Introduction
Миниатюризация устройств, которые работают с жидкостями имеет первостепенное значение для развития "Лаборатория на чипе" платформ. В этом направлении, в последние два десятилетия мы стали свидетелями значительного прогресса в области микрофлюидики, с различными приложениями. 1-5 Контрастные с перевозкой жидкости в закрытых каналах (канал микрофлюидики), DMF манипулирует капли на массивы электродов. Один из самых привлекательных достоинств этого метода является отсутствие подвижных частей для транспортировки жидкостей, и движение мгновенно остановился, выключив электрические сигналы.
Тем не менее, капля движения зависит от содержания капель, конечно нежелательно характерно для универсальной платформы "Лаборатория на чипе". Капли, содержащие белки и другие анализируемые придерживаться поверхностей устройств, становится неподвижным. Возможно, это было главное ограничение для расширения сферы применения DMF; 6-8альтернативы, чтобы минимизировать нежелательные поверхности обрастания включать добавление дополнительных химических веществ в капле или его окрестностях, которые потенциально могут повлиять капель содержание.
Ранее наша группа разработали устройство, чтобы позволить перенос клеток и белков в ДМФА, без дополнительных добавок (полевые устройства-DW). 9 Это было достигнуто путем объединения поверхность свечи на основе сажи, 10 с геометрией устройства, что способствует капель прокатки и приводит к направленное вверх усилие на капли, капли в дальнейшем уменьшении-поверхности взаимодействия. В этом подходе, движение капель не связан с смачивания поверхности. 11
Цель подробного способом, описанным ниже, чтобы произвести DMF устройство, способное транспортировать капель, содержащих белки, клетки и целые организмы, без дополнительных добавок. Устройства поле-DW проложить путь для полностью управляемых платформ, работающих в значительной степени независимо от капель химикары.
Здесь мы также нынешние расчеты, показывающие, что, несмотря на высокое напряжение, необходимое для работы устройства, падение напряжения на капле небольшая часть приложенного напряжения, с указанием незначительное воздействие на bioanalytes внутри капли. На самом деле, предварительные испытания с Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс), нематоды, используемого для различных исследований в области биологии, показывают, что черви плавают спокойно, как напряжениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении процедур, описанных ниже, принципы лаборатория безопасности всегда должны быть соблюдены. Особое значение имеет безопасность при работе с высоким напряжением (> 500 В) и химическими веществами.
1. Покрытие из подложка с Свеча сажи
- Вырезать металлической меди на прямоугольники (75 х 43 мм, толщиной 0,5 мм). Чистить каждый медную подложку путем погружения в медной травителя в течение приблизительно 30 сек, промывают водопроводной водой в течение 20 секунд, и сухой бумагой.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании метода 1 ниже, изменить размеры 75 х 25 мм, чтобы вписаться в машине. - Развертки зажженную свечу парафина под медную подложку для 30-45 сек, чтобы получить приблизительно равномерное покрытие сажи (около 40 мкм). Держите субстрат на ~ 1 см внутри пламени. Не прикасайтесь к хрупкой поверхности сажи.
2. Защита Сажа слой с покрытием
ПРИМЕЧАНИЕ: сажа слой очень хрупокИ должны быть покрыты для защиты. Два простых альтернатив (методы 1 и 2 ниже) предлагаются здесь, но более надежные протоколы находятся в стадии разработки.
- Способ 1
- Загрузите образец в металлической испарителя или распыления системы. После процедур функционирования системы, вакуумировать камеру, и начать контролируемое осаждение золота на сажи слоя (150-200 нм). Пусть устройство остыть до комнатной температуры.
- Dip-покрытие металлизированной подложки в 1-додекантиола раствора (1% объем / объем, в 95% -ном этаноле, ACS / USP класс), в течение 10 мин внутри химической капотом. Затем, удерживая устройство под углом, близким к 60 °, аккуратно вымыть поверхность с несколькими каплями только этанол. Пусть устройства сухой, на ночь.
- Способ 2
- В химической капот, сразу же после нанесения на подложку с сажей и в то время как подложка еще теплый от пламени свечи, депозит несколько капель фторированной жидкости на одной сторонеПодложка, и наклонить подложку под углом, близким к 90 °. Депозит больше капелек, и пусть катиться по всей поверхности сажи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда капля падает на месте, сажа будет вымываться из этой области. Пусть капельки жидкого фторированного распространения как можно больше. - Печь подложки на горячей плите (160 ° C в течение 15 мин) внутри химической капотом.
- Пусть субстрат на ночь при комнатной температуре перед использованием. Храните на неопределенный срок.
- В химической капот, сразу же после нанесения на подложку с сажей и в то время как подложка еще теплый от пламени свечи, депозит несколько капель фторированной жидкости на одной сторонеПодложка, и наклонить подложку под углом, близким к 90 °. Депозит больше капелек, и пусть катиться по всей поверхности сажи.
3. Изготовление Топ электродов (взято из Abdelgawad др. 12)
- Нарисуйте электродов с использованием графических программ. Каждый электрод имеет длину 2 мм, шириной 0,3 мм, и зазор между электродами составляет 0,3 мм. Разрыв между контактами (привязать к разъему, смотрите ниже) составляет 2,3 мм (рисунок 1).
- Обрезать гибкий медный ламинат (35 мкм толщиной) в формате Monarch (3,87 х 7,5 дюйма). Используйте другие размеры яе совместимы с принтером. Загрузите ламинат в лоток ручной подачи на цветном принтере.
- Убедитесь, что использовать "богатый черный" или "прописку черный", при печати на листовой меди (см Abdelgawad др. 12 для получения подробной информации), чтобы позволить более плотную слой черной краски на медной подложке, защищая напечатанному шаблону во время травления , Пусть Печатная подложка полностью не высохнет, на ночь.
- Внутри химической капот, разогреть (40 ° C) Химический стакан 50 мл меди травителя. Опустите печатную ламинат в стакан, и осторожно встряхните его в растворе в течение 10 мин. Офорт время зависит от меди травильного раствора. Каждые несколько минут, проверить коррозии и посмотреть, если картина не повреждена.
- Тщательно мыть ламинат с водой, и удалить покрытие с ацетоном и этанолом в химической капотом. Промыть еще раз, и осторожно высушить ламината с бумажным полотенцем.
- Тщательно прикрепите ламинат с электродами на ГЛКсс слайд (75 х 25 мм, ~ 1 мм толщиной), используя двусторонний скотч. Избегайте воздушных карманов.
- Прикрепите пленку перфторалкокси PFA к электродам, используя ленту. Это служит для предотвращения случайного контакта электродов с каплей, которая повреждает верхние электроды из-за короткого замыкания.
4. Электронный интерфейс (Circuit на рисунке 2)
- Припой реле и конденсаторы C до универсальной плате.
- Соберите остальные реле водителей 10 на беспаечное плате для электронных схем.
- Провод ввода каждого реле водителя на канал в панели управления.
- Осторожно надавите на верхнюю электроды в разъем (рисунок 3). Провод выход каждого реле водителя на верхнем электроде, как показано на рисунке. Следует отметить, что существует заземлен контакт в разъеме между парой проводов от реле, чтобы свести к минимуму электрические помехи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разъем сидит на регулируемой платформе для управления тон расстояние (0,1-0,5 мм) между верхней и нижней (сажи покрытием) подложке. - С помощью программы для управления синхронизацией для применения высокого напряжения (HV) (около 0,8 сек) до 4 электродов в то же время, сдвигая 1 электрод в направлении движения (то есть, в течение 0,8 сек, приводить в 1234, затем 2345, 3456, и т.д. ., 0,8 сек для каждой группы, а затем в обратном направлении, так что капли движется в противоположном направлении, а).
5. капель Визуализация и обработка
- Чтобы записать движение капель, использовать систему визуализации, которая состоит из 24X - 96X увеличении сборки в сочетании с ПЗС-камерой. Подключите видеомагнитофон к камере с помощью S-Video.
- Внесите 4 мкл каплю, содержащую С. Elegans в средствах массовой информации на нижней части сажи покрытием подложки.
- Принесите верхние электроды к ~ 0,3 мм над капли. Капелька должна быть близка к середине, чуть ниже пятого электрода, для облегчения операции.
- Включите электронный интерфейс и высокое напряжение (500 В RMS), и отрегулируйте верхнюю расстояние между электродами к капле, пока не начнет двигаться. Не позволяйте топ электроды коснуться капли.
- Сбор данных по записи числа успешных передач капель на устройстве в ответ на электрические импульсы. Успешный эксперимент характеризуется по крайней мере, 700 капель трансфертов, то есть, один перевод после каждого электрического импульса.
- Сбор данных непрерывно, пока капля не двигается больше в ответ на 5 до 10 импульсов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда поверхность начинает деградировать, движение может быть восстановлено путем привлечения лучших электродов ближе к капле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы использовали устройства Поле-DW, чтобы позволить движение белков в DMF. В частности, капельки с бычьим сывороточным альбумином (BSA) может быть перемещен в концентрации 2000 раз выше, чем ранее сообщалось другими авторами (без добавок). Это было связано с уменьшением взаимодействия капли и поверхности; Рисунок 4 показывает капельку, содержащую флуоресцентно-меченый BSA (см Фрейре и др 9 для получения дополнительной информации о экспериментах.). Первая картина слева показывает капельку сидя на сажи покрытием поверхности; средний, эффект электрического поля, которое, кроме того, чтобы получить капли прокатки, относится также направленное вверх усилие на капли, дополнительно снижая взаимодействие с поверхностью. Отметим, контрастность при сдвиге (справа) к общему альтернативы, используемого в ДМФА, который представляет собой поверхность с покрытием только с фторированной жидкости (без копоти свечи); сильное взаимодействие с поверхностью, указано в нижней связаться сngle, нередко препятствует движению.
Здесь мы используем экспериментальной установки (рисунок 3) для продолжения испытаний с этих устройств, теперь транспортировки капель, содержащих крупные организмы, червь C. Элеганс, нематод использованы в различных биологических анализов.
Капли с червями были успешно приводится на сажевых покрытием субстратов. В частности, фильм 1 показывает капельку движущийся в ответ на каждый импульс напряжения (~ 0,8 сек интервал) (отметим, что жидкую фракцию, застрял в месте без сажи, находится вне пути капли). Осмотр после опытов показали, что никаких червей, мусор, или жидкие остатки, не остались на каплях путей после опытов, что указывает снижение взаимодействия между каплей и поверхностью.
Электронный интерфейс (рисунок 2) позволяет автоматизировать и лучший контроль движения, так как одновременное приведение в действие групп электродов (фиг.1) Увеличивает направленную вверх силу, дополнительно снижая взаимодействие с поверхностью.
Различные эксперименты показали, что черви плавают спокойно, как капельных ходов (20 мин общего времени срабатывания), что указывает на высокое напряжение (~ 500 В RMS) требуется для работы устройства не является вредным для биологических видов транспортировки. Это подтверждается моделирования, которые показали, что падение напряжения на капли незначительная часть (10 -6%) в напряжение, необходимое для работы (фиг.5, разность потенциалов между одной точкой на верхней и нижней плоскости в середина капли); В самом деле, в капель, содержащих Jurkat Т-клетки, предыдущие исследования, проведенные другими авторами 13 предполагают, что такие капли минимальное напряжение не влияет на жизнеспособность клеток, пролиферации и биохимию. Для получения дополнительной проверки, однако, в настоящее время мы в процессе проектирования экспериментов, чтобы оценить долгосрочные последствиянапряжения на C. Элеганс. Для моделирования описанных здесь, ~ 2 мкл капли предполагалась из PBS (фосфатный буфер солевой раствор), сидя на толстом слое сажи 30 мкм. Верхний и нижний электроды были смоделированы как медь, и приложенное напряжение равно 500 В RMS (для более подробной информации о моделировании см Фрейре и др. 9).
Рисунок 1:. Изображение верхних электродов каждый из 10 имеет длину 2 мм и шириной 0,3 мм. Разрыв между 2 электродами также 0,3 мм, а зазор между контактами (внизу) составляет 2,3 мм.
На рисунке 2:. Схема управляющей системы для верхних электродов, в котором подробно 1 драйверов 10 релейных Каждый верхний электрод яы либо подвергается напряжению, или соединены с конденсатором. Справа, на снимке платы с реле. Обратите внимание, что высокое напряжение, необходимое для работы находится вдали от платы управления (белой основы) слева. Капелька схема (Ближний) адаптировано с разрешения Фрейре и др. 9 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Вид на экспериментальной установки. Расстояние между верхней и нижней (сажи покрытием) подложки регулируется. Контакты из лучших электродов защелкиваются в разъем. Провода от реле (показанные здесь только 1, 2 и 3 из 10 проволок) припаяны к разъему, как показано на рисунке справа. Обратите внимание, что есть заземленной контакт в разъеме (например, контактов разъема 2 или 4) между парой проводов от реле (например, 1 или 3), чтобы свести к минимуму электрический шум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Капельки (4 мкл) с Флуоресцентно-меченых BSA (10 г / л) слева, сидит на сажи на основе подложки; среднего, один из эффектов электрического поля является применение направленное вверх усилие на капли, дополнительно минимизировать взаимодействие с подложкой; Право, капли на поверхности с покрытием только с фторированной жидкости (без сажи). Адаптировано с разрешения Фрейре и др. 9
Фильм 1 . капли с С. Elegans на устройстве поле-DW, перемещение в ответ на каждый импульс напряжения (~ 0,8 сек интервала). Жидкая фракция показано на нижнем левом углу видео не в капли пути.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важным шагом протокола является защита сажи слоя, непосредственно связанные с успехом в продвижении капельки. Металлизации сажи слой (метод 1 выше) позволяет близка к 100% успеха изготовления. Тем не менее, максимальное время работы составляет около 10 мин; возможно, капель фракции смачивания сажу через отверстия в металлическом слое. Покрытие сажи слой с фторированной жидкости является простой и быстрый альтернативой, и требует минимальных ресурсов, но только 40-50% от (мин максимум 20) изготовлены субстраты работа - и покрытие не является равномерным. В самом деле, сажа слой очень хрупким, и вязкие жидкие фторированные легко повреждает его. В настоящее время мы работаем над более надежной альтернативы для защиты сажи слой, что позволит увеличить время работы устройства. Тем не менее, одним из важных аспектов является адсорбция капель содержимого на поверхность. Ранее мы 9 количественно количество белка, что ATTболела на поверхность во время работы устройства, и корреляция между продолжения движения и снижению поверхностной адсорбции бычьего сывороточного альбумина (BSA). Несмотря на это, биообрастание является сложным вопросом, и некоторые авторы даже предполагают, что это может быть невозможно полностью подавить эффект; в теории, если только один белок прикрепляется к поверхности, более будут привлечены к этому месту. На самом деле, максимальное время работы сообщили для цифровых устройств микрожидкостных (другими авторами 6) было около 40 минут. Таким образом, надежность поверхности является точкой большое значение и до сих пор находится в стадии разработки.
Обратите внимание, что, в электросмачивания, применение напряжения часто распространяется каплю с аналитов на поверхности, полностью препятствуя движению, если не используются добавки. Тем не менее, некоторые добавки могут быть токсичными, или может работать только в диапазоне от концентрации анализируемого вещества в капле. Устройства поле-DW позволяют транспортировка анализируемых начиная сюдам белки до отдельных клеток и целых организмов, без дополнительных добавок. Кроме того, характеристики устройства в значительной степени зависит от толщины, однородности и электрических свойств сажи слоя (см Фрейре и др. 9 для получения дополнительной информации).
Таким образом, значимость метода, описанного здесь является то, что он расширяет сферу применения для DMF, прокладывая путь для развития полностью контролируемых платформ Лаборатория на чипе, работающих в значительной степени независимо от капель химии.
Размеры лучших электродов совместимы с разрешением принтера, и не являются уникальными; узкие и тесные электроды могут также работать. В самом деле, другие способы изготовления печатных плат в электронике может также использоваться. Важно то, что капля подвергают неоднородном электрическом поле, и она будет двигаться по направлению к области, где поле является более интенсивным. Тем не менее, следует соблюдать осторожностьв дизайне, чтобы электрическое поле между напряжением и плавающих электродов ниже 3 МВ / м, чтобы предотвратить искрение; Здесь, поле составляет около 1,7 МВ / м, без острых краев.
Функционирование электронных схем состоит в следующем. Каждый верхний электрод, через релейный контакт, либо подключен к выходу усилителя высокого напряжения, или в конденсатор (C), чтобы свести к минимуму электрические помехи. Транзистор Т позволяет низкого тока на стороне с помощью панели управления, через резистор R и конденсатора C 1, чтобы контролировать больший ток, требуемый для обмотку реле, чтобы работать. Диод D предотвращает повреждение цепи из-за переменной тока в катушке (см список материалов для списка компонентов). Только один пульт управления позволяет индивидуальное решение всех электродов, и требуется только один HV питания (Рисунок 2), который выходных напряжений (8-18 кГц, 500-660 V RMS) после усиления синусоиду, предоставленную в GenerАТОР. Обратите внимание, что HV хранится так далеко, как можно дальше от системы управления, чтобы свести к минимуму шум и возможные неисправности цепи.
Анализы представленные здесь используется 4 капли мкл, просто из-за того, что более мелкие капли, содержащей C. Элеганс труднее пипетки. Культура С. Элеганс не будет обсуждаться здесь, и читатель должен искать протоколов в другом месте (например,., Бреннер 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Lindback Фонд финансовой поддержки, и д-р Александр Сидоренко и Эльзу Чу для плодотворных дискуссий и технической помощи, а также профессора Роберта Смита за помощь в С. Элеганс анализы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin candle | Any paraffin candle | ||
| Sputtering system | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| Teflon | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating. |
| Graphic design software -Adobe Illustrator | Adobe Systems | Other softwares might be used as well. | |
| Copper laminate | Dupont | LF9110 | |
| Laser Printer | Xerox | Phaser 6360 or similar | Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) film | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 or similar | Large enough to allow the assemble of 10 drivers. |
| Universal circuit board | Allied Electronics | 70219535 or similar | |
| Connector | Allied Electronics | 5145154-8 or similar | |
| Control board and control program (LabView software) | National Instruments | NI-6229 or similar | |
| High-voltage amplifier | Trek | PZD700 | |
| Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V | Allied | 8817183 | |
| Transistor T, NPN | Allied | 9350289 | |
| Diode D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | Allied | 8862527 | |
| Visualization system | Edmund Optics | VZM 200i or similar | System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera. |
| Recorder | Sony | GV-D1000 NTSC or similar | It is connected to the camera by an S-video cable. |
| Simulations | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
References
- Fair, R. B. Digital microfluidics: is a true lab-on-a-chip possible. Microfluid Nanofluid. 3 (3), 245-281 (2007).
- Gupta, S., Alargova, R. G., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. On-Chip Dielectrophoretic Coassembly of Live Cells and Particles into Responsive Biomaterials. Langmuir. 26 (5), 3441-3452 (2009).
- Shih, S. C., et al. Dried blood spot analysis by digital microfluidics coupled to nanoelectrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 84 (8), 3731-3738 (2012).
- Gorbatsova, J., Borissova, M., Kaljurand, M. Electrowetting-on-dielectric actuation of droplets with capillary electrophoretic zones for off-line mass spectrometric analysis. J Chromatogr. 1234 (0), 9-15 (2012).
- Qin, J., Wheeler, A. R. Maze exploration and learning in C. elegans. Lab Chip. 7 (2), 186-192 (2007).
- Koc, Y., de Mello, A. J., McHale, G., Newton, M. I., Roach, P., Shirtcliffe, N. J. Nano-scale superhydrophobicity: suppression of protein adsorption and promotion of flow-induced detachment. Lab Chip. 8 (4), 582-586 (2008).
- Perry, G., Thomy, V., Das, M. R., Coffinier, Y., Boukherroub, R. Inhibiting protein biofouling using graphene oxide in droplet-based microfluidic microsystems. Lab Chip. 12 (9), 1601-1604 (2012).
- Kumari, N., Garimella, S. V. Electrowetting-Induced Dewetting Transitions on Superhydrophobic Surfaces. Langmuir. 27 (17), 10342-10346 (2011).
- Freire, S. L. S., Tanner, B. Additive-Free Digital Microfluidics. Langmuir. 29 (28), 9024-9030 (2013).
- Deng, X., Mammen, L., Butt, H. -J., Vollmer, D. Candle Soot as a Template for a Transparent Robust Superamphiphobic Coating. Science. 335, 67-70 (2011).
- Kang, K. H. How Electrostatic Fields Change Contact Angle in Electrowetting. Langmuir. 18 (26), 10318-10322 (2002).
- Abdelgawad, M., Watson, M. W. L., Young, E. W. K., Mudrik, J. M., Ungrin, M. D., Wheeler, A. R. Soft lithography: masters on demand. Lab Chip. 8 (8), 1379-1385 (2008).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8 (4), 519-526 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
