Introduction
Plasenta gibi perinatal kaynaklardan, plasental membranlar, göbek kordonu ve amniyotik sıvıdan elde edilen hücreler rejeneratif tıp 1,2 için hücrelerin bir potansiyel kaynağı olarak araştırmacılar ve klinisyenler dikkatini çekmiştir. Bu ilginin nedeni, bu hücre tipleri, tüm plastisite ve bağışıklık yeteneği 3, potansiyel terapötik uygulamalar için temel olan bazı özellikleri derecesine sahip olmasıdır.
hAECs rejeneratif hücre malzemeden bir miktarda potansiyel kaynağı temin terimi ya da önceden dönem amniyon zar 4 elde edilebilir heterojen epitel nüfus bulunmaktadır. hücresel bir tedavi olarak çekici hAECs yapmak özellikleri kendi multipotency, düşük imünojenite ve anti-inflamatuar özelliklerini içerir. hAECs (yüksek ölçüde, in vitro ve in vivo olarak multipotent mezodermal soy içine türetme yeteneğinde olduğu kardiyomiyopati bulunmuşturyocytes, myocytes, osteositler, adiposit), Endodermal soy (pankreas hücreleri, karaciğer hücreleri, akciğer hücreleri) ve ektodermal soyları (saç, cilt, sinir hücreleri ve astrositler) 5-10.
Reassuringly kendi multipotency hAECs ya bir şekilde tümörlere görünür ya da in vivo olarak tümör gelişimini teşvik etmemesine karşın. Ayrıca, hAECs de sınıf II insan lökosit antijenleri (HLA'lar) 8 düşük seviyelerde ifade, ayrıcalıklı bağışıklık bulunmaktadır. Bu özellik muhtemelen bağışıklık yetkili maymunlar, tavşan, kobay, sıçan, ve domuzlar 11-13 kullanıldığı çalışmalarda gösterildiği gibi, allojenik ve ksenojenik transplantasyon sonrası immün ret kaçınmak için kendi yeteneğini temelini oluşturmaktadır. hAECs güçlü immünomodülatör ve immünosüpresif özellikler gösterir ve böylece otoimmün hastalığın tedavisinde potansiyel klinik uygulamalar için önemli bir pratik avantaj sağlar. hAECs hem doğal ve adaptif bağışıklık sistemi üzerinde bağışıklık fonksiyonlarını uygulamak inanılmaktadır. Üzerindeimmunomodülator salgılanması 14 faktörleri ile öne mekanizmaların e.
Klinik öncesi hayvan hastalık modellerinde hAECs Mevcut uygulamalar felç, multipl skleroz, karaciğer hastalığı, şeker hastalığı ve kronik ve akut akciğer hastalıkların tedavisi bulunmaktadır. Araştırmacılar nedeniyle benzersiz özellikleri inme sonrası beyin iltihabı tedavi etmek hAECs kullanarak ilgi gösterdi. HAECs, onlar aşılamak olabilir kan beyin bariyerini kadar 60 gün boyunca hayatta, nöronlar içine ayırt, inflamasyonu azaltmak ve nörolojik hastalıkların 15 hayvan modellerinde hasarlı santral sinir sistemi dokusunun yenilenmesini teşvik edebilir dair kanıtlar vardır.
hAECs hedef ve multipl skleroz gelişmesi ve ilerlemesine katkıda birden patolojik yollar ters yeteneği sunuyoruz. Örneğin, klinik öncesi hayvan çalışmalarında kaynaklanan hAECs kuvvetle bağışıklık olduğunu göstermektedir vepotansiyel çevresel immün tolerans neden ve devam eden inflamatuar yanıtları tersine çevirebilirsiniz. hAECs in vivo sinir hücrelerine dönüştürmek ve nörotropik geniş bir dizi 16 faktörleri salgılayarak endojen sinir sistemini geliştirmek için kapasitesine sahip olduğu gösterilmiştir.
İnsan ve kemirgen amniyon epitel hücreleri, hayvan modellerinde karaciğer hastalığının tedavisi için terapötik etkinliğini göstermiştir. Düşük hepatosit apoptoz eşliğinde karaciğer hastalığı, karaciğer canlı hAECs nakledilmesiyle için haec nakli kurşun, karbon tetraklorür hasar indüksiyon modelinde ve hepatik inflamasyon ve fibrozis 17 azalmıştır.
hAECs insülin ve glükoz taşıyıcıları içeren ifade pankreas faktörlere stimüle edilebilir. Çeşitli çalışmalar, diyabetik farelerde 18 kan şekeri seviyelerinin normale dönmesi için hAECs potansiyelini araştırdık. Farelerde almahAECs, her iki hayvan vücut ağırlığı ve kan glukoz seviyeleri, hücre enjeksiyonunun ardından, normal seviyelere düşmüştür. Bu çalışmalar, diyabet tedavisi için hAECs kullanımı için güçlü bir sunulmaktadır.
hAECs yetişkin ve yenidoğan modelleri 19 hem de önlenmesi ve deneysel akut ve kronik akciğer hasarı tamir kanıtlanmış rolü vardır. Bu çalışmalar, hAECs Kistik fibroz membran geçirgenliğinin düzenleyicisi (CFTR), kistik fibroz 20 hastalarda mutasyona uğramış, ve iyon kanalının de dahil olmak üzere birden fazla akciğer ilişkili proteinler ifade eden fonksiyonel akciğer epitel hücrelerine in vitro olarak ayırt bulundu. HAECs yaralı yetişkin ve yeni doğan akciğer teslim edilir, ayrıca, bunların nötrofil, makrofajlar ve lenfositler 21-23 dahil olmak üzere akciğer lökosit işe, azaltılması, konak bağışıklık hücrelerinin modülasyonu yoluyla onarım etkilerini uygularlar.
Onların bolluğu göz önüne alındığında,Emniyet kaydı ve birden hastalıklar için kanıtlanmış klinik uygulamalar, hAECs kullanarak klinik çalışmalarda kaçınılmazdır. Klinik denemeler içine haec tedavilerin çeviri hızlandırılması amacı ile, biz mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) kurallarına uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanılarak, klinik çalışmalar için uygun bir şekilde kültür hAECs, izole cryopreserve ve yöntemler geliştirdi .
Biz bu protokolünü biz hayvansal kaynaklı reaktifler 6 kullanarak hAECs izole başarıyla kullandığınız bir önceden yayınlanmış bir protokol tabanlı. Biz hayvansal ürün içermeyen reaktif ile hayvansal kaynaklı ürünler yerine orijinal protokol değişmiş ve sonraki optimizasyon hücre verimi, canlılığı ve saflık optimize etmek yapıldı. Amacımız, insan klinik denemeler için hücre üretimi için düzenleyici standartlara uygun bir protokol geliştirmekti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: plasenta vadeli elektif sezaryen için bir tercih, tekiz gebeliklerde sağlıklı toplanan edilmelidir. Yazılı bilgilendirilmiş onam kendi plasenta toplanması için verilmelidir. Sizin ilgili insan araştırma etik kurul onayı tüm koleksiyon ve insan dokularının kullanılması gerekir.
Amniyon Epitel Hücreleri 1. İzolasyon
- Bir sınıf II biyolojik güvenlik kabini içinde steril bir yüzeye yerleştirin plasentayı.
- Steril Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) kullanarak, plasenta yüzeyi ve zarlardan mümkün olduğu kadar kan yıkayın.
- Göbek kordonu yukarı bakacak şekilde yerleştirilen plasenta ile, mekanik amniyon ve koryon zarlarının dış kenarını ayrı.
- Ayrıldıktan sonra, elle göbek kordonu doğru, membran kenarında çalışan, plasentanın koryon zarından amniyon zarı şerit.
NOT: caref Beul amniyon gelen koryon zarı kirlenmesine parçaları varsa kaldırmak için. - Steril makas kullanılarak, 250 ml HBSS içeren kabı sızdırmaz bir 500 ml'lik, göbek bağı ve yer tabanından yaklaşık 2 cm amniyon membran kesti.
- Amniyon zarı içeren mühürlü şişeyi sallayarak iyice yıkayın.
- 15 cm Petri kabı içine toplanması steril forseps kullanarak konteyner ve yerden amniyon zarı çıkarın.
- Kanlı veya yırtılmış parçaları atarak, (forseps ile dikey tutulduğunda), yaklaşık 5 cm uzunluğunda parçalar halinde amniyon zarı kesin.
- 500 ml'lik bir yer kabı sızdırmaz şekilde kapatıldı ve 250 ml HBSS ile yaklaşık 3-5 kez yıkama veya amniyon membranı kirlenmeye sebep olan hiçbir kan saydam hale gelinceye kadar.
NOT: Herhangi bir kan mevcut çözüm sindirmek enzimatik etkinliğini azaltabilir. - Dikkat ederek, çözelti sindirmek enzimatik 50 ml ihtiva eden bir kap içine amniyon zarın tüm parçaları transferHBSS taşınmasını en aza indirir.
- Kalan kanı çıkarmak için yavaşça sallanarak 15 dakika için 37 ° C'de su banyosunda veya sıcak bir odada çözüm sindirmek enzimatik olarak amniyon parçaları inkübe.
- Yeni bir steril kap içinde çözüm ve yer sindirmek enzimatik gelen amniyon zarı parçalarını çıkarın.
- Taze enzimatik 100 mi amniyon zara çözeltisi sindirimi ve bir su banyosu ya da yumuşak çalkalama (birinci sindirim) ile sıcak bir odada 60 dakika süre ile 37 ° C'de inkübe ekleyin.
- Amniyon zarı parçalarını çıkarın ve enzimatik zarının her parçasından tahliye çözüm sindirmek izin vermek için yeni konteyner alarak bakım içine yerleştirin.
Not: Bu, kabın iç kenarı boyunca amniyon parçaları sürükleyerek elde edilebilir. - Taze enzimatik 100 mi amniyon membran parçaları çözeltisi sindirimi ve hafif çalkalama (ikinci sindirim) ile 37 ° C'de bir su banyosu ya da sıcak bir odada 60 dakika inkübe ilave edin.
- Hücre asıltı geçmek10 dakika boyunca 1.000 xg'de 70 mikron filtre ve santrifüj yoluyla Adım 1.14 itibaren.
- Çıkarın ve supernatant ve 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü içeren 4 ml HBSS hücre pelletini. Yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere, 1 ml pipet ile tekrar tekrar pipetle.
Not: ikinci sindirilmiş hücre işlem aynı seviyede olana kadar bu aşamada hücreler, buz üzerinde bırakılabilir. - Amniyon zarı parçalarını çıkarın ve enzimatik zarının her parçasından tahliye çözüm sindirmek izin vermek için yeni konteyner alarak bakım içine yerleştirin.
Not: Bu, kabın iç kenarı boyunca amniyon parçaları sürükleyerek elde edilebilir. - 10 dakika boyunca 1.000 xg'de 70 mikron filtre ve santrifüj yoluyla Adım 1.18 hücre süspansiyonu geçirin.
- Çıkarın ve supernatant ve 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü içeren 4 ml HBSS hücre pelletini. Yavaşça 1 ml p art arda pipettek bir hücre süspansiyonu elde etmek için ipette.
- İki digests veya alternatif Havuz hücreleri hücre sayımları sonrasına kadar ayrılmış hücre digests tutun.
NOT: Bu yüksek canlılık hücreleri ile potansiyel olarak düşük canlılığı hücrelerinin karıştırılması önler. - 10-20 ml'lik bir son hacme HBSS ekleyin ve canlılığını ölçmek için tripan mavisi kullanarak hücreleri sayısını gerçekleştirmek.
- Flow sitometri ile epitel hücre fenotipi onaylayın. Anti-EpCAM-PE kullanılarak uygun antikor kokteyli Makyaj (1: 2 seyreltme), anti-CD90-PeCy5 (1: 250) ve anti-CD105 APC (1: 100), HBSS.
- 25 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda bir hücreler ya da antikor kokteyli içinde iki digests bir alt yeniden süspanse edin.
- Flow sitometri, leke izotip kontrolleri içeren antikor kokteylleri ile 1 x 10 6 hücre için (örn., IgG 1 izotop kontrol-PE + Anti-CD90-PeCy5 + Anti-CD105-APC). Set-up akış sitometresi için lekesiz ~ 1 x 10 6 hücre tutun.
- Antikorda hücreleri inkübe60 dakika boyunca 4 ° C'de kokteyller.
- Yıkama akış sitometresi için hücreler, ml başına 5-10.000.000 hücreler HBSS ve tekrar süspansiyon 3x.
- Akış sitometrik ve not sonuçlarını gerçekleştirin. Hücre izolatı (EpCAM pozitif ve CD90 / CD105 negatif hücrelerin yüzdesi) saflığı sırasıyla% 90-95 ve <% 1 olacağı tahmin edilmektedir.
- Nihai uygulama tarafından tespit edildiği üzere, uygun kalite kontrol ve serbest bırakma kriterleri için test edilmesi için bir kenara hücrelerin uygun bir sayısı ayarlayın.
NOT: Bu hastalık / viral tarama veya diğer güvenlik veya biyolojik kriterlerini içerebilir. - Kalan hücreler için, Kriyoprezervasyonun protokolünü takip veya alternatif (kültür adım 3.6 doğrudan) kültür doğrudan yerleştirin.
HAECs 2. Kryoprezervasyon
- Veri veya tripan mavi dışlama manuel sayım flow sitometri kullanılarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin.
- 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin.
- Süspanse hücrehayvansal ürün içermeyen kriyoprezervasyon medya ml başına 1-10 milyon hücreleri arasındaki s.
- O-halkalı dondurarak saklama şişeleri içine hücrelerin uygun bir hacim pipet ve soğutma yaklaşık olarak meydana geldiği hızı kontrollü dondurma cihazının içine koyun 1 ° C / dakika kadar -80 ° C elde edilir °.
- Uzun süreli depolama için sıvı azot içine şişeleri aktarın.
Cyropreserved hAECs 3. erimesi ve Kültür
- Sıvı azottan dondurarak saklama şişeleri çıkarın ve buz üzerine yerleştirin.
NOT: Yalnızca transferi için - bir sonraki adıma geçin hızla. - Buz kalır, sadece küçük bir parça (~ 5 mm x 5 mm) kadar 37 ° C de hızlı bir şekilde dondurarak saklama şişeleri çözülme.
NOT: Bu hücre çözümü dondurulması medyada DMSO toksik etkilerini azaltmak için sıcak olmadığı önemlidir. - Soğuk (~ 4 ° C), serum içermeyen ortam ile dondurarak saklama Ortam 10 kat seyreltilir, damla damla uygun bir boyut halinde ilaved tüp veya kap.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin.
- Ml başına 1.000.000 hücre bir konsantrasyonda için, serum barındırmayan ortam içinde yeniden süspanse edin. Tripan mavi dışlama ile otomatik veya manuel sayım kullanarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin. Beklenen canlılık sonrası çözülme öncesi kriyokoruma canlılığı% 5-10 daha az olacaktır.
- Plaka standart hücre kültürü-işlenmiş plastik eşya üzerine hücreler, veya alternatif kullanmak Tip I kat kültür yüzeylere kollajen.
- Tip I Kollajen kaplama için aşağıdaki protokolü takip
- İnsan plasentasından (25 ml deiyonize su ve 50 ul asetik asit, 15 mg, kolajen) 'ye ait asit çözünebilir Tip I Kolajen hazırlayın.
- Parafilm ile beher Kapak ve kolajen iplikler eriyene kadar 37 ° C'de orta karıştırın.
- 0.22 um filtre kullanılarak steril filtre kolajen çözeltisi.
- Deiyonize su ile filtrelenmiş kollajen stok 01:10 sulandırmak. Bu seyreltilmiş hisse çalışma conce olduğunuKaplama, plastik ve zar yüzeylerin ntration çözeltisi.
- Kollajen kat plastik, 37 ° C'de, oda sıcaklığında 2 saat için cam ve zar yüzeylerin ya da O / N, 2-8 ° C'de ilave edildi.
- Kaplanmış yüzey aşırı sıvı kaldırmak, ve O / N kurumasını bekleyin.
- Hücreleri ve orta tanıtan önce steril doku kültürü dereceli su veya HBSS ile durulayın.
- Levha serumsuz ortam içinde 25,000 hücre / cm2 yoğunluğunda hAECs ve ek 72-96 saat boyunca oluşmasına izin verir.
- Ek sonra, dikkatli bir şekilde aspire edilmesiyle ve serumsuz ortamda uygun bir hacim, her 2-3 günde bir ile değiştirerek ortamı değiştirmek.
- Aşağıdaki protokolü kullanarak Passage hücreleri
- Aspire hücre kültürü ortamı ve steril HBSS 1x hacmi ile yıkayın
- Hücreler, hücre kültürü yüzeyinden ayırma gözlenen kadar enzimatik 1x hacmi ekleyin çözüm sindirmek ve 5-15 dakika inkübe, ya da.
- Çözelti, hücreleri ihtiva eden sindirimi ce sağlanması enzimatik toplamakrf defalarca hücre kültürü yüzeyine karşı çözüm sindirmek enzimatik pipetleme hücre kültürü yüzeyinden ayrılır
- 5 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin.
- 1 mg / ml soya fasülyesi bazlı bir enzim inhibitörü ihtiva eden HBSS uygun bir hacimde hücre pelletini. Yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir 1ml pipet ile art arda pipetle.
- 1.000.000 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda serum içermeyen ortam ekleyin. Tripan mavi dışlama ile otomatik veya manuel sayım kullanarak hücre sayısı ve canlılığı belirleyin.
- Levha serumsuz ortam içinde 25,000 hücre / cm2 yoğunluğunda hAECs, standart kültür yöntemleri ile devam eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu prosedür doğru devam edildiğinde, 120,000,000 hAECs bir ortalama verim 80-160,000,000 hücre tipik aralık, beklenmelidir. Bu verimi kaynaktan, 83 ±% 4 arasında bir ortalama canlılığı beklenebilir. Klinik yöntemde artan ortalama verimi ve biraz daha düşük bir canlılık bağlı olarak serum proteinleri olmaması belki de, hayvan türevi ürün daha yüksek bir tripsin aktivitesi nedeniyle olabilir ve. İzole hAECs <% 1, CD90, CD105, mezenkimal geni taşıyan hücreler ile% 92 EpCAM pozitif hücreleri arasında bir ortalama hücre yüzey profiline sahiptir. Bu belirteçler, sırasıyla epitel 24,25 ve mezenkimal 26 soy için özgüllükleri nedeniyle seçilmiştir. Bu süreç (Şekil 1) tamamlamak için yaklaşık 4-5 saat sürebilir.
Krioprezervasyon şişeleri ve nihai hücre verimi sayısına bağlı olarak 20-60 dk gerektirir. Biz daha önce dondurarak saklama ortamı bir dizi test ve buldukbirçok hayvansal ürün içermeyen ortam, ancak optimum DMSO konsantrasyonu yaklaşık% 5-10, uygun gerçekleştirin. Tipik bir canlılık sonrası çözülme öncesi kriyokoruma canlılığı% 5-10 daha az olmasını bekleyebilirsiniz, ve bu kayıp deneyimsiz kullanıcı (Şekil 2) için önemli ölçüde daha büyük olabilir.
Hücre kültürü karakterizasyonu, farklılaşma, ya da in vitro prosedürler diğer spesifik sağlamak için hAECs ile yapılabilir. Bu hücreler başlangıçta% 50-80 bir verimlilik (kişisel gözlem) ile hücre yüzeylerinde eklemek. Bu, sonraki geçişleri ile% 70-90 artar. Bağlanma örneğin kolajen tip I veya benzer ürünler gibi yüzey kaplama malzemelerinin kullanımı ile artırılabilir. hAECs serum içermeyen kültür ortamı içindeki epitel fenotipi (Şekil 3) korur. Biz tekrarlanan geçit aşağıdaki hücre yüzey işaretleyici profillerinde önemli değişiklikler bulduk. Buna ek olarak, daha sonra yaklaşık olarak 5 pasaj hAECs eith olabilirer yaşlanmayı ulaşmak, ya da mezenkimal geçiş epitel ile tutarlı morfolojik değişikliklere gitmek. Tekrarlanan geçişten sonra, hAECs normal karyotip, uzun telomer uzunluklarını ve hücre döngüsü dağılımı korumak. Bu özellikler dönüşüm veya tümörgenezine düşük riski göstermektedir. Bağışıklık düzenleyici ve anti-inflamatuar özelliklere sahip ek olarak, hAECs üç ana germ hücre soyları temsilcisi (Şekil 4), ayrıştırıcı, in vitro ve in vivo yüksek multipotent olduğu gösterilmiştir.
Şekil 1:. Beklenen hücre verimi, canlılık ve saflık klinik izolasyonu protokolü için benzer hücre verimi ve canlılığı standart hayvan Ürünü içeren yöntemlere göre hayvan ürünün serbest reaktif kullanılarak elde edilebilir. Tipik bir izolasyon>% 90 EpCAM ve <% 1 CD90 / CD105 pozitif olmalıHücreler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:.. Serum içeren ve serum serbest kriyoprezervasyon medya için Sonrası çözülme canlılığı ve metabolizma% 10 DMSO içeren FBS ile karşılaştırıldığında, piyasada mevcut hayvansal ürün içermeyen dondurarak saklama ortamı benzer ya da artmış sonrası çözülme canlılığı ve metabolizma gösterdi için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.
Şekil 3: serumsuz ve serum içeren hücre kültürleriyle içinde hAECs tipik bağlanma ve büyüme profiliTure ortamı. Hayvan ürünü içermeyen kültür ortamı, uygun hücre eki, proliferasyon ve epitel fenotip bakım göstermiştir. Bununla birlikte, serum içermeyen ortam daha da geliştirilmesi, serum içeren ortamda eşit sonuçlar elde etmek için gereklidir. Ölçek çubukları 500 um temsil eder.
Şekil 4:. HAECs arasında Multipotent farklılaşma erken geçiş içinde hAECs üç ana germ birden fazla hücre soyları temsil içine ayırt etmek için gösterilmiştir. Bu soylar şunlardır, ancak bunlarla sınırlı değildir; nöronlar, saç ve cilt hücreleri, akciğer epiteli, kardiyomiyositler, hepatositler, pankreas hücreleri, osteositler ve adipozitler. (Şekil 27 uyarlanmıştır)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu metodolojinin başarısında önemli bir etkiye sahip birkaç kritik parametreler vardır. HAECs izolasyonundan önce 3 saat süre ile plasenta veya amniyon depolanması ancak doku mümkün olan en kısa zamanda işlem önerilmektedir, lojistik ve programlama amacıyla arzu edilebilir. Doku saklanacaksa, bu depolama amniyon membran diseksiyon ve yıkama sonrası yapılması tavsiye edilir. Amniyon sıvısı 4 ° C'de steril HBSS içeren antibiyotik saklanabilir ancak hücre canlılığı, uzun depolama süresi ile azalabilir. Biz, ve diğerleri hücre verimi ve canlılığı değişkenlik bulduk, ve tercihen Sezaryen ile doğum sağlıklı term doğum, toplanan olduğu plasenta önerilir bu değişkenliği en aza indirmek için.
Bu kan hücreleri ile amniyon membran kirlenme enzim etkinliğinin inhibisyonu ve hücre veriminde bir düşüşe neden olur bulundu. Bu nedenleprotokolünde önemli bir adım plasentanın kapsamlı yıkama ve amniyon zarı tavsiye edilir. O mansap enzim inhibisyonunu önlemek için / beyaz berrak görünene kadar amniyon dokusu yıkanmış olması tavsiye edilir. Epitel hücreleri, nispeten homojen bir popülasyonundan izole edilmesi karakterizasyonu ve kalite kontrol testleri için önemlidir.
Mezenkimal hücreler ile hücre verimi düşük verimleri, canlılık veya kirlenme olursa sorun giderme için yapılabilir çeşitli değişiklikler vardır. Hücre verimleri düşüktür, bu enzimatik aktivitesi, kan ya da serum kirlenmeye inhibe olması mümkündür. Bu daha kapsamlı ve ek yıkama adımları ve / veya atma kanlı veya kontamine amniyon parçaları ile çözülebilir. Enzim Kuluçka süresi arttırılmış olur, ancak bu hücre canlılığı için zararlı olabilir. Mezenkimal hücrelerle canlılığı ya da kirlenme özeti zamanı azaltarak önlenebilir azalmış. Bununla birlikte, thilarındaki ayrıca hücrelerin toplam verim düşebilir. 30 dakika ila 2 saat arasında değişen sürelerle bu protokol için kullanılabilir. Bu kez istenilen hücre saflık ve toplam verim / canlılığı için optimize edilmesi gerekir. Bu tekniğin bir sınırlama artan hücre verimi ya da canlılığı birbirine pahasına gelebilir olduğunu. Buna ek olarak, serumsuz bileşenler şu enzimatik aktivite maruz kaldıktan sonra, hücre viyabilitesini muhafaza olarak etkili değildir.
Hücreler, bir sıcaklığı kontrol edilen bir sıvı azot depolama sistemi içinde hücre canlılığı veya metabolizma kaybına herhangi bir önemli azalma olmadan dondurularak saklanmış olabilir. Bu basit izopropanol dolu kriyokoruma cihazdan bir state-of-the-art kontrollü hız donma sistemine değişebilir. Bizim bilgilerimize göre, bu sistemde hAECs için en uygun dondurma oranı, hücre canlılığı ve post-çözülme metabolizması uygun bakım 1 ° C / dak sonuçlarının ancak standart oranı, tespit edilmemiştir. Çözdürme o sırasındaf dondurulan hücreler, DMSO hücre maruziyeti azaltmak için minimumda eritme zaman tutmak için önemlidir. Hücreler takmak ve taze izole hücreleri kültür kıyasla dondurarak saklama ve eritme sonrasında daha düşük oranda çoğalırlar olabilir.
Kültür hücreleri, hücre sayısı ya da ve / veya in vitro manipülasyonu alt baş karakterizasyon için artırmak için klinik uygulama için, arzu edilebilir. Okuyucular in vitro manipülasyon kendi özel bu hücrelerin klinik uygulamada yer alan düzenleyici yollarını değiştirmek nasıl anlamak gerekir. Böyle EpiLife gibi bir hayvan ürünü içermeyen kültür ortamı, hAECs bakım ve genişlemesi için uygun olduğunu araştırdık. Bununla birlikte, bu tür bir hücre tipi için artan büyüme sonuçları elde etmek amacıyla büyüme faktörü konsantrasyonları optimize etmek için gereklidir. Bir insan kollajen-kaplama matrisi kullanarak kültür sırasında hücre yapışması sorunu, kaplama verimliliğini arttırır. Bununla birlikte, uzun süreli e, aşağıdakienzimatik sindirme ile Xposure plaka oluşturma verimliliği alt uygun olacaktır.
Özetle, bu protokol mevcut iyi imalat uygulamaları (cGMP) kurallarına uygun olarak hayvansal ürün içermeyen reaktifler kullanılarak insan amniyon epitel hücreleri (hAECs) izolasyonunu ve kültürünü kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Alternatif izolasyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntemin bir avantajı, uygun hücre verimi, canlılığı ve potansiyelini muhafaza ederken, bu hücreler, insanlar için zararlı hayvan patojenleri teslim riski olmaksızın dondurulmuş ve kültürlendi, karakterize edici özelliği, izole edilebilir olmasıdır. Klinik araştırmalarla klinik öncesi hayvan çalışmalarından hareket eden araştırmacılar için, bu metodolojiler büyük ölçüde, düzenleyici onayı hızlandırmak riskleri azaltmak ve onların tedavi edici hücre popülasyonunun kalitesini artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
