Syntes av Immunotargeted Magneto-plasmoniska nanokluster

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för syntes av magneto plasmoniska nanopartiklar med en stark magnetiskt moment och en stark nära infraröd (NIR) absorbans. Protokollet innehåller också antikroppar konjugering till nanopartiklarna genom Fc-delen av olika biomedicinska tillämpningar som kräver molekylär specifik inriktning.

Abstract

Magnetiska och plasmoniska egenskaper kombinerade i en enda nanopartikel ger en synergi som är fördelaktigt i ett antal biomedicinska tillämpningar, inklusive kontrastförbättring i nya magnetomotoriska avbildningsmetoder, samtidig infångning och detektion av cirkulerande tumörceller (CTCs) och multimodal molekylär avbildning i kombination med fototermisk behandling av cancerceller. Dessa ansökningar har stimulerat betydande intresse för utveckling av protokoll för syntes av magneto plasmoniska nanopartiklar med optisk absorbans i det nära infraröda (NIR) region och ett starkt magnetiskt moment. Här presenterar vi en ny protokoll för syntes av sådana hybridnanopartiklar som är baserad på en olja-i-vatten-mikroemulsionsmetoden. Det unika med det protokoll som beskrivs här är syntesen av magneto plasmoniska nanopartiklar av olika storlekar från primärblock som också har magneto plasmoniska egenskaper. Detta tillvägagångssätt ger nanopartiklar med hög densitet av magnetiska och plasmoniska funktionaliteter som är utbredda över hela nanopartikelvolymen. De hybridnanopartiklar lätt kan funktionaliseras genom att fästa antikroppar via Fc-delen lämnar Fab-delen som är ansvarig för antigenbindning tillgängliga för inriktning.

Introduction

Hybridnanopartiklar som består av olika material med olika fysikalisk-kemiska egenskaper kan öppna nya möjligheter i biomedicinska tillämpningar inklusive multimodal molekylär avbildning, terapi leverans och uppföljning, ny screening och diagnostiska analyser ^1-3. Kombinationen av plasmoniska och magnetiska egenskaper i en enda nanopartikel är av särskilt intresse eftersom det ger en mycket stark ljusspridande och absorption tvärsnitt associerade med plasmon resonanser och känslighet för ett magnetfält. Till exempel var magneto plasmoniska nanopartiklar används för att öka kontrasten i mörkfältsavbildning av märkta celler genom att anbringa en tidssignalmodulering via en extern elektromagnet ^3-5. På senare tid har en liknande princip tillämpas i utvecklingen av en ny avbildningsmodalitet - magneto-fotoakustisk avbildning, där magneto plasmoniska nanopartiklar möjliggör stora förbättringar i kontrast och signal-till-bakgrunds råttaio ^6,7. Det visade sig också att de hybridnanopartiklar kan användas för samtidig infångning och detektion av cirkulerande tumörceller i helblod och in vivo ^8,9. Vidare är magneto-plasmoniska nanopartiklar lovande theranostic medel som kan användas för molekylär specifik optisk och MR-avbildning i kombination med fototermisk behandling av cancerceller ^10.

Flera metoder undersöktes för syntes av magneto plasmoniska nanopartiklar. Exempelvis Yu et al. Utnyttjad nedbrytning och oxidation av Fe (CO) ₅ på guldnanopartiklar för att bilda hantel liknande bifunktionella Au-Fe ₃ O ₄ nanopartiklar ^11. Wang et al. Har syntetiserat guldbelagda järnoxidnanopartiklar med hjälp av termisk nedbrytning metod ^12. Några andra metoder beroende av beläggningspolymer eller aminfunktionella molekyler på magnetiska nanopartiklar kärna följt av avsättning av aggamla skalet på polymerytan för att skapa hybridpartiklarna ^7,13. Därutöver har järnoxidnanopartiklar bifogas guldnanostavar via elektrostatiska interaktioner eller en kemisk reaktion ^14,15. Även om dessa metoder ger magneto plasmoniska nanostrukturer, de kompromissa till viss del egenskaper hos magneto plasmoniska kombination som optisk absorbans i det nära infraröda (NIR) fönster eller en stark magnetiskt moment som båda är mycket önskvärt i biomedicinska tillämpningar. Exempelvis hantel Au-Fe ₃ O ₄ nanopartiklar har en plasmonresonans topp vid 520 nm vilket begränsar deras användbarhet in vivo på grund av hög vävnads grumlighet i denna spektralområdet. Dessutom är magneto plasmoniska nanopartiklar som produceras av nuvarande protokoll begränsad till bara en ¹¹ eller få (färre än 10) ^14,15 superparamagnetiska delar (t.ex. järnoxidnanopartiklar) som är betydligt mindre än vad som kunde vara achieved i en tätt packad nanostruktur. Till exempel kan en tätt packad 60 nm diameter sfäriska nanopartikel innehåller i storleksordningen tusen av 6 nm superparamagnetiska nanopartiklar. Därför finns det ett stort utrymme för att förbättra magnetiska egenskaper hos hybridnanopartiklar. Dessutom har några av de tidigare beskrivna protokollen är relativt komplicerat och kräver noggrann optimering för att undvika partikelaggregation under syntes ^14,15.

Här beskriver vi ett protokoll för syntes av magneto plasmoniska nanopartiklar med en stark magnetiskt moment och en stark NIR absorbans som tar stora begränsningarna i det nuvarande teknik. Syntesen har sitt ursprung i olja-i-vatten-mikroemulsion metoden ^16. Den är baserad på montering av nanopartiklar av en önskad storlek från en mycket mindre primärpartiklar. Detta tillvägagångssätt har använts med framgång för att framställa nanostrukturer av ett enda material, såsom guld, järnoxid, och halvledar primary partiklar ^16. Vi utökade den till syntes av magneto plasmoniska nanopartiklar av, först, vilket gör oxidkärnpartiklar 6 nm guld diameter skal / järn och då monterar de primära hybrid partiklarna i den slutliga sfäriska nanostruktur. Montering primära partiklar i nanokluster inte bara tillåter förbättrar egenskaperna hos ingående nanopartiklar, som att uppnå en starkare magnetiskt moment samtidigt som superparamagnetiska egenskaper, men tar också fördel av samspelet mellan enskilda nanopartiklar så sätt skapar nya egenskaper frånvarande från de ingående nanopartiklar, till exempel stark optisk absorbans i NIR-fönstret. Detta protokoll ger hybridnanopartiklar med en hög densitet av magnetiska och plasmoniska funktionaliteter. Efter primärpartiklar syntetiseras, är vår metod i huvudsak en enkel en-kärls-reaktion. Den övergripande plasmonresonans styrka och magnetiskt moment bestäms av ett antal primärpartiklar och, finsöre, kan lätt optimeras beroende på en ansökan. Dessutom utvecklade vi också ett förfarande för antikroppskonjugering till hybridnanopartiklar för olika biomedicinska tillämpningar som kräver molekylär specifik inriktning. Antikroppar är fästa genom Fc-delen lämnar Fab-delen som är ansvarig för antigenbindning tillgängliga för inriktning.

Protocol

1. Instrumentation och Glas Förberedelse

1. Bär lämplig skyddsutrustning, dvs en labbrock, engångshandskar och skyddsglasögon.
2. Anslut en rundkolv till en kondensor och doppa den i en silikonolja bad med en temperaturövervakning med en termometer. Placera en värmekälla (t ex värmeplatta) under oljebad (Figur 1). Använd en termometer som kan mäta temperaturen är högre än 260 ° C.

2 Syntes av primär Hybrid Magneto-plasmoniska Nanopartiklar

1. Göra Magnetkärnnanopartiklar
   1. Lägg 353,2 mg (1 mmol) järn (III) acetylacetonat, 1 ml (2 mmol) oljesyra, 1 ml (2 mmol) oleylamin, 1,292 g (5 mmol) 1,2-hexadekandiol, och 10 ml fenyleter till en rund -bottom kolv.
   2. Rör om blandningen kraftigt med användning av en magnetisk omrörarstav och upphetta till 250-260 ° C under 1 h under återflöde. Sedan vänta på lösningen svalnaned till RT. Se till att temperaturen är under 260 ° C för att förhindra kokning av fenyleter och förhindra en explosion av reaktionsblandningen från den rundbottnade kolven till kondensatorn.
      VARNING: Reaktionsblandningen är mycket het och de kemikalier som kan orsaka irritation. Måste fungera under en huv och bär lämplig personlig skyddsutrustning. Sörj för god ventilation för oljebad.
      OBS! Oljebad hålls vid 250-260 ° C temperatur i 1 timme under syntes av de magnetiska nanopartiklar. I princip kan en Pyrex-glas skålen kan användas för detta ändamål. Men den maximala kontinuerliga temperatur Pyrex glas ~ 260 ° C enligt leverantörsinformation. Därför ger en metallbehållare ett säkrare alternativ för reaktionen eftersom det tål en högre temperatur och håller längre under flera körningar.
2. Nedfall en guldskal på magnetkärnnanopartiklar
   1. Lägg 411.5 mg (1,1 mmol) guld esstate, 0,25 ml (0,75 mmol) oljesyra, 1,5 ml (3,0 mmol) oleylamin, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-hexadekandiol, och 15 ml fenyleter till en rundbottnad kolv.
   2. Tillsätt 5 ml suspension av magnetiska nanopartiklar från steg 2.1. Värm reaktionsblandningen till 180 ° C och hålla under återflöde i 1 timme. Vänta på lösningen att svalna till RT.
   3. Lägg 50 ml etanol för att utfälla de hybrida primära nanopartiklar, följt av centrifugering vid 3250 x g under 15 min.
   4. Resuspendera fällningen i 25 ml hexan med en badsonikator. Tillsätt 25 ml etanol för att fälla de primära hybrid nanopartiklar. Centrifugera vid 3250 xg under 15 min och slamma fällningen i hexan. Upprepa detta steg tre gånger.
   5. Torka de utfällda primära hybrid nanopartiklar i vakuumexsickator O / N. Bekräfta att partiklarna är helt torra.

3 Hybrid Magneto-plasmoniska nanokluster Syntes och storlek Separation

1. Tillsätt lösningen från steg 3,1-10 ml vattenhaltig lösning av natriumdodecylsulfat (2,8 mg / ml) i en 20 ml glasampull med bifogade mössor. Lägg upphävandet av primära hybrid nanopartiklar droppvis för att undvika blandning av de båda faserna innan nästa steg.
2. Sonikera två-fas-lösning i en badsonikator under 2 h, följt av upphettning i ett vattenbad vid 80 ° C under 10 min. Vänta på lösningen att svalna till RT.
   1. Fyll vatten till arbetsnivå linje ultraljudsbadet. Centrera glasampullen i sonication bath. En emulsion blanketter direkt mellan de två faserna. Skaka tvåfas-lösning för hand efter början av ultraljudsbehandling; detta underlättar blandning mellan fas innehållande primära hybrid nanopartiklar och bottenvattenfasen.
      OBS: Observera that det sonicator värms upp efter 2 timmar i drift.
3. Centrifugera hybrid nanokluster suspensionen vid 100 xg under 30 minuter. Samla både fällningen och supernatanten. Resuspendera fällningen i 0,1 mM natriumcitrat i 10 min ultraljudsbehandling. Den förväntade storleken av nanokluster är ~ 180 nm i diameter.
4. Överför supernatanten från steg 3,3 till en ny koniska rör.
5. Centrifugera suspensionen från steg 3,4 vid 400 xg under 30 min. Samla både fällningen och supernatanten. Resuspendera fällningen i 0,1 mM natriumcitrat i 10 min ultraljudsbehandling. Den förväntade storleken av nanokluster är ~ 130 nm i diameter.
6. Överför supernatanten från steg 3,5 till en ny koniska rör.
7. Centrifugera suspensionen från steg 3,6 vid 1500 xg under 30 min. Samla upp fällningen och återsuspendera i 0,1 mM natriumcitrat enligt 10 minuter sonikering. Den förväntade storleken av nanokluster är ~ 90 nm i diameter.
8. Lägg 300 _6; l nanokluster suspensionen till en 96-brunnars mikroplattläsare för mätning av en UV-VIS-NIR-absorptionsspektrum. Drop 10 l nanokluster suspension på kol belagda kopparnätet för TEM avbildning.

4 Konjugering av monoklonala antikroppar till nanokluster

1. Bered 100 | il monoklonal antikropp-lösning (1 mg / ml) i PBS, pH 7,2, till exempel, anti-epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2)-antikroppar eller anti-Epidermal Growth Factor Receptor 1 (EGFR) antikroppar.
2. Lägg antikroppslösningen från steg 4,1-3,9 ml 4 mM HEPES, pH 7,2. Centrifugera lösningen genom ett 10 k MWCO centrifugal filter vid 3250 xg under 20 minuter vid 8 ° C. Resuspendera antikropp i 4 mM HEPES, pH 7,2, till en slutlig volym av 100 | il.
   OBS: Detta steg utförs för att ersätta den ursprungliga media i antikroppslösningen med HEPES.
3. Tillsätt 10 l av 100 mM NAIO _4-100 l av antikroppslösningen. Täck reaktionsflaskan med en aluminum folie vid RT och blanda under 30 min med användning av en skakapparat.
4. Släck reaktionen genom att tillsätta 500 | il av 1 x PBS.
5. Lägg 2 | il av 46,5 mM linker lösning (dithiolaromatic PEG6-CONHNH ₂₎ till antikroppslösningen från steg 4,4 och skaka i en timme vid RT.
6. Filtrera lösningen med hjälp av en 10 k MWCO centrifugfilter vid 3250 xg under 20 min vid 8 ° C. Resuspendera antikropp i 1x PBS till en slutlig volym av 100 | il, som leder till en antikroppskoncentration av ~ 1 mg / ml.
7. Blanda 100 ^ nanokluster suspension vid OD ~ 1,0 med 1 pl modifierade antikroppar från steg 4,6 (1 mg / ml) under 120 minuter vid RT.
8. Tillsätt 10 l av 10 ^-3 M 5 kDa tiol PEG och skaka i 15 minuter vid rumstemperatur.
9. Centrifugera lösningen vid 830 x g under 3 min. Kasta bort supernatanten och återsuspendera sedimentet i 100 pl 2% vikt / volym 5 kDa PEG i PBS, pH 7,2.
10. Mät absorbansen spektrumet för de antikropps konjugerad nanokluster och jämför till tHan absorbansspektrum av de kala nanokluster. Räkna med ett par nanometer röda skift efter konjugering.
11. Om nanopartiklar aggregera vilket framgår av en betydande förskjutning med en ökning i OD i den röda-NIR-regionen, öka koncentrationen av tiol PEG till 5 x 10 ^-3 M. Också öka inkubationstiden med tiol PEG till 30 min och minskar centrifugal hastigheten i steg om 200 xg.
12. För cancercellmärkning testet, lägger antikropp konjugerad nanopartiklar från steg 4,9 till cancercellsuspension i antingen medium eller 1x PBS (1 ml ~ 10 ⁶ celler) och blanda i 60 min.

Representative Results

Ett system för syntes av immunotargeted magneto plasmoniska nanokluster visas i figur 2. Först magnetiska Fe ₃ O ₄ järnoxid nanopartiklar syntetiseras via termisk nedbrytning metod. Därefter sätts en tunn ca 1 nm guld skal avsatt på järnoxidkärnpartiklar via termisk sönderdelning. De primära ca 6 nm hybrid nanopartiklar fungerar som frön för att skapa magneto plasmoniska nanokluster genom att utnyttja en olja-i-vatten-mikroemulsion strategi. De nanokluster är funktion med monoklonala antikroppar för molekylär specifik inriktning.

Storleken på as-syntetiserade järnoxidkärnnanopartiklar är ~ 5 nm i diameter. Efter guldskal avsättning på den magnetiska kärnan, till ~ 6 nm i diameter storleken på primär järnoxid kärna / guld skal nanopartiklar ökar. De kolloidala ändrar färg från brunt till järnoxidnanopartiklar till rödlila efter deponering av guldskal och,Slutligen, till lila-grå färg efter montering av de primära partiklarna till ~ 180 nm diameter sfäriska nanokluster (Figur 3). UV-Vis-spektra visar att primär järnoxidkärn / guld shell nanopartiklar har en distinkt resonanstopp vid 530 nm som inte är närvarande i nakna järnoxidpartiklar (figur 4). Vid klusterbildning, förändrar spektrum markant och uppvisar en stark bred NIR absorbansen (Figur 4).

De nanokluster är konjugerade med monoklonala antikroppar för att specifikt rikta biomolekyler av intresse. Konjugeringen protokoll utnyttjar en hetero polyetylenglykol (PEG) linker som fäster Fc-region av antikroppar mot nanokluster yta. En ände av linkem har en hydrazid-del som växelverkar med oxiderad glykosylerad antikropp molekyldel. Den andra änden av linkern innehåller en di-tiolgrupp som har en stark affinitet till guldytan av nanokluster. Så visar minste molekylär målinriktning har vi valt en EGFR positiv hudcancer cellinje (A-431) och en HER2-positiv bröstcancer cellinje (SK-BR-3). Nanokluster har funktion med antingen anti-EGFR eller anti-HER2-antikroppar följt av blandning med A-431 eller SK-BR-3 cancerceller, respektive. I fig 5, en ljus guld-orange färg på A-431 och SK-BR-3 cancerceller indikerar molekyl specifika bindningen av nanokluster till motsvarande receptorer på cancerceller. Däremot gjorde oriktade PEGylerade nanokluster inte interagerar med cancerceller. Dessa resultat visar molekylära specificitet funktionnanokluster.

Figur 1 En experimentuppställning för syntes av primära järnoxid kärna / guld skal nanopartiklar. En rundbottnad kolv är ansluten till en kondensor. Reaktionen utföres i ett oljebad under temperaturövervakning av en termometer.

Figur 2 Schematisk illustrerar viktiga steg i syntesen av immunotargeted magneto plasmoniska nanokluster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 TEM bilder och färg av kolloidala suspensioner av nanopartiklar (vänster) järnoxidkärnnanopartiklar; (mitten) guldbelagda järnoxid nanopartiklar; (höger) hybrid magneto plasmoniska nanokluster. Skala bar för TEM-bilder är 50 nm. ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52090/52090fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 (A) UV-Vis-NIR spektra av järnoxid kärnnanopartiklar (blå), guldbelagda järnoxid nanopartiklar (grön), och hybridmagneto plasmoniska nanokluster (röd). (B) UV-Vis-NIR spektra av hybridmagneto plasmoniska nanokluster med olika storlekar: 90 nm (blå), 130 nm (grön) och 180 nm (rött). Alla spektra normaliseras till en på absorbansmaximum att visa skillnader i spektrala profiler. Klicka här för att se en större version av denna siffra. ank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5 Molekylär specificitet antikropp konjugerad magneto plasmoniska nanokluster: (Vänster) EGFR-uttryck A-431 hudcancerceller inkuberade med EGFR-riktade nanokluster; (Middle) HER2 uttrycker SK-BR-3 bröstcancerceller inkuberade med HER2-riktade nanokluster; (höger) A-431 celler inkuberade med oriktade PEGylerade nanokluster. Den orangegula färgen på celler indikerar framgångsrik märkning av funktionnanokluster; grå-blåaktig färg motsvarar en endogen spridning från celler. Bilderna har förvärvats med hjälp upprätt mikroskop med 20X mörkfältsmålet och Xe lampa excitation. Skala bar är 10 mikrometer._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Film 1. Denna video jämför en respons av A-431 cancerceller märkta med antingen primära nanopartiklar eller nanokluster för ett yttre magnetfält. Båda typerna av partiklar där konjugerat med anti-EGFR-antikroppar för särskild inriktning EGFR (+) A431-celler. Först framställdes ett Eppendorf-rör fylls med en suspension av märkta celler. Därefter tillsattes en magnet placerad intill röret och rörelse av celler avbildades vid ca 10 mm från magneten. Filmen till vänster visar celler märkta med primära nanopartiklar (6 nm i diameter) och filmen till höger - celler märkta med magneto plasmoniska nanokluster (100 nm i diameter). Filmerna har förvärvats med ett inverterat mikroskop i ljusfält läge med en 20X objektiv. Skala bar är 100 pm.

Discussion

Kritiska steg i framgångsrik syntes av magneto plasmoniska nanokluster hör att göra mycket monodispergerade primära guld skal / järnoxid kärnnanopartiklar och styra självorganisering av de primära partiklarna i nanokluster. Ett molförhållande mellan de primära partiklarna och ytaktiva medel spelar en viktig roll för att bestämma storleksfördelningen av nanokluster. Icke enhetlig storleksfördelning av primära nanopartiklar kan orsaka bildning av stora aggregat under montering av magneto plasmoniska nanokluster. Dessutom mikroemulsionen metoden nanokluster bildningen bygger på amfifila tensider: hydrofoba svans grupper håller primära nanopartiklar ihop och hydrofila huvudgrupper stabiliserar nanokluster i en vattenlösning. Koncentration av tensider avgör nanokluster enhet: en hög koncentration skulle leda till bildning av mindre nanokluster eller enskilda primära partiklar och en låg koncentration skulle leda partikelaggregation.

ca 50 nm till ca 300 nm som kräver ett ytterligare separationssteg. Centrifugering med en gradvis ökande hastighet som beskrivs i protokollet ovan ger goda resultat med separerade fraktioner som har storleksfördel 90 ± 18 nm, 130 ± 26 nm och 180 ± 39 nm. Finer separation för att producera smalare fördelningar bör vara möjlig genom användning av en storleksuteslutning-kromatografi. Det bör även noteras att nanokluster har en bred absorption i det röda-NIR-regionen som ger en möjlighet att väcka plasmon resonanser med alla källor mellan ca 500 och 900 nm (Figur 4). Det här hotellet begränsar även tillämpligheten av nanokluster i samtidig avbildning av flera mål.

En hydrodynamisk radie av nanokluster ökar med ~ 10-15 nm efter antikroppskonjugering. Denna ökning i diameter korrelerar well med ca 12 nm storlek av en IgG-antikropp som är bunden via Fc-delen på ytan av nanopartiklar. Därför är förändringen i den hydrodynamiska diameter överensstämmer med den riktnings konjugeringskemi av antikroppar genom Fc-delen som genomförs i protokollet. Zeta potential av nanopartiklar skiftar från -47,6 mV innan antikroppskonjugering till -7,0 mV efter konjugering. Förändringen av ytan laddning ger ytterligare belägg för antikropps konjugering till nanokluster.

Det unika med det protokoll som beskrivs här är syntesen av magneto plasmoniska nanopartiklar av olika storlekar från primärblock som också har magneto plasmoniska egenskaper. Denna metod erbjuder ett enkelt sätt att samtidigt styra styrkan av plasmoniska och magnetiska egenskaperna hos de resulterande nanostrukturer. Däremot föregående protokollen använde en sammansättning av plasmoniska och magnetiska nanomaterials, där ett material tjänade som en mall för avsättning av den andra; i denna metod ett material upptar volym och den andra ytan av de erhållna nanostrukturer. Magneto-plasmoniska nanopartiklar som rapporterats i litteraturen har betydligt lägre densitet och det totala beloppet för superparamagnetiska partiklar jämfört med de nanokluster som gjorts av våra protokoll ^14,15. I vår metod magnetiska och plasmoniska delar är likformigt fördelad genom hela volymen av hybridmagneto plasmoniska nanopartiklar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint	Corning	4320A-50	Thermal decomposition reaction
PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser with 24/40 [ST] outer/inner joints	Corning	2480-300	Thermal decomposition reaction
Silicone oil	Fisher	S159-500	Oil bath
Hot plate stirrer	Corning	PC-351	Heat the reacton with stirring function
Thermometer	ThermoWorks	221-092	Measure temperature
Iron(III) acetylacetonate	Fisher	AC11913-0250	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Oleic acid 99%	Fisher	A195-500	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Gold(III) acetate	Fisher	AA3974206	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Hexane	Fisher	H292-1	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Phenyl ether 99%	Fisher	AC13060-0025	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
1,2-Hexadecanediol 90%	Sigma	213748-50G	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Oleylamine 70%	Sigma	O7805-100G	Material for primary hybrid nanoparticles synthesis
Sodium dodecyl sulfate	Fisher	BP166-100	Cluster synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma	W302600	Cluster synthesis
Monoclonal anti-EGF receptor antibody	Sigma	E2156	Cell labeling specificity test
Monoclonal anti-HER2 antibody	Sigma	AMAB90627	Cell labeling specificity test
Sodium periodate	Sigma	311448	Oxidate Fc region of antibodies
Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2	SensoPath Technologies	SPT-0014B	Heterofunctional linker for antibody conjugation to nanoclusters
Methoxy-PEG-thiol, 5 k	Creative PEGworks	PLS-604	Passivate the remaining gold surface after antibody conjugation
Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit with Ultracel-10 membrane	Millipore	UFC801008	Protein purification
HEPES	Sigma	H3375	Buffer
PBS, 1x solution	Fisher	BP2438-20	Buffer
UV-Vis spectroscopy	BioTek	Synergy HT	Obtain spectrum
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Separation
Transmission Electron Microscope	FEI	TECNAI G2 F20 X-TWIN	Obtain morphology of nanostructures
Upright microscope	Leica	DM6000	Obtain dark-field images
Sonicator	Branson	1510	Sonication
Carbon film 300 mesh grid	EMS	CF300-Cu	TEM imaging
96-well plate	Corning	09-761-145	UV-Vis reading plate