 적절한 수를 설정합니다.
참고 :이 질환 / 바이러스 차단, 또는 다른 안전 또는 생물학적 기준을 포함 할 수 있습니다. - 나머지 세포의 경우, 냉동 보존 프로토콜에 따라, 또는 대안 (문화 단계 3.6 직접) 문화에 직접 배치합니다.
hAECs 2. 냉동 보존
- 데이터 또는 트리 판 블루 배제와 수동 계산 유동 세포 계측법을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다.
- 5 분 동안 700 XG에 원심 분리기.
- 재현 탁 셀동물 제품 무료 냉동 보존 매체에 1 ㎖ 당 1-10000000 세포 사이의.
- O 고리 동결 튜브에 세포의 적절한 볼륨을 피펫 및 냉각이 약 발생하는 위치 제어 속도 냉동 장치에 배치 1 ° C / 분까지 -80 C이 달성 °.
- 장기간 저장을 위해 액체 질소로 전송 튜브.
Cyropreserved hAECs 3. 해동 문화
- 액체 질소에서 냉동 보존 튜브를 제거하고 얼음에 배치합니다.
참고 : 전송의 경우 - 다음 단계로 빠르게 진행합니다. - 얼음이 남아의 작은 조각 (~ 5mm X 5mm) 때까지 37 ℃에서 급속 냉동 보관 유리 병을 녹여.
주 : 세포 용액은 동결 배지에서 DMSO의 독성을 감소시키는 가온하지 않는 것이 중요하다. - 감기 (~ 4 ° C) 혈청이없는 매체와 냉동 보존 매체 10 배 희석 점적 적당한 크기에 추가D 튜브 또는 용기.
- RT에서 5 분 700 XG에 원심 분리기.
- 1 mL 당 1 백만 세포의 농도로 근사, 무 혈청 배지에 재현 탁. 트리 판 블루 배제로 자동 또는 수동 계산을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다. 예상 생존 후 해동 미리 냉동 보존 생존보다 5 ~ 10 % 적습니다.
- 플레이트 표준 세포 배양 처리 된 플라스틱 제품에 세포, 또는 선택적으로 사용 유형 I 코트 문화 표면에 콜라겐.
- I 형 콜라겐 코팅는 아래의 프로토콜을 따라
- 인간의 태반 (25 ml의 탈 이온수 50 μL 빙초산 15 mg의 콜라겐)에서 산 가용성 I 형 콜라겐을 준비합니다.
- 파라 필름으로 비이커를 커버하고 콜라겐 가닥이 용해 될 때까지 37 ° C에서 적당히 저어.
- 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균 여과 콜라겐 용액.
- 탈 이온수로 필터링 된 콜라겐 스톡 1:10 희석. 이 희석 주식은 작업 conce입니다코팅 플라스틱 및 막 표면에 대한 ntration 솔루션입니다.
- 콜라겐 코트 플라스틱, 37 ° C의 실온에서 2 시간 동안 유리와 막 표면, 또는 O / N 2-8 ° C에서.
- 코팅 된 표면에서 초과 액체를 제거하고 O / N을 건조 할 수 있습니다.
- 세포와 매체를 도입하기 전에 무균 조직 배양 등급의 물 또는 HBSS로 씻어.
- 플레이트 혈청 배지에서 25,000 세포 / ㎠의 밀도로 hAECs, 그리고 첨부 72-96 시간 동안 발생할 수있다.
- 첨부 파일에 따라주의 깊게 흡입 및 무 혈청 배지의 적절한 볼륨 2-3 일마다로 대체하여 미디어를 변경합니다.
- 아래의 프로토콜을 이용하여 세포 통로
- 기음 세포 배양 미디어 및 무균 HBSS의 1 배 부피로 세척
- 세포는 세포 배양 물 표면으로부터 분리 될 때까지 관찰되는 효소의 양을 추가 1X 용액을 소화하고 5-15 분 동안 인큐베이션하거나.
- 용액은 세포를 포함하는 소화 효소 CE 보장 모아서LLS 반복 세포 배양면에 용액을 소화 효소를 피펫 팅하여 세포 배양 물 표면으로부터 분리되고
- 5 분 동안 700 XG에 원심 분리기.
- 1 ㎎ / ㎖ 대두 계 효소 저해제를 함유하는 HBSS의 적당한 부피에서 세포 펠렛을 재현 탁. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 수득하여 1ml 피펫으로 반복해서 피펫.
- 1 백만 세포 / ml의 대략적인 농도 무 혈청 배지를 추가합니다. 트리 판 블루 배제로 자동 또는 수동 계산을 사용하여 세포 수와 생존을 결정합니다.
- 플레이트 혈청 배지에서 25,000 세포 / ㎠의 밀도로 hAECs하고 표준 방법으로 배양을 계속.
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Representative Results
이 절차가 제대로 따라하면, 1 억 2 천만 hAECs의 평균 수익률은 80-160000000 세포의 전형적인 범위, 예상해야한다. 이러한 수율에서 83 ± 4 %의 평균 생존 능력을 기대할 수있다. 임상 방법에 증가 된 평균 수익률과 약간 낮은 가능성으로 인해 혈청 단백질의 부족으로 아마 또한 동물성 제품보다 더 높은 트립신의 활동으로 인해, 그리고 수 있습니다. 격리 hAECs은 <1 % CD90, CD105 간충직 마커 양성 세포와 92 %는 EpCAM 양성 세포의 평균 기포 표면 프로파일을 갖는다. 이 마커는 각각 상피 (24, 25)와 중간 엽 26 계통에 대한 자신의 특이성으로 인해 선정되었다. 이 과정은 (그림 1)을 완료하는 데 약 4-5 시간이 걸릴 수 있습니다.
냉동 보존은 튜브 및 최종 세포 수율의 수에 따라 20 ~ 60 분을 필요로한다. 우리는 이전에 냉동 보존 매체의 범위를 테스트 발견많은 동물 제품 무료 매체는 그러나 최적의 DMSO 농도는 약 5 ~ 10 %이며, 적절하게 수행합니다. 일반적으로 하나의 가능성 포스트 - 해동 미리 냉동 보존 생존보다 5-10 % 감소 할 것으로 예상 할 수있다,이 손실은 미숙 한 사용자 (그림 2)에 대한 상당히 클 수 있습니다.
세포 배양 특성화, 차별화, 또는 체외 절차에서 다른 특정 수 있도록 hAECs을 수행 할 수 있습니다. 이들 세포는 처음 50~80%의 효율 (개인적인 관찰)와 세포 표면에 부착. 이 이후의 통로로 70-90%로 증가한다. 첨부 콜라겐 타입 I, 또는 유사 제품으로 표면 코팅 물질의 사용으로 증가 될 수있다. hAECs 무 혈청 배지에서의 상피 표현형 (도 3)를 유지한다. 우리는 반복 통과 다음과 같은 세포 표면 마커 프로파일에 큰 변화를 발견했다. 또한, 이후 약 5 통로 hAECs는 eith 수 있습니다어 노화에 도달, 또는 중간 엽 전환 상피와 일치하는 형태 학적 변화를 통해 이동합니다. 반복 통로 후 hAECs는 정상 핵형 긴 텔로미어 길이 및 세포주기 분포를 유지한다. 이러한 속성은 변형이나 종양 유발의 낮은 위험을 나타냅니다. 면역 조절 및 항 염증 효과를 갖는 이외에도, hAECs은 삼원색 배엽 계통의 세포를 나타내는 (도 4)로 분화, 시험 관내 및 생체 내에서 매우 능성 것으로 밝혀졌다.
그림 1. 전지 예상 수율, 순도 및 생존 임상 분리 프로토콜에 대해 유사한 수율과 세포 생존 능력은 표준 동물 생성물 - 함유 방법에 비해 동물성 제품없는 시약을 사용하여 달성 될 수있다. 일반적인 격리은> 90 %는 EpCAM과 <1 % CD90 / CD105 양성한다세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :.. 혈청 함유하고 혈청이없는 냉동 보존 매체에 대한 사후 해동 생존 능력과 신진 대사를 10 % DMSO를 포함 FBS에 비해이 시판 동물 제품 무료 냉동 보존 매체가 비슷하거나 증가 후 해동 생존 능력과 신진 대사를 보였다 하려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 확인합니다.
그림 3 : 혈청 및 혈청 함유 세포 막 다른에 hAECs의 전형적인 부착과 성장 프로필진짜야 매체. 동물 제품 무료 문화 매체에 적합한 세포 부착, 증식, 상피 표현형의 유지 보수를 보여 주었다. 그러나 혈청이없는 배지의 발전 혈청 함유 배지와 동일한 결과를 달성하기 위해 요구된다. 스케일 바는 500 μm의를 나타냅니다.
그림 4 :. hAECs의 다 능성 분화 조기 통로에서, hAECs는 세 가지 주요 세균 층의 여러 세포 계통의 대표로 분화하는 것으로 나타났다. 이러한 계통이 포함되지만 이에 한정되지 않으며 신경, 머리와 피부 세포, 폐 상피 세포, 심근 세포, 간세포, 췌장 세포, 골 세포 및 지방 세포. (그림 27에서 적응)
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Discussion
이 방법의 성공에 중요한 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 매개 변수가 있습니다. hAECs의 분리하기 전에 최대 3 시간 동안 태반이나 양막의 저장 그러나 그것은 조직은 가능한 한 빨리 처리하는 것이 좋습니다, 물류 또는 스케줄링을 위해 바람직 할 수있다. 티슈가 저장 될 경우에는 저장 양막 막의 박리 및 세정 다음 수행하는 것이 권장된다. 양막은 39 ° C에서 멸균 항생제를 함유하는 HBSS에 저장 될 수 있으나 세포 생존이 연장 된 축적 시간에 따라 감소 할 수있다. 우리와 다른 세포 수율과 생존의 변동성을 발견하고, 바람직하게는 제왕 절개에 의해 전달 건강한 용어 출생에서 수집되는 태반을 권장이 변동성을 최소화하기 위해.
우리는 혈구 양막 막의 오염이 효소 활성의 억제 및 세포 수율 감소를 초래할 것으로 발견했다. 따라서프로토콜에서 중요한 단계는 태반의 철저한 세척과 양막을 권장합니다. 이 다운 스트림 효소 억제를 방지하기 위해 / 화이트 분명 나타날 때까지 양막 조직은 세척하는 것이 좋습니다. 상피 세포의 상대적으로 균일 한 집단의 분리 특성 및 품질 관리 시험을 위해 중요하다.
중간 엽 세포와 세포의 수율이 낮은 수율, 생존력 또는 오염이 발생하는 경우, 문제에 대해 수행 될 수있는 여러 가지 변형들이있다. 셀 수율이 낮은 경우에는 효소 활성을 인한 혈액 또는 혈청 오염 억제되는 것으로 보인다. 이보다 철저하고 추가 세척 단계 및 / 또는 폐기 피 묻은 오염 된 양막 조각으로 해결할 수 있습니다. 효소 배양 시간 또한 증가 될 수 있지만, 이것은 세포 생존에 불리 할 수있다. 간엽 세포 생존 또는 오염 다이제스트 시간을 감소시킴으로써 회피 될 수 감소 하였다. 그러나, 생들 또한 세포의 총 생산량을 감소시킬 수있다. 30 분에서 2 시간까지의 시간은 프로토콜이 사용될 수있다. 이 시간은 원하는 세포의 순도 및 총 생산량 / 생존을 위해 최적화 될 필요가있다. 이 기술의 한 가지 제한은 증가 또는 세포의 생존 능력은 수율 서로 희생 올 수 있다는 것이다. 또한, 혈청 요소는 현재 효소 활성에 노출 된 후 세포 생존을 유지하는 등의 효과가 없습니다.
세포는 온도 조절 액체 질소 시스템에 저장함으로써 세포 생존 또는 신진 대사의 손실의 주요 감소하지 않고 냉동 보관 할 수 있습니다. 이것은 간단한 이소프로판올 채워진 동결 보존 장치로부터 최신의 조절 된 속도 냉동 시스템의 범위 일 수있다. 우리가 알기로는,이 시스템 hAECs을위한 최적의 동결 속도는 세포 생존 및 사후 해동 신진 대사의 적절한 유지 보수 1 ° C / min의 결과 그러나 표준 속도, 결정되지 않았습니다. 해동 오시세포를 동결 보존 F, DMSO에 세포의 노출을 감소시키기 위해 최소로 해동 시간을 유지하는 것이 중요하다. 세포 부착과 갓 고립 된 세포를 배양에 비해 동결 및 해동 다음 낮은 속도로 증식 할 수 있습니다.
배양 세포 또는 세포 수 및 / 또는 시험 관내 조작에 하류 특성화 증가 임상 응용 것이 바람직 할 수도있다. 독자는 체외 조작에 특정 이러한 세포의 임상 응용 프로그램에 관련된 규제 경로를 변경하는 방법을 이해해야합니다. 우리는 EpiLife 등의 동물 제품이없는 배지 hAECs의 유지 보수 및 확장에 적합한 것을 조사 하였다. 그러나, 이러한 세포 유형에 대한 증가 된 성장 속도를 달성하기 위해 성장 인자의 농도를 최적화하는 것이 요구된다. 인간 콜라겐 코팅 행렬을 사용하여 배양하는 동안 세포 부착의 문제는, 도금의 효율을 증가시킨다. 그러나, 장기간 전자 다음소화 효소에 xposure 도금 효율은 차선 될 것입니다.
요약하면,이 프로토콜은 현재 우수 제조 관리 기준 (cGMP의) 지침에 따라 동물 제품 무료 시약을 사용하여 인간 양막 상피 세포 (hAECs)의 분리와 문화를 촉진하기 위해 개발되었다. 다른 분리 방법에 비해,이 방법의 장점은, 적절한 셀 수율의 생존 및 성장 가능성을 유지하면서, 이들 세포가 인간에게 해로울 동물 병원체 전달의 위험없이 동결 보존 배양, 특징, 분리 될 수 있다는 것이다. 임상 시험 전임상 동물 실험에서 이동하는 연구자, 이들 방법론은 크게 규제 승인을 가속화 위험을 감소시키고 그들의 치료 세포군의 품질을 개선하게된다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
