Summary
För att analysera hjärt genuttrycksprofilerna under zebrafisk hjärta utveckling har totalt RNA extraheras från isolerade hjärtan. Här presenterar vi ett protokoll för insamling funktionella / slående hjärtan genom snabb manuell dissektion från zebrafisk embryon för att få hjärt-specifikt mRNA.
Abstract
Den zebrafisk embryonala hjärtat består av bara några hundra celler, vilket motsvarar endast en liten del av hela embryot. Därför, för att förhindra hjärt transkriptom från att maskeras av den globala embryonala transkriptom, är det nödvändigt att samla in tillräckligt många hjärtan för ytterligare analyser. Eftersom zebrafisk hjärt utveckling fortskrider snabbt, hjärt insamling och RNA utvinningsmetoder måste vara snabb för att säkerställa homogenitet av proverna. Här presenterar vi en snabb manuell dissektion protokoll för insamling funktionella / slående hjärtan från zebrafisk embryon. Detta är en viktig förutsättning för efterföljande hjärtspecifika RNA-extraktion för att bestämma hjärtspecifika genuttryck nivåer genom transkriptom analyser, såsom kvantitativ realtids-polymeras kedjereaktion (RT-qPCR). Metoden är baserad på differentialvidhäftningsegenskaper hos zebrafisk embryonala hjärtat jämfört med andra vävnader; Detta möjliggör snabb physiskt separation av hjärt från extra hjärtvävnad genom en kombination av fluid skjuvkraft störningar, stegvis filtrering och manuell insamling av transgena fluorescerande hjärtan.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) används ofta i utvecklingsbiologi för att studera organogenes in vivo på grund av dess snabba, öppna och utomkveds embryonal utveckling, kombinerat med liten storlek och tillgången till transgena reporter linjer med vävnadsspecifikt uttryck av fluorescerande proteiner. Denna lilla ryggradsdjur är särskilt väl lämpad för att studera hjärtutveckling eftersom syresättning av tidiga zebrafisk embryot inte förlitar sig på hjärtslag och blodflöde; Dessa funktioner har tillåtit karakterisering av ett stort antal kardiovaskulära mutanter 1,2 och zebrafisk är nu en allmänt erkänd modellorganism för att studera hjärtsjukdomar 3.
För att studera genuttryck under fosterutvecklingen, är avskrifter vanligen analyseras genom hela montera in situ hybridisering (WISH) 4, RT-qPCR 5, mikromatriser 6, eller nästa generations sekvensering (RNA-Seq) 7. MedanWISH tillåter en spatial-temporal analys av genuttryck inom hela embryot, är transkriptnivåer normalt bedöms med RT-qPCR, mikromatriser eller RNA-Seq tillvägagångssätt. Men dessa metoder kräver vävnads anrikning för specifik genuttryck profilering.
Eftersom zebrafisk embryonala hjärtat representerar en liten del av hela embryot, transkriptom studier under hjärt utveckling kräver ett protokoll för dissektion och anrikning av hjärtan. Dessutom, för att erhålla fysiologiskt relevanta data är det viktigt att upprätthålla hjärtvävnaden fullt fungerande tills RNA-extraktion. Här beskriver vi ett protokoll för att snabbt isolera fysiologiskt normalt och slående hjärtan från hundratals zebrafisk embryon för att effektivt få hög kvalitet RNA-prover för vidare analyser. Den nuvarande metoden bygger på protokollet rapporterats av Burns och MacRae, 2006 8. För anrikning av hjärtvävnad, båda metoderna använder en transgen myocardial reporter linjeoch dra nytta av de olika vidhäftningsegenskaperna hos zebrafisk embryonala hjärtan kontra andra vävnader. I korthet, genom att pipettera många embryon upp och ned genom en smal pipettspets, hjärtan samtidigt frigörs från embryonala kroppar och därefter separeras från embryonala skräp i två snabba filtreringssteg; fluorescensmärkta hjärtan är sedan manuellt sorteras från återstående skräp och uppsamlas för ytterligare bearbetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna för djurskötsel i den tyska och Berlin statens lag; zebrafisk hantering övervakades av den lokala myndigheten för djurskydd (LaGeSo, Berlin-Brandenburg).
1. Skaffa Zebrafish embryon för Heart Extraction
- Cross hjärtreporterzebrafisk såsom Tg (myl7: EGFP) twu34 transgen linje 9 för att erhålla embryon med hjärtspecifikt uttryck av GFP.
- Behåll embryona i ägget vatten vid 28,5 ° C tills den önskade fosterstadiet 10,11. Se till att den insamlade embryot befolkningen är homogen både genetiskt och genom utvecklingsstadiet för att begränsa variationer i genuttryck.
- Dechorionate embryona manuellt.
2. dissekera Zebrafish Embryonala Hjärtan
OBS: Håll alla lösningar på is. Om möjligt, gör teamwork: en person dissekerar hjärtan från embrulltobak medan en annan person Sorterar hjärtan under fluorescens stereomikroskop. Detta medger bearbetning av flera hundra embryon i ett par timmar.
- Överför ca 100 embryon i ett 1,5 ml centrifugrör. Söva embryona med tricaine (0,16 mg / ml i E3-medium). Fortsätt när embryona tydligt bedövas (de inte simma och sediment på botten av röret, men deras hjärtan är fortfarande slår).
- Avlägsna tricaine / E3-lösning och tvätta embryona gång med 1 ml L-15/10% FBS medium och underhålla på is.
OBS: L-15/10% FBS medium är viktigt att hålla organ och celler vid liv under hela dissektion proceduren tills hjärtan har överförts till RNAlater eller Trizol. - Tillsätt 1 ml L-15/10% FBS medium till embryona och pipett upp och ner 5-8 gånger med en runda Gel Loading Tips tills äggulan är fullständigt upplöst. Pipet embryona droppvis på ytan av lösningen, så att droppen kommer att brista ochembryona försiktigt störs.
OBS: Hur kraftigt och hur ofta embryona måste pipetteras upp och ned beroende på utvecklingsstadiet av embryona, dvs. mer pipettering behövs vid sena stadier (t.ex. vid 56 HPF). - För den första omgången av dissekerade embryon, bedöma integriteten av embryon och andelen dissekerade hjärtan under ett stereomikroskop, eftersom vissa hjärtan kan sitta kvar embryona om alltför försiktigt pipetteras. Justera sättet för pipettering för nästa omgång av dissektion därefter.
OBS: Använd låga behålla pipettspetsar och mikrocentrifugrör att minimera hjärtan fastnar på plasten. - Applicera provet på en 100 pm filter placerades på en 50 ml centrifugeringsrör; skölj 1,5 ml rör med en ml L-15/10% FBS-medium och sedan använda detta till filtret för att minimera förlust av provet (vissa hjärtan kan klibba till väggarna hos röret). Tvätta filtret två gånger med 1 ml L-15/10% FBS. I detta steg hjärtan passerar genom filtret och uppsamlas i 50 ml rör.
- Applicera genomströmning på ett 30 ^ m filter placerades på en 15 ml centrifugeringsrör och skölj filtret en gång med 1 ml L-15/10% FBS-medium. I detta andra filtreringssteg, är hjärtan kvarhålls på filtret och mindre skräp tvättas bort.
- Vänd filtret upp och ner och spola hjärtan ur filtret i en 1% -ig belagda petriskål genom att tillämpa tre konsekutiva tvättar med 1 ml L-15/10% FBS.
- Separera manuellt GFP-positiva hjärtan från icke-fluorescerande embryonala skräp (t.ex. ögonlinser) med en pincett under ett fluorescensstereomikroskop och koncentrera dem i mitten av skålen. Samla dem enligt steg 3.
OBS: Om embryona är äldre än 24 HPF, bör hjärtan att slå, vilket tyder på att vävnaderna fortfarande fysiologiskt normala.
3. isolering av mRNA från Dissected Hearts
- Samla hjärtan i minsta möjliga volym (t.ex. 10 pl) och pipett till en 1,5 ml rör innehållande 0,75 ml RNAlater (på is). Verifiera att inga hjärtan kvar i pipettspetsen genom att visa den under ett fluorescensstereomikroskop.
- Alternativt, om en kemisk huva finns i omedelbar närhet av fluorescensmikroskop, överföra insamlade hjärtan i Trizol (VIKTIGT) under kemiska huven. Detta kringgår den möjliga förlusten av hjärtan fastnar i pipettspetsen och även under centrifugering av hjärtan (steg 3,4, 3,5 och 3,7). Pool hjärtan från flera omgångar av isolering i samma rör med Trizol och gå direkt till steg 3,8; den slutliga volymen bör inte överstiga 10% av den ursprungliga Trizol volymen.
OBS: Läs Trizol Säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Handtag Trizol reagens under en huv och slitage rekommenderas personlig skyddsutrustning. Undvik kontakt med hud, ögon och clothing. Avlägsna alla antändningskällor. - Pool hjärtan från flera omgångar av isolering i samma rör med RNAlater (på is), eftersom effektiviteten för RNA-isolering förbättras med mängden vävnad uppsamlades. Om den sammanlagda provvolymen överstiger 10% av den ursprungliga RNAlater volymen använder ett extra rör med 0,75 ml RNAlater för lagring (på is).
- Centrifugera proverna vid 15.700 xg under 20 minuter vid 4 ° C för att sedimentera hjärtan.
- Under ett fluorescensstereomikroskop, samla noggrant så mycket supernatant som möjligt in i en 1% agaros-överdragna petriskål innehållande 3 ml L-15/10% FBS-medium, men stör inte de sedimente hjärtan i botten av centrifugeringsröret. Eftersom upp till 15% av de hjärtan kan förbli i supernatanten beroende på den höga viskositeten hos RNAlater, hämta dem som beskrivs i steg 3.7.
- Under en kemisk huva, lägga 0,5 ml Trizol till röret med sedimente hjärtan och hålla på is.
- Enligt det fluorescerande microscope, överföra hjärtan (från steg 3,5) från 1% -ig belagda skålen innehåller FBS lösningen RNAlater / L-15/10% till en annan 1% -ig belagda skålen med 3 ml L-15/10% FBS för att späda ut RNAlater. Samla hjärtan i mitten av petriskålen och överföra dem i en liten volym i röret av sedimenterade hjärtan i Trizol under ett dragskåp.
- Vortex 1,5 ml rör innehållande hjärtan i Trizol att störa hjärtan och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur.
- Under en kemisk huva, tillsätt 100 pl kloroform (VIKTIGT), blanda väl och överföra Trizol / kloroform lösningen i en 1,5 ml färdig spunnen PLG rör (centrifug 30 sekunder vid maximal hastighet före användning). Inkubera under 3 min vid rumstemperatur.
OBS: Läs kloroform MSDS före användning. Handtag kloroform reagens under en huv och slitage rekommenderas personlig skyddsutrustning. Undvik kontakt med hud, ögon och kläder. Hålls borta från inkompatibler som metaller, alkalier. - CentrifugeGE provet vid 15.700 xg under 15 minuter vid 4 ° C och överföra den vattenhaltiga fasen till ett nytt 1,5 ml rör.
- Lägg 5-10 ug glykogen och 250 ul förkyld (vid -20 ° C) isopropanol; Blanda väl och inkubera över natten vid -20 ° C.
- Centrifugera provet vid 15.700 xg under 30 minuter vid 4 ° C och kassera supernatanten.
- Tvätta pelleten med 1 ml 75% etanol, centrifugera vid 15.700 xg under 15 minuter vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
- Låt etanolen avdunstar genom torkning av pelleten vid rumstemperatur tills den blir vit (t.ex. för 10-15 min).
- Lägg 20 ul RNas-fri DDH 2 O till pelleten och inkubera under 10-15 minuter vid 55 ° C för att lösa RNA; sedan hålla på is.
- Bedöm RNA koncentration och renhet genom absorbans mätning. Bedöm RNA integriteten genom att köra provet på en 1% agarosgel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi ett representativt hjärta dissektion experiment med zebrafisk Tg (myl7: GFP) twu34 transgen linje 9, som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) enbart inom myokardiet (fig. 1). Vi samlas både dissekerade hjärtan och embryon från vilka de härrör att bedöma renheten av hjärtat provet. I korthet homozygot Tg (myl7: GFP) till twu34 zebrafisk 9 utparade med vild-typ så att alla embryonala hjärtan GFP märkta. Några 500 embryon (56 HPF) överfördes till 1,5 ml rör (ca. 100 embryon i varje) (fig. 1A1, 1B). Varje rör bearbetades såsom beskrivits i protokollet sektionen (steg 2) och i figur 1A. Hearts släpptes genom att pipettera upp och ned flera gånger (fig. 1A2) och sedan appliceras på en 100 m filter (fig. 1A3). Stora bitar av embryonal vävnad kvar i detta filter; denna fraktion hämtades och sätta i Trizol for RNA-extraktion för att erhålla ett "embryo utan hjärta" RNA-prov (fig. 1A3). Genomflödet innehåller hjärtan sedan appliceras på en 30 nm-filter (fig. 1A4), som behöll hjärtan och vävnadsrester av liknande storlek. GFP-positiva hjärtan spolades ut ur filtret till ett agaros-överdragna petriskål (fig. 1A5, 1C), snabbt samlades i mitten av skålen under ett fluorescerande stereomikroskop och överfördes till 0,75 ml RNAlater (Fig. 1A6). Inom denna rör med RNAlater, poolade vi hjärtan som härrör från 5 dissektion rundor (ung. 300 hjärtan från 500 embryon som representerar en utvinnings verkningsgrad på cirka 60%). En jämförelse av hjärt proverna före sortering från skräp från embryon vid 56 HPF (Fig. 1C) kontra 36 HPF (Fig. 1C ') visas i figur 1. I 56 HPF, störning av embryon gav mer embryonala skräp ( såsom linser, pilspets, Fig. 1C) än vid 36 HPF efter 30 pm filtreringssteg (fig. 1C).
För att bestämma renheten av 56 HPF "hjärta" prov, vi jämförde uttrycksnivåer av hjärt kontra extra hjärttranskript i "hjärtat" och "embryo utan hjärta" prover av RT-qPCR. För detta ändamål extraherade vi mRNA från dessa två prover och bedömde RNA kvalitet på en agarosgel (Figur 2A) och kvantitet av absorbansmätning (tabell 1) som beskrivs i protokollet sektionen (steg 3). Den ca.. 300 hjärtan gav 660 ng RNA. Därefter syntetiserades cDNA med användning av M-MLV omvänt transkriptas RNas H (-) och slumpmässiga hexamerer enligt Tillverkarens dokumentation, och RT-qPCR Experimenten genomfördes såsom beskrivits 12. Relativa genuttryck nivåer beräknades för olika vävnadsspecifika markörer såsom myosin ljus polypeptid 7 [myl7, en myocardial markör] 9, kinasinsats domän-lik [kdrl, en endotel / endokardiell markör] 13, hemoglobin beta embryonala-1.1 [hbbe1.1, en erytrocyt markör] 14, kristallin-alfa A [cryaa, en ögonlins markör] 15, och gliafibrillärt surt protein [GFAP, ett centrala nervsystemet markör] 16 (Figur 2B). Den zebrafisk eukaryota translationsinitiering faktor 1B [eif1b] 12 användes som en intern referens gen (se tabell 2 för GenBank ID-nummer, primer sekvenser, PCR-produktstorlekar och vävnadsspecificitet för varje gen). Som väntat blev myl7 höganrikat i "hjärtat" prov jämfört med "embryo utan hjärta" prov (Fig. 2B). Den endotelial cellmarkör kdrl befanns vara måttligt berikad i hjärtat provet, som förväntat (cirka 40% av hjärtcellerna vid 56 HPF är kdrl uttryckande endokardiella celler) (fig. 2B). Erytrocyt markör hbbe1.1 var överrepresenterade i "hjärtat" prov, även om hjärtan var still stryk efter dissektion, vilket bör utvisa röda blodkroppar från hjärtat (fig. 2B). Däremot uttrycksnivåer i CNS och lins markörer (GFAP och cryaa respektive) var extremt låg i "hjärtat" prov (Fig. 2B). Sammantaget drar vi slutsatsen att de hjärt dissektion protokoll avkastningen hög kvalitet och hjärtspecifika RNA från hela zebrafisk embryon.
Figur 1. Hjärta extraktion från zebrafisk embryon. (A) Scheme skilhjärt extraktionsmetod. Omkring 100 levande embryona uppsamlas i ett 1,5 ml rör (A1, B, B '), bedövades och sedan pipetter upp och ned flera gånger genom en smal pipettspets att frigöra hjärtan (A2). Den resulterande lösningen innehållande de embryonala vävnaderna (A2) appliceras sedan på en 100 pm filter (A3). Embryonala vävnader utan äggula och hearts och stora embryonala skräp kvar i filtret (A3). Genomflödet uppsamlas i ett 50 ml rör (A3) och applicerades sedan på en 30 pm filter (A4). De hjärtan och små skräp hålls kvar i 30 pm filter och överfördes i en liten agaros-belagda petriskål (A5, C, C '). EGFP märkta hjärtan (C, C '; pil) manuellt sorteras från den kvarvarande skräp, såsom linser (C, pilspets), och samlas i RNAlater (A6). Detta förfarande upprepas åtminstone fem gånger och alla hjärtan poolas samman för ytterligare bearbetning. (BC ') överlagring av fluorescens (EGFP i grönt) och DIC bilder av levande transgena Tg (myl7: EGFP) twu34 embryon vid 56 HPF (B, C) och 36 HPF (B', C) vid två steg av hjärtat dissektion förfarande: före embryo dissektion (B, B ') och strax efter spolning från 30 pm filter före sortering hjärtan från skräp i petriskål (C, C'). Skala bar: 500 nm.
Figur 2. Analys av RNA kvalitet och renhet genom elektrofores och RT-qPCR, respektive. (A) Total RNA från "hjärtat" prov (2 pl) och från "embryo utan hjärta" prov (1 pl), som härrör från 56 HPF embryon, beslutade om en 1% agarosgel. Prominent S18 och S28 rRNA-banden visar att RNA inte bryts ned. (B) Relativa uttrycksnivåer av vävnadsspecifika markörer myl7 (myokardiet), kdrl (endotel), hbbe1.1 (erytrocyter), cryaa (lins), och GFAP (CNS) bestämt med RT-qPCR för "hjärtat" prov normaliserad till "embryo utan hjärta" prov. De RT-qPCR experiment utfördes som tekniska triplikat och data ges som medelvärde ± SEM. Ett oparat t-test-analys utfördes. **** P <0,0001; ** P <0.005. bp, baspar.
| prov-ID | ng / ul | A260 | A280 | 260/280 | 260/230 | markören abs. | 340 rå |
| hjärtan | 32,97 | 0,82 | 0,41 | 2,01 | 0,35 | 2,355 | 0,031 |
| embryon utan hjärta | 568,82 | 14.22 | 7,00 | 2,03 | 2,04 | 6,965 | 0,018 |
Tabell 1. RNA kvantitet och kvalitet genom spektrofotometrisk mätning. Den kvantitet och kvalitet av RNA i "hjärtat" och "embryo utan hjärta" prover från 56 HPF embryon mätt med spektrofotometri.
| GEne | GenBank # | primersekvens | PCR-produktens storlek (bp) | Vävnadsspecifikt markör |
| myl7 | BX248505 | F: 5'-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 ' | 163 | myokardium |
| R: 5'-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 ' | ||||
| kdrl | CR759732 | F: 5'-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 ' | 170 | endotel / endokardium |
| R: 5'-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 ' | ||||
| GFAP | BX324157 | F: 5'-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 ' | 247 | centrala nervsystemet |
| R: 5'-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 ' | ||||
| cryaa | BX248514 | 190 | ögats lins | |
| R: 5'-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 ' | ||||
| hbbe1.1 | BC095024 | F: 5'-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 '8 | 102 | erytrocyt |
| R: 5'-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 '8 | ||||
| eif1b | BX323079 | F: 5'-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 '12 | 195 | referens gen |
| R: 5'-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 '12 |
Tabell 2. Primrar som användes för RT-qPCR experiment. Namn, GenBank anslutning, sekvens, PCR produktstorlekar och vävnadsspecificitet visas för alla gener analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll möjliggör snabb anrikning av zebrafisk embryonala hjärtvävnad för genuttryck analyser. Kvantitet och kvalitet av hjärtspecifika RNA-prov beror mycket på några avgörande steg: först, är den mängd av provet avsevärt förbättrade, om förlusten av hjärtan förhindras vid varje steg i protokollet, eftersom RNA rening endast fungerar med tillräcklig utgångsmaterial. För det andra, renheten av provet, som är helt beroende av försöksledaren, bestäms genom att sortera och samla hjärtan i petriskål med strikt exklusive andra vävnader. Tredje, beroende provkvalitet kritiskt på att begränsa RNA nedbrytning som kan uppstå vid störningar av embryon; detta uppnås genom användning av cellodlingsmediet för att undvika celldöd och genom att hålla proven på is. RNA nedbrytning stoppas när hjärtan har överförts till RNAlater eller Trizol. Att hjärtan slå i petriskålen kraftfullt visar att hjärt tFrågan är fysiologiskt normala efter dissektion.
Vi rekommenderar att du börjar med minst 300 hjärtan (dvs. cirka 500 embryon), från vilka tillräckligt RNA tryggt kan utfällda (tillsammans med 5-10 ug glykogen). Men vi kan inte utesluta än färre hjärtan skulle räcka för småskaliga experiment. Det är helt enkelt viktigt att ha tillräcklig RNA för att bestämma den koncentration, renhet och integritet av provet. Vänligen, notera att RNA innehållet kan variera beroende på utvecklingsstadiet och på den genetiska bakgrunden av embryot (t.ex. i fallet med mutanter med onormala hjärtan). Därför skulle det minimalt med embryon som krävs för ett experiment måste fastställas i varje enskilt fall.
Det finns några tekniska skillnader mellan detta protokoll och en tidigare protokoll från Burns och MacRae, och vi tror inte att det finns en signifikant skillnad i effektivitet eller hastighet mellan de båda protokollen.Vi har dock infört förbättringar: Viktigast, föreslår vi att använda RNAlater stabiliseringslösning. Detta är viktigt av två skäl: för det första, att samla in högkvalitativa RNA för ytterligare experiment såsom RT-qPCR genom att minska RNA degradering till ett minimum, eftersom RNAlater inaktiverar omedelbart RNaser och stabiliserar RNA i vävnader eller celler. För det andra, är RNAlater avgörande för att tillåta insamling av hjärtan på olika dagar, vilket är viktigt när antalet embryon är en begränsande faktor. Det gör också sammanslagning av hjärtan som kan vara nödvändiga för att få en tillräcklig mängd utgångsmaterial för effektiv isolering av hög kvalitet RNA med Trizol. Överföra hjärtan direkt i Trizol skulle kringgå användningen av RNAlater, men på grund av hälsorisker, detta steg måste utföras under en kemisk huva, som inte kan antas vara placerad i direkt närhet av fluorescensmikroskop för alla praktiker .
Vi hittade thatt hjärtat dissektion fungerar bra med embryon mellan 20-72 HPF [12; opublicerade data för 72 HPF]. Dock blir svårare med ökande embryonala ålder och längd extraktionsproceduren: ytterligare och mer kraftfulla pipettering krävs för att framgångsrikt introducera embryona in i den långa spetsen och skilja hjärtan från andra embryonala vävnader. Som ett resultat, är mer embryonala skräp närvarande i provberedning (se figur 1C, C ') och försöksledaren måste vara mer försiktig i att sortera hjärtan i petriskålen.
Hjärtat dissektion Protokollet presenteras här möjliggör en analys av hela hjärtuttrycksprofilen för olika celltyper, inkluderande myokardium och endokardium. Ytterligare separation av hjärtcelltyper skulle kunna uppnås genom att använda endocardial- och myokard-specifik-reporter linjer [t ex Tg (myl7: GFP) twu34 och Tg (kdrl: mCherry is5] 9, 17 för hjärt extraktion kombinerat med FACS sortering. I motsats till Översättning Ribosom Affinity Purification (TRAP) metoden 18,19, vilket gör att vävnadsspecifika transkriptionsanalys utan vävnads dissektion, är vår inställning inte begränsad till aktivt-översatta mRNA men inkluderar även icke-aktivt-översatta mRNA eller icke-kodande RNA. En alternativ tillämpning av hjärtat dissektion protokollet är att analysera proteinuttryck inom hjärtan: proteinnivåer kan bedömas genom Western blot och protein lokalisering kan analyseras med immunohistokemi, som anatomi hjärtat bevaras under dissektion förfarandet.
Sammanfattningsvis presenterar vi här en detaljerad protokoll för dissekera funktionella / slående hjärtan från hundratals embryon i en kort tid, som kan användas för att erhålla hjärtspecifika RNA (eller protein) prover av hög renhet för vidare analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1.5 ml centrifugation tubes | |||
| 15 ml and 50 ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µl in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
