Introduction
액체 작동 장치의 소형화는 "랩 온어 칩"플랫폼의 개발을 위해 매우 중요하다. 이 방향에서, 지난 20 년간 다양한 용도로, 미세 유체 분야에서 상당한 진전을 보아왔다. 1-5 동봉 채널 (채널 미세 유체) 내의 유체의 수송과 대조, DMF는 전극 어레이의 방울을 조작한다. 이 기술의 가장 매력적인 장점 중 하나는 유체를 수송하는 가동부의 부재이며, 모션 즉시 전기 신호를 해제하여 정지된다.
그러나, 액적 모션 범용 "랩 온어 칩"플랫폼에 확실히 바람직하지 않은 특성, 액적 내용에 의존한다. 단백질과 다른 분석을 포함하는 물방울은 이동이 불가능한되고, 장치 표면에 충실. 이론의 여지는 있지만, 이것은 DMF 애플리케이션의 범위를 넓혀위한 주요 제한되었다; 6-8원하지 않는 표면의 오염을 최소화하는 대안 잠재적 액적 콘텐츠에 영향을 미칠 수있는 액적 또는 그 주변에 추가 된 화학 종의 첨가를 포함한다.
이전에, 우리 그룹은 추가의 첨가제 (현장 DW 장치)없이 DMF 세포와 단백질의 이동을 허용하는 장치를 개발 하였다. (9)이 액적 압연 호의 장치 기하학 촛불 수트 10에 기초하여 표면을 결합함으로써 달성되었다 또한 물방울 표면의 상호 작용을 감소, 물방울에 상향 력에 연결됩니다. 이 방법에서는, 액적 이동은 표면 습윤과 연관되지 않는다. 11
후술하는 상세한 방법의 목적은 별도의 첨가제없이 단백질, 세포 및 유기체 전체를 함유하는 액 적을 이송 할 DMF 장치를 생산하는 것이다. 현장 DW 장치는 방울 화학자의 대부분 독립적으로 작업을 완벽하게 제어 플랫폼을위한 방법을 포장공예.
여기서, 우리는 또한, 본 시뮬레이션 장치 동작에 필요한 고전압에도 불구하고, 그 게재 액적 양단의 전압 강하는 액적 내부 bioanalytes 무시할만한 영향을 나타내는,인가 전압의 작은 부분이다. 사실, 예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의), 생물학의 다양한 연구에 사용되는 선충과 예비 시험은, 전압이인가 될 때 벌레가 방해받지 않고 수영을 보여준다.
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Protocol
참고 : 아래에 설명 된 절차, 실험실 안전 지침을 항상 준수해야합니다. 특히 중요한 고전압 (> 500 V) 및 처리 화학 물질 취급 안전성이다.
캔들 그을음과 도전성 기판 1. 코팅
- 사각형으로 잘라 구리 금속 (0.5 mm 두께 75 X 43mm). 약 30 초 동안 구리 식각액 침지하여 각 구리 기판을 청소 약 20 초 동안 수돗물로 세척, 종이 건조.
참고 : 아래의 방법 1을 사용하는 경우, 기기에 맞도록 75 × 25 mm의 크기를 변경합니다. - (약 40 μm의 두께) 대략 균일 수트 코팅을 얻기 위해, 30-45 초간 구리 기판 아래에 조명 된 파라핀 양초 스윕. 화염 내부 ~ 1cm에서 기판을 유지합니다. 깨지기 쉬운 매연 표면을 만지지 마십시오.
2. 코팅 그을음 계층 보호
참고 : 그을음 층이 매우 취약및 보호를위한 코팅해야합니다. 두 개의 간단한 대안 (방법 1 아래 2) 여기에 제시되어 있지만,보다 강력한 프로토콜은 현재 개발 중에 있습니다.
- 방법 1
- 금속 증발기 또는 스퍼터링 시스템에 샘플을로드합니다. 시스템의 작동 절차에 따라, 챔버 대피하고, 수트 층 (150-200 ㎚) 상에 금을 증착 제어를 시작한다. 장치를 실온까지 냉각하자.
- 딥 코트 화학 후드 내부에 10 분 동안 (95 % 에탄올, ACS / USP 등급의 1 % V / V) 1 도데 칸 티올 용액에 금속을 입힌 기판. 그런 다음, 60 °에 가까운 각도로 장치를 잡고 천천히 만 에탄올 몇 방울 표면을 씻어. 하룻밤 장치가 건조 보자.
- 방법 2
- 기판이 여전히 촛불 불꽃에서 따뜻한 동안 화학 후드에서 즉시 그을음 기판을 코팅 한 후, 한쪽에 불소계 액체의 일부 방울을 증착하고기판은 90 °에 가까운 각도로 기판을 기울여. 더 방울을 입금하고 전체 매연 표면에 롤 수 있습니다.
참고 : 물방울이 자리에서 떨어지면, 그을음이 떨어져 그 지역에서 세척 될 것입니다. 가능한 플루오르 액체 확산의 방울만큼 보자. - 화학 후드 내부 핫 플레이트 (15 분 동안 160 ° C)에 기판 굽는다.
- 기판은 사용하기 전에 실온에서 밤새 앉아 보자. 무기한으로 저장합니다.
- 기판이 여전히 촛불 불꽃에서 따뜻한 동안 화학 후드에서 즉시 그을음 기판을 코팅 한 후, 한쪽에 불소계 액체의 일부 방울을 증착하고기판은 90 °에 가까운 각도로 기판을 기울여. 더 방울을 입금하고 전체 매연 표면에 롤 수 있습니다.
3. 상단 전극의 제조 (Abdelgawad 등에서 적응. 12)
- 그래픽 디자인 소프트웨어를 사용하여 전극을 그린다. 각 전극은 0.3 mm, 폭 2mm 길이이고, 전극 간의 갭은 0.3 mm이다. 연락처 (아래 참조, 커넥터에 스냅) 사이의 간격은 2.3 mm (그림 1)입니다.
- 바둑 형식 (3.87 X 7.5 인치)에 유연한 구리 라미네이트 (두께 35 μm의) 트림. 다른 크기를 사용하여 I프린터와 호환 F. 컬러 프린터의 수동 급지 트레이에 라미네이트를 넣습니다.
- 구리 시트에 인쇄 할 때, 에칭 동안 인쇄 된 패턴을 보호, 구리 기판에 검은 잉크의 밀도가 높은 층을 할 수 있도록 "풍부한 블랙", 또는 "등록 블랙"을 사용하십시오 (자세한 내용은 Abdelgawad 등. 12 참조) 확인 . 하룻밤 완전히 인쇄 기판 건조하자.
- 화학 후드 내부 (40 ° C) 구리 식각액의 50 mL를 비커 따뜻하게. 비커에 인쇄 된 적층 물을 찍어, 부드럽게 약 10 분 동안 용액에 흔들어. 에칭 시간은 구리 에칭액에 따라 달라집니다. 모든 몇 분, 부식을 확인하고 패턴이 그대로 있는지.
- 조심스럽게 물 라미네이트를 세척하고 화학 후드에서 아세톤과 에탄올로 코팅을 제거합니다. 다시 한 번 세척하고, 부드럽게 종이 타월로 라미네이트를 건조.
- 조심스럽게 GLA에 전극 적층 체를 부착SS 슬라이드 (75 X 25mm, 두께 ~ 1mm), 양면 테이프를 사용. 공기 주머니를 피하십시오.
- 테이프를 사용하여 전극에 퍼플 루오로 PFA의 필름을 부착합니다. 이 물방울과 전극의 접촉 사고를 방지하는 역할을하는 합선에 손해 상단 전극.
4. (그림 2의 회로) 전자 인터페이스
- 범용 회로 기판에 릴레이, 콘덴서 C를 납땜한다.
- 전자 회로 납땜 브레드 보드에 10 릴레이 드라이버의 나머지 부분을 조립합니다.
- 와이어 제어 기판의 채널에 각각 릴레이 드라이버의 입력.
- 조심스럽게 커넥터에 (그림 3) 상부 전극 웁니다. 와이어 도면에 나타내는 바와 같이 상부 전극에 각각 릴레이 드라이버의 출력. 전기적 잡음을 최소화하기 위해 릴레이에서 와이어 쌍 사이 접지 커넥터 접촉이 있음을 유의.
주 : 커넥터는 t을 제어하는 조절 가능한 플랫폼에 앉아상단과 하단 (그을음 코팅) 기판 사이의 그 거리 (0.1 ~ 0.5 mm). - 다음, 2345, 3456 등; 0.8 초, 작용하다 1234, 즉 운동 (방향 1 전극 시프트, 동시에 4 전극에 고전압 (HV) 응용 프로그램 (약 0.8 초)을위한 타이밍을 제어하는 프로그램을 사용하여 ., 각 그룹에 대해 0.8 초 후 거꾸로, 반대 방향으로 이동하므로 액적뿐만 아니라).
5. 물방울 시각화 및 취급
- CCD 카메라와 결합 96X 배율 어셈블리 - 액적 모션을 기록하려면, 24X 구성된다 시각화 시스템을 사용한다. S-비디오를 사용하여 카메라에 비디오 레코더를 연결합니다.
- C.를 함유하는 4 ㎕의 방울을 피펫 그을음 코팅 된 기판의 바닥에있는 미디어에 간스.
- ~ 방울 위의 0.3 mm를 가기 전극을 가져와. 물방울은 쉽게 조작, 단지 5 전극 아래, 중간에 근접해야합니다.
- 전자 인터페이스와 높은 전압 (500 V RMS)의 전원을 켜서 이동 시작할 때까지 액에 상부 전극의 거리를 조정합니다. 상부 전극이 물방울에 접촉하지 않도록.
- 전기 펄스에 응답하여 상기 디바이스에서 성공적인 액적 전송 수를 기록함으로써 데이터를 수집. 성공적인 실험은, 적어도 700 방울 전송을 특징으로 즉, 각각의 전기 펄스 후 하나의 전송.
- 액이 5 ~ 10 펄스에 대한 응답으로 더 이상 움직이지 않을 때까지, 지속적으로 데이터를 수집합니다.
참고 : 표면이 떨어지기 시작하면 움직임이 가까이 방울 가기 전극을 가져와 복원 할 수 있습니다.
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Representative Results
이전에는 DMF 단백질의 움직임을 허용하도록 필드-DW 장치를 사용 해왔다. 특히, 소 혈청 알부민 (BSA)와 액적 이전 다른 작성자 (무첨가)보고 된 것보다 2000 배 더 높은 농도로 이동 될 수있다. 이 물방울과 표면 사이의 상호 작용의 감소 때문, 그림 4 (. 참조 프레 이레 등 9 실험에 대한 자세한 내용은) 형광 표지 된 BSA가 포함 된 물방울을 보여줍니다. 왼쪽의 첫 번째 그림은 그을음 코팅 표면에 앉아 물방울을 보여줍니다; 가운데 하나, 액적 압연을 생산 외에, 또한 상기 표면과의 상호 작용을 감소 방울에 상향 력을인가 전계의 효과. 만 (촛불 그을음없이) 플루오르 액체로 코팅 된 표면입니다 DMF에 사용되는 일반적인 대안에 전단 대비 (오른쪽) 참고; 하부 접촉에 의해 표시된 표면과 강한 상호 작용,ngle, 자주 운동을 방해한다.
여기서, 우리는 이제 더 큰 유기체를 함유하는 액 적을 이송, 웜 C.를 이러한 장치로 시험을 계속하는 실험 장치 (도 3)를 사용 엘레 생물학적 분석법에 사용 된 다양한 선충.
벌레와 물방울이 성공적으로 그을음 코팅 된 기판에 작동했다. 특히, 동영상 한 각 전압 펄스 (~ 0.8 초 간격)에 응답하여 이동하는 방울을 나타낸다 (아무 그을음 장소에 붙어 액체 분획, 액적 통로에서이다). 실험 후 검사는 더 웜, 파편, 또는 액체 잔류 물, 물방울과 표면 사이의 상호 작용의 감소를 나타내는 실험 후 방울 경로에 남아되지 않았 음을 밝혔다.
전자 인터페이스 (그림 2) 전극 그룹의 동시 작동 (그림 1 일부터, 자동화 및 모션을 더 잘 제어 할 수 있습니다)는 상기 표면과의 상호 작용을 감소시키는, 상향 력을 증가시킨다.
다른 실험은 벌레 생물 종 이송 되에 장치 작동에 필요한 고전압 (~ 500 V RMS)에 피해를주지 않을 것을 나타내는, 방울 이동 (20 분 총 작동 시간)으로 방해받지 않고 수영 것으로 나타났습니다. 이는 액적에서의 전압 강하는 동작 (도 5, 평면의 상단 지점과 하단 사이의 전위차에 필요한 전압의 미미한 분획 (10-6 %) 인 것으로 나타났다 시뮬레이션에 의해지지된다 방울의 중간); 실제로는 Jurkat T 세포를 포함하는 물방울, 다른 저자 (13)에 의해 수행 이전의 연구는 최소한의 전압 강하가 세포 생존, 증식, 생화학에 영향을주지 않는 것이 좋습니다. 추가의 검증을 위해, 그러나, 우리는 장기 효과를 평가하기위한 실험을 설계하는 과정에있는C.에 전압 엘레 간스. 여기서 설명하는 시뮬레이션의 경우, 1 ~ 2 μL 방울이 매연은 30㎛ 두께의 층에 앉아, PBS (인산 완충 식염수) 될 것으로 가정 하였다. 상부 및 하부 전극은 구리로 모델링하고, 500 V RMS와 동일한인가 전압 (시뮬레이션에 대한 자세한 내용은 참조 프레 이레 등. 9).
그림 1 :. 상부 전극의 그림 (10)의 각각 2 mm 길이 0.3 mm 폭입니다. 두 전극 사이의 갭은 0.3 mm이며, 접점 (아래) 사이의 갭은 2.3 mm이다.
그림 2 :. 상단 전극에 대한 제어 시스템의 개략도, 10 릴레이 드라이버의 1을 자세히 각 상부 전극 I어느 전압 실시, 또는 커패시터에 접속된다. 오른쪽, 릴레이 보드의 그림에. 동작에 필요한 고전압 멀리 제어 보드 (흰색 염기)로부터 왼쪽에 유지되는 것에주의. 물방울 그림 (중동)은 프레 이레 등의 등의 허가를 적응. (9) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 실험 장치의보기. 상부 및 하부 (그을음 피복) 기판 사이의 거리는 조정할 수있다. 상단 전극의 연락처는 커넥터에 스냅됩니다. 오른쪽 그림으로 나타낸 바와 같이 (여기서는 10 와이어의 단 1, 2 및 3에 도시)로부터 릴레이 와이어, 커넥터에 납땜된다. (접지 커넥터의 접촉이 있습니다예를 들어, 커넥터 접점 2 또는 4) 릴레이 (예를 들어, 1 또는 3), 전기 노이즈를 최소화합니다. 전선이 한 쌍의 사이에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 찬란 태그가 BSA (10g / L)와 방울 (4 μL) 왼쪽, 매연 기반의 기판에 앉아; 중간, 전계 효과 중 하나는 상기 기판과의 상호 작용을 최소화 방울에 상향 력을 적용하는 것; 오른쪽 표면에 물방울 만 플루오르 액체 (검댕)로 코팅. 프레 이레 등의 등의 허가를 적응. (9)
영화 1 . C.와 물방울 각 전압 펄스 (~ 0.8 초 간격)에 대한 응답으로 이동 필드-DW 장치에 간스. 비디오의 좌측 하단에 도시 된 액체 분획은 액적 경로에 있지.
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Discussion
프로토콜의 가장 중요한 단계는 방울을 직접 이동에 성공과 연관 수트 층의 보호이다. 수트 층 (위의 방법 1) 금속 화하는 제조 성공의 100 %에 근접 할 수 있습니다. 그러나, 최대 작동 시간은 약 10 분이며; 아마도, 액적 분획 금속층에 관통 구멍 그을음 습윤된다. 플루오르 액체와 그을음 층을 코팅하는 가장 쉽고 빠른 대안이며, 최소 자원을 필요로하지만, 제작 된 기판 작업 (20 분 최대) 만 40~50% - 그리고 코팅은 균일하지 않다. 사실, 수트 층은 매우 깨지기 및 점성 액체 불소화 쉽게 손상 그것. 우리는 현재 장치의 동작 시간을 증가시킬 수트 층을 보호하기 위해보다 강력한 대안에서 작동된다. 그러나, 한 가지 중요한 측면은 표면에 액적 콘텐츠의 흡착이다. 이전에, 우리는 9 ATT 단백질의 양을 정량화장치 작동 중에 표면 아팠다 및 상관 계속 동작 및 소 혈청 알부민 (BSA)의 감소 된 표면 흡착 사이에서 발견되었다. 불구하고, 생물 연료는 복잡한 문제이며, 몇몇 저자는 심지어 완전히 효과를 억제하는 것이 불가능할 수도 있다고 제안; 단 하나의 단백질이 표면에 부착하면 이론적으로, 더이 사이트에 매료 될 것입니다. 사실, (다른 저자 6)에 의해 디지털 마이크로 유체 장치를보고있는 최대 운전 시간은 약 40 분이었다. 따라서, 표면의 견고성은 매우 중요한 점과 여전히 진행중인 작품이다.
첨가제를 사용하지 않는, 즉, 전기 습윤에, 전압의인가는 종종 완전히 움직임을 방해, 표면 분석으로 방울을 확산 참고. 그러나, 일부 첨가제는 독성이있을 수 있으며, 또는 단지 액적 분석 물 농도의 범위 일 수있다. 현장 DW 장치는 분석의 전송이 이리저리까지 허용별도의 첨가제없이 단일 세포 및 전체 유기체에 M 단백질. 또한, 디바이스 특성은 두께, 균일 성, 그을음 층의 전기적 특성과는 거의 독립적 인 (참조 프레 이레 등. 자세한 내용은 9).
따라서, 여기에 설명 된 방법의 중요성은 액적 화학의 거의 무관하게 작동 완전히 제어 랩 온어 칩 플랫폼의 개발을위한 방법을 포장, DMF를위한 애플리케이션의 범위를 넓혀 있다는 것이다.
상부 전극의 치수는 프린터의 해상도와 호환되며 고유하지; 좁은 가까이 전극도 작동 할 수있다. 사실, 전자의 인쇄 회로 기판의 제조를위한 다른 방법도 사용될 수있다. 중요한 것은 방울이 불균일 전기장을 실시하고, 필드가 더 강렬 여기서이 영역으로 이동할 것이다. 그러나,주의를 기울여야합니다디자인에 스파크를 방지하기 위해 3 MV는 / m 이하, 통전 및 부동 전극 사이에 전기장을 유지; 여기에 필드는 날카로운 모서리없이, 약 1.7 MV / m이다.
다음과 같이 전자 회로의 동작이다. 각각의 상부 전극은 릴레이 접점을 통해 고전압 증폭기의 출력에 연결되어 어느 하나, 또는 커패시터 (C)에, 전기적 노이즈를 최소화. 트랜지스터 T는 작동 릴레이 코일에 필요한 큰 전류를 제어하는, 저항 R과 콘덴서 C 1 통해 제어 보드에 의해 외주 낮은 전류를 허용한다. 다이오드 (D)는 (구성 요소 목록 자료 목록 참조)으로 인해 코일의 변수 전류 회로의 손상을 방지 할 수 있습니다. 단 하나의 제어 보드의 모든 전극의 어드레싱 개별 허용하고, 하나의 HV 전원 공급이 필요하다 (도 2), 이는 출력 전압 (8-18 kHz에서, 500-660 V RMS) GENER 의해 제공 사인파를 증폭 한 후ATOR. 잡음 및 가능한 회로 오동작을 최소화하기 위해, HV는 최대한 멀리 제어계에서 유지되도록주의.
여기에보고 분석은 단순히 의한 작은 방울이 C.을 함유한다는 사실로, 4 ㎕의 액 적을 사용 엘레는 피펫하기가 더 어렵다. C.의 문화 엘레는 여기에 설명되지 않으며, 독자는 다른 프로토콜을 찾아야한다 (예. 브레너 14).
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Acknowledgments
우리는 C.에 대한 지원은 재정 지원에 대한 Lindback 재단, 박사 알렉산더하기 Sidorenko 유익한 토론 및 기술 지원 엘자 추, 교수 로버트 스미스 감사합니다 엘레 분석.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin candle | Any paraffin candle | ||
| Sputtering system | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| Teflon | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating. |
| Graphic design software -Adobe Illustrator | Adobe Systems | Other softwares might be used as well. | |
| Copper laminate | Dupont | LF9110 | |
| Laser Printer | Xerox | Phaser 6360 or similar | Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) film | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 or similar | Large enough to allow the assemble of 10 drivers. |
| Universal circuit board | Allied Electronics | 70219535 or similar | |
| Connector | Allied Electronics | 5145154-8 or similar | |
| Control board and control program (LabView software) | National Instruments | NI-6229 or similar | |
| High-voltage amplifier | Trek | PZD700 | |
| Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V | Allied | 8817183 | |
| Transistor T, NPN | Allied | 9350289 | |
| Diode D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | Allied | 8862527 | |
| Visualization system | Edmund Optics | VZM 200i or similar | System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera. |
| Recorder | Sony | GV-D1000 NTSC or similar | It is connected to the camera by an S-video cable. |
| Simulations | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
References
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