Introduction
Las células derivadas de fuentes perinatales, como la placenta, membranas de la placenta, el cordón umbilical y el líquido amniótico han atraído la atención de investigadores y clínicos como una fuente potencial de células para la medicina regenerativa 1,2. La razón de este interés es que todos estos tipos de células poseen un cierto grado de plasticidad y capacidad inmunomoduladora 3, propiedades que son fundamentales para sus aplicaciones terapéuticas potenciales.
HAECs son una población heterogénea epitelial que se puede derivar de plazo o pre-término membrana amnios 4, proporcionando una abundante fuente potencial de material celular regenerativa. Las propiedades que hacen que HAECs atractivos como una terapia celular incluyen su multipotencia, baja inmunogenicidad, y las propiedades anti-inflamatorias. HAECs se han encontrado para ser altamente multipotentes tanto in vitro como in vivo, capaces de diferenciarse en linajes mesodérmicos (cardiomyocytes, miocitos, adipocitos, osteocitos), de origen endodérmico (células pancreáticas, células hepáticas, células pulmonares) y linajes ectodérmicas (pelo, piel, células neuronales y astrocitos) 5-10.
De modo tranquilizador, a pesar de sus HAECs multipotencialidad no parecen bien forman tumores o promueven el desarrollo de tumores in vivo. Además, HAECs también son inmunes privilegiados, que expresa bajos niveles de antígenos de clase II leucocitarios humanos (HLA) 8. Esta propiedad probablemente subyace en su capacidad para evadir el rechazo inmunológico después del trasplante alogénico y xenogénico, como se demuestra en los estudios que utilizaron monos inmunes competentes, conejos, cobayas, ratas y cerdos 11-13. HAECs mostrar inmunomodulador potentes propiedades inmunosupresoras y por lo tanto ofrecen ventajas prácticas significativas para potenciales aplicaciones clínicas en el tratamiento de la enfermedad autoinmune. HAECs se cree que ejercen funciones inmunomoduladoras tanto en el sistema inmune innata y adaptativa. Ene de los mecanismos sugeridos, es a través de la secreción de factores inmunomoduladores 14.
Las aplicaciones actuales de HAECs en modelos de enfermedades de animales pre-clínicos incluyen el tratamiento de apoplejía, esclerosis múltiple, enfermedad hepática, diabetes y enfermedades pulmonares crónicas y agudas. Los investigadores han mostrado interés en utilizar HAECs para tratar posterior al accidente cerebrovascular inflamación cerebral debido a sus propiedades únicas. Hay evidencia de que HAECs puede cruzar la barrera de sangre del cerebro donde pueden injertarse, sobrevivir durante hasta 60 días, de diferenciarse en neuronas, disminuir la inflamación y promover la regeneración del tejido nervioso central dañado sistema en modelos animales de enfermedades neurológicas 15.
HAECs ofrecen la posibilidad de dirigir e invertir múltiples vías patológicos que contribuyen al desarrollo y la progresión de la esclerosis múltiple. Por ejemplo, los resultados de estudios en animales pre-clínicos sugieren que HAECs son fuertemente inmunosupresora ypuede potencialmente inducir tolerancia inmune periférica y revertir las respuestas inflamatorias en curso. HAECs también se han demostrado tener la capacidad de diferenciarse en células neuronales in vivo y mejorar la neuroregeneración endógena a través de la secreción de una amplia gama de factores neurotróficos 16.
Células epiteliales humanas y amnios roedor ya han demostrado su eficacia terapéutica para el tratamiento de la enfermedad hepática en modelos animales. En un modelo de daño de inducción tetracloruro de carbono de la enfermedad hepática, haec trasplante de plomo para el injerto de HAECs viables en el hígado, acompañada con una reducción de la apoptosis de hepatocitos, y la disminución de la inflamación y la fibrosis hepática 17.
HAECs se puede estimular a los factores de páncreas expresadas incluyendo insulina y glucosa transportistas. Varios estudios han investigado el potencial de HAECs para restablecer los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos 18. En los ratones que recibieronHAECs, tanto a nivel de peso y glucosa en la sangre del cuerpo de los animales disminuyó a niveles normales después de la inyección de las células. Estos estudios presentan un caso fuerte para el uso de HAECs para el tratamiento de la diabetes mellitus.
HAECs tienen un papel demostrado en la prevención y reparación de la lesión pulmonar aguda y crónica experimental, tanto en adultos y neonatales 19 modelos. Estos estudios encontraron que HAECs diferencian in vitro en células epiteliales del pulmón funcional que expresan múltiples proteínas pulmonares asociadas, incluyendo la fibrosis quística regulador de conductancia transmembrana (CFTR), el canal iónico que está mutado en pacientes con fibrosis quística 20. Además, cuando HAECs se entregan al adulto lesionado y pulmonar neonatal, que ejercen sus efectos a través de la modulación de reparación de las células inmunitarias del huésped, reduciendo el reclutamiento de leucocitos pulmonar, incluyendo neutrófilos, macrófagos y linfocitos 21-23.
Dada su abundancia,historial de seguridad y aplicaciones clínicas probadas para varias enfermedades, los ensayos clínicos utilizando HAECs es inevitable. Con el objetivo de acelerar la traducción de terapias HAEC a de ensayos clínicos, hemos desarrollado métodos para aislar, criopreservar y HAECs cultura de una manera adecuada para los ensayos clínicos, el uso de reactivos a productos libres de animales de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) directrices .
Basamos este protocolo un protocolo previamente publicado que estábamos usando con éxito para aislar HAECs utilizando reactivos de origen animal 6. Hemos modificado el protocolo original para reemplazar productos de origen animal con reactivos de productos libre de animales, y la optimización posterior se realizó para optimizar el rendimiento de células, la viabilidad y pureza. Nuestro objetivo era desarrollar un protocolo que cumplir con las normas reglamentarias para la fabricación de células para los ensayos clínicos en humanos.
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Protocol
NOTA: placentario debe recogerse de embarazos saludables simples, con una preferencia por las cesáreas electivas plazo. Escrito, el consentimiento informado debe darse para la recogida de su placenta. Su comité de ética de investigación en humanos pertinentes deberían homologación toda la colección y el uso de tejidos humanos.
1. Aislamiento de células epiteliales Amnion
- Coloque la placenta sobre una superficie estéril dentro de una cabina de seguridad biológica de clase II.
- Uso de madejas estériles solución salina equilibrada (HBSS), lavar tanta sangre como sea posible de la superficie de placenta y membranas.
- Con la placenta colocado con el cordón umbilical hacia arriba, separar mecánicamente el borde exterior de las membranas de amnios y el corion.
- Una vez separados, la tira manualmente la membrana amnios del corion la membrana de la placenta, trabajando alrededor del borde de la membrana, hacia el cordón umbilical.
NOTA: Sea CAREFul para eliminar las piezas de la contaminación de la membrana del corion del amnios. - Usando tijeras estériles, cortar la membrana amnios aproximadamente 2 cm desde la base del cordón umbilical y el lugar en unos 500 ml sellado recipiente que contiene 250 ml de HBSS.
- Lávese bien agitando el frasco sellado que contiene la membrana amnios.
- Retire la membrana amnios del recipiente de recogida utilizando pinzas estériles, y el lugar en una placa de Petri de 15 cm.
- Cortar la membrana amnios en trozos de aproximadamente 5 cm de largo (cuando se mantiene en posición vertical con fórceps), desechando pedazos sangrientos o rasgados.
- Colocar en un contenedor sellado de 500 ml y lavar con 250 ml de HBSS aproximadamente 3-5 veces o hasta que la membrana amnios vuelve translúcida sin sangre contaminante.
NOTA: la presencia de sangre puede reducir la eficiencia de la digestión enzimática solución. - Transfiera todas las piezas de la membrana amnios en un recipiente que contiene 50 ml de la solución de digestión enzimática, teniendo cuidado deminimizar el arrastre de HBSS.
- Incubar las piezas amnios en enzimática digieren solución en un baño de agua o habitación caliente a 37 ° C durante 15 minutos con agitación suave para eliminar la sangre restante.
- Retire las piezas de membrana amnios de la digestión enzimática solución y colocar en un nuevo recipiente estéril.
- Añadir 100 ml de solución enzimática fresco digieren a la membrana amnios y se incuban a 37 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o habitación caliente con agitación suave (primera digestión).
- Retire las piezas de membrana amnios y colocar en nueva toma cuidado envase para permitir la digestión enzimática solución para drenar de cada pieza de membrana.
NOTA: Esto puede conseguirse arrastrando piezas amnios lo largo del borde interior del recipiente. - Añadir 100 ml de solución enzimática fresco digieren a las piezas de membranas amnióticas e incubar 60 minutos en un baño de agua o habitación caliente a 37 ° C con agitación suave (segunda digestión).
- Pase el Suspensiòn celulardesde 1,14 Paso a través de un filtro de 70 micras y se centrifuga a 1000 xg durante 10 min.
- Retire y deseche el sobrenadante y resuspender el botón celular en 4 ml de HBSS que contiene 1 mg / ml de inhibidor a base de soja de la enzima. Pipetear suavemente varias veces con una pipeta de 1 ml para obtener una suspensión de células individuales.
NOTA: En esta etapa las células se pueden dejar en hielo hasta que las células de la segunda digestión se encuentran en la misma etapa de procesamiento. - Retire las piezas de membrana amnios y colocar en nueva toma cuidado envase para permitir la digestión enzimática solución para drenar de cada pieza de membrana.
NOTA: Esto puede conseguirse arrastrando piezas amnios lo largo del borde interior del recipiente. - Pasar la suspensión de células a partir del paso a través de un filtro de 1,18 micras y 70 centrifugar a 1000 xg durante 10 min.
- Retire y deseche el sobrenadante y resuspender el botón celular en 4 ml de HBSS que contiene 1 mg / ml de inhibidor a base de soja de la enzima. Pipetear suavemente varias veces con un 1 ml de pipette para obtener una suspensión de células individuales.
- Células piscina de los dos compendios o alternativamente mantienen digiere celulares separados hasta después de los recuentos de células.
NOTA: Esto evita la mezcla de células potencialmente bajas de viabilidad con pilas de gran viabilidad. - Añadir HBSS a un volumen final de 10-20 ml y llevar a cabo el recuento de células usando azul de tripano para medir la viabilidad.
- Confirme el fenotipo de las células epiteliales mediante citometría de flujo. Invente cócteles de anticuerpos adecuados utilizando anti-EpCAM-PE (dilución 1: 2) anti-CD90-PECy5 (1: 250) y anti-CD105-APC (1: 100) en HBSS.
- Resuspender un subconjunto de células de uno o ambos digiere en el cóctel de anticuerpos a una concentración de 25 x 10 6 células / ml.
- Para citometría de flujo, la mancha 1 x 10 6 células con los cócteles de anticuerpos que contienen controles de isotipo (por ejemplo. El control-PE isotipo IgG1 + anti-CD90-PECy5 + anti-CD105-APC). Mantenga ~ 1 x 10 6 células sin teñir para citómetro de flujo de configuración.
- Se incuban las células en anticuerpocócteles a 4 ° C durante 60 minutos.
- Lavar las células 3 veces en HBSS y se resuspende en 5 a 10 millones de células por ml para citometría de flujo.
- Realizar citometría de flujo y los resultados de nota. Se espera que la pureza de la cepa aislada de células (el porcentaje de EpCAM positivo y CD90 / CD105 células negativas) para ser 90-95% y <1%, respectivamente.
- Ponga a un lado un número adecuado de células para la prueba de los criterios de control de calidad o de liberación, según lo determinemos aplicación final.
NOTA: Esto puede incluir la enfermedad / detección viral u otra seguridad o criterios biológicos. - Para las células restantes, siga el protocolo de crioconservación, o alternativamente colocar directamente en la cultura (paso directo a la cultura 3.6).
2. Criopreservación de HAECs
- Determinar el número de células y la viabilidad mediante citometría de flujo de datos o el conteo manual con exclusión de azul tripán.
- Centrifugar a 700 g durante 5 min.
- Resuspender celulars entre 1 hasta 10 millones de células por ml en animales medios criopreservación-producto libre.
- Verter un volumen adecuado de las células en viales de crioconservación O-anillos y coloque en un aparato de congelación velocidad controlada, donde se produce el enfriamiento a aproximadamente 1 ° C / min hasta -80 ° C se logra.
- Transferencia viales en nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
3. La descongelación y Cultura de Cyropreserved HAECs
- Retire los viales de crioconservación de nitrógeno líquido y colocar en hielo.
NOTA: Para transferir solamente - proceder rápidamente a la siguiente etapa. - Descongele los viales de crioconservación rápidamente a 37 ° C hasta que sólo una pequeña parte (~ 5 mm x 5 mm) de los restos de hielo.
NOTA: Es importante que la solución de células no se calienta para reducir los efectos tóxicos de DMSO en los medios de crioconservación. - Diluir los medios de crioconservación 10 veces con frío (~ 4 ° C) medios libres de suero, añadido gota a gota en un tamaño adecuadod tubo o contenedor.
- Centrifugar a 700 xg durante 5 min a TA.
- Resuspender en medio libre de suero, a una concentración aproximada de 1 millón de células por ml. Determinar el número de células y la viabilidad mediante conteo automatizado o manual con exclusión de azul tripán. Esperado viabilidad después de la descongelación será un 5-10% menos de viabilidad antes de la criopreservación.
- Células de la placa de cerámica de plástico de cultivo tratadas con células estándar, o bien, utilizar colágeno de tipo I a las superficies de cultivo de abrigo.
- Por tipo I revestimiento colágeno seguir el protocolo de abajo
- Preparar ácido soluble tipo I colágeno de placenta humana (colágeno de 15 mg con 25 ml de agua desionizada y 50 ácido acético glacial l).
- Cubra vaso con Parafilm y una agitación moderada a 37 ° C hasta que se disuelven fibras de colágeno.
- Solución de colágeno filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras.
- Diluir el colágeno Stock 01:10 filtrada con agua destilada. Esta acción diluida es la conce trabajosolución ntration para superficies de plástico de recubrimiento y de membrana.
- Plástico capa de colágeno, las superficies de cristal y de membrana durante 2 horas a temperatura ambiente a 37 ° C, o O / N a 2-8 ° C.
- Retire el exceso de líquido de la superficie recubierta, y deje que se seque O / N.
- Enjuague con agua de grado de cultivo de tejido estéril o HBSS antes de la introducción de células y el medio.
- HAECs placa a una densidad de 25.000 células / cm 2 en medio libre de suero, y permiten la conexión que se produzca durante 72-96 horas.
- Después de la unión, cambiar el medio por aspiración con cuidado y reemplazar con un volumen adecuado de medio libre de suero cada 2-3 días.
- Passage células utilizando el protocolo de abajo
- Aspirar los medios de cultivo celular y lavar con un volumen de 1x estéril HBSS
- Añadir volumen 1x de la solución de análisis enzimático e incubar durante 5 a 15 minutos, o hasta que las células se observaron separe de la superficie de cultivo de células.
- Recoger digerido enzimático solución que contiene células, asegurando ceLLS se desprenden de la superficie de cultivo de células pipeteando repetidamente la solución enzimática digerir contra la superficie de cultivo de células
- Centrifugar a 700 g durante 5 min.
- Resuspender el sedimento celular en un volumen adecuado de HBSS que contiene 1 mg / ml de inhibidor a base de soja enzima. Pipetear suavemente varias veces con una pipeta de 1 ml para obtener una suspensión de células individuales.
- Añadir medio libre de suero a una concentración aproximada de 1 millón de células / ml. Determinar el número de células y la viabilidad mediante conteo automatizado o manual con exclusión de azul tripán.
- HAECs placa a una densidad de 25.000 células / cm 2 en medio libre de suero, y continúan con los métodos estándar de cultivo.
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Representative Results
Cuando este procedimiento se sigue correctamente, se debe esperar un rendimiento promedio de 120 millones de HAECs, con un rango típico de 80 hasta 160 millones de células. A partir de estos rendimientos, una viabilidad media de 83 ± 4% se puede esperar. El aumento de rendimiento medio y la viabilidad ligeramente inferior en el método clínico puede ser debido a la mayor actividad de la tripsina que el producto derivado de un animal, y quizás también debido a la falta de proteínas séricas. HAECs aisladas tienen un perfil medio de la superficie celular de 92% de células positivas EpCAM con <1% de células positivas marcador mesenquimal CD90, CD105. Estos marcadores fueron seleccionados debido a su especificidad para epiteliales y mesenquimales 24,25 26 linajes, respectivamente. Este proceso puede tardar aproximadamente 4-5 horas para completar (Figura 1).
Criopreservación requiere 20-60 min en función del número de viales y rendimiento celular final. Hemos probado previamente una serie de medios de criopreservación y encontradoque los medios de productos libre de muchos animales realizan adecuadamente, sin embargo, la concentración óptima DMSO es de aproximadamente 5 a 10%. Normalmente se puede esperar la viabilidad después de la descongelación sea 5-10% menos de viabilidad pre-criopreservación, y esta pérdida puede ser significativamente mayor para el usuario sin experiencia (Figura 2).
El cultivo celular se puede realizar con HAECs para permitir la caracterización, la diferenciación, u otro específico en procedimientos in vitro. Estas células inicialmente se adhieren a las superficies celulares con una eficiencia del 50-80% (observación personal). Esto aumenta al 70-90% con pasajes posteriores. La unión puede ser incrementada con el uso de materiales de revestimiento de superficie tales como el colágeno de tipo I, o productos similares. HAECs mantienen su fenotipo epitelial en medio de cultivo libre de suero (Figura 3). Hemos encontrado cambios significativos en los perfiles de los marcadores de superficie celular siguientes paso repetido. Además, después de aproximadamente 5 pasajes HAECs pueden Either llegar a la senectud, o ir a través de los cambios morfológicos compatibles con epitelial a mesenquimal. Tras el paso repetido, HAECs mantener un cariotipo normal, telómero longitudes largas y la distribución del ciclo celular. Estas propiedades indican un bajo riesgo de transformación o tumorigenicidad. Además de poseer propiedades reguladoras y anti-inflamatorias inmunes, HAECs han demostrado ser altamente multipotentes in vitro e in vivo, diferenciarse en linajes de células representativas de las tres capas germinales primarias (Figura 4).
Figura 1:. Rendimiento esperado celular, viabilidad y pureza para el protocolo de aislamiento clínico rendimientos celulares similares y viabilidad se puede lograr utilizando animales de productos reactivos libres en comparación con los métodos estándar que contienen el producto de origen animal. Un aislamiento típico debe ser> 90% EpCAM y <1% CD90 / CD105 positivaslas células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:.. Publicar viabilidad deshielo y el metabolismo de los medios de crioconservación que contiene suero y libre de suero comparación con FBS que contiene 10% de DMSO, animales de medios de criopreservación-productos libres disponibles en el mercado mostraron la viabilidad después de la descongelación y el metabolismo similar o incrementado por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: apego típica y crecimiento perfil de HAECs en cul celular libre de suero y que contiene suerotura medio. Animal medios de cultivo mostró producto libre de unión adecuado celular, la proliferación, y mantenimiento del fenotipo epitelial. Sin embargo se requiere un mayor desarrollo de medios libres de suero para lograr resultados iguales a los medios de comunicación que contiene suero. Las barras de escala representan 500 micras.
Figura 4:. Diferenciación Multipotentes de HAECs en el paso temprano, HAECs se ha demostrado que diferenciarse en múltiples linajes celulares representativas de las tres capas germinales primarias. Estos linajes incluyen, pero no se limitan a; neuronas, células de pelo y de la piel, epitelio pulmonar, cardiomiocitos, hepatocitos, células pancreáticas, osteocitos y adipocitos. (Figura adaptada de 27)
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Discussion
Hay varios parámetros críticos que pueden tener un impacto significativo en el éxito de esta metodología. El almacenamiento de la placenta o el amnios para hasta 3 horas antes del aislamiento de HAECs puede ser deseable para fines logísticos o de programación, sin embargo se recomienda que el tejido se procesa tan pronto como sea posible. Si el tejido se va a almacenar, se recomienda que se realice el almacenamiento después de la disección y el lavado de la membrana amnios. Amnion se puede almacenar en HBSS que contienen antibióticos estériles a 4 ° C, sin embargo la viabilidad celular puede disminuir con el tiempo de almacenamiento prolongado. Nosotros, y otros han encontrado la variabilidad en el rendimiento y la viabilidad celular, y para minimizar esta variabilidad se recomienda que la placenta se recogen de los nacimientos a término sanos, preferiblemente por cesárea.
Hemos encontrado que la contaminación de la membrana amnios con células de la sangre dará lugar a la inhibición de la actividad enzimática y una reducción en el rendimiento de la célula. Por lo tantoun paso crítico en el protocolo es un lavado a fondo de la placenta y se recomienda la membrana amnios. Se recomienda que el tejido amnios se lavó hasta que aparece de color blanco / claro para evitar la inhibición de la enzima aguas abajo. El aislamiento de una población relativamente homogénea de células epiteliales es importante para las pruebas de control de caracterización y de calidad.
Si se produce bajos rendimientos, la viabilidad o la contaminación del rendimiento celular con células mesenquimales hay varias modificaciones que pueden realizarse para la solución de problemas. Si los rendimientos celulares son bajos, es probable que la actividad enzimática fue inhibida debido a la sangre o contaminación suero. Esto se puede resolver con el lavado de medidas más amplias y adicionales y / o desechar piezas amnios sangrientas o contaminadas. Tiempo de incubación de la enzima también se puede aumentar, pero esto puede ser perjudicial para la viabilidad celular. Disminución de la viabilidad o la contaminación con células mesenquimales pueden evitarse disminuyendo el tiempo de digestión. Sin embargo, this también pueden disminuir el rendimiento total de las células. Los tiempos que van desde 30 minutos a 2 horas se pueden usar para este protocolo. Estos tiempos deben ser optimizados para la pureza celular deseado y rendimiento total / viabilidad. Una limitación de esta técnica es que el aumento de rendimiento celular o la viabilidad pueden ir en detrimento de la otra. Además, los componentes libres de suero en la actualidad no son tan eficaces de mantener la viabilidad celular tras la exposición a la actividad enzimática.
Las células pueden ser criopreservados sin ninguna disminución importante en la viabilidad celular o la pérdida de metabolismo mediante el almacenamiento en un sistema de nitrógeno líquido a temperatura controlada. Esto puede ir desde un simple dispositivo de criopreservación isopropanol lleno a un sistema de estado-of-the-art controlado congelamiento de las tarifas. A nuestro entender, la velocidad de congelación óptimo para HAECs en este sistema no se ha determinado, sin embargo, la tasa estándar de 1 ° C resultados / min en el mantenimiento adecuado de la viabilidad celular y el metabolismo después de la descongelación. Durante la descongelación of células criopreservadas, es importante tener tiempo de descongelación al mínimo para reducir la exposición de células a DMSO. Las células pueden adjuntar y proliferan a un ritmo menor después de la crioconservación y descongelación en comparación con el cultivo de células recién aisladas.
Para la aplicación clínica, puede ser deseable para células de cultivo para aumentar el número de células o para la caracterización de aguas abajo y / o la manipulación in vitro. Los lectores deben comprender cómo su específica manipulación in vitro podría alterar las vías de regulación que participan en la aplicación clínica de estas células. Hemos investigado que un medio de cultivo-producto libre animal como EpiLife era adecuado para el mantenimiento y la expansión de HAECs. Sin embargo, se requiere para optimizar las concentraciones del factor de crecimiento para lograr el aumento de las tasas de crecimiento para tal tipo de célula. El problema de la adherencia de las células durante el cultivo mediante el uso de una matriz de colágeno-recubrimiento humano, aumenta la eficiencia de plaqueo. Sin embargo, después de prolongada eXposure a la digestión enzimática de la eficiencia en placas será subóptima.
En resumen, este protocolo ha sido desarrollado para facilitar el aislamiento y cultivo de células humanas epiteliales amnióticas (HAECs) utilizando reactivos de productos libres de animales de acuerdo con las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) directrices. La ventaja de este método en comparación con los métodos de aislamiento alternativos, es que estas células se pueden aislar, caracterizado, criopreservados y se cultivaron sin el riesgo de la entrega de patógenos de animales potencialmente dañinos para los seres humanos, manteniendo al mismo tiempo los rendimientos celulares adecuados, viabilidades y potencial de crecimiento. Para los investigadores en movimiento a partir de estudios preclínicos con animales a los ensayos clínicos, estas metodologías se acelerará enormemente la aprobación regulatoria, reducir los riesgos y mejorar la calidad de su población celular terapéutica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
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