Introduction
A miniaturização dos dispositivos que funcionam com líquidos é de suma importância para o desenvolvimento de plataformas "lab-on-a-chip". Nesse sentido, as duas últimas décadas têm testemunhado um progresso significativo na área da microfluídica, com uma variedade de aplicações. 1-5 Contrastando com o transporte de fluidos em canais fechados (canal microfluídicos), DMF manipula gotas em matrizes de eletrodos. Um dos méritos mais atraentes desta técnica é a ausência de partes móveis para o transporte de fluidos, e movimento é imediatamente interrompida ao desligar sinais elétricos.
No entanto, o movimento das gotículas é dependente de conteúdos das gotículas, certamente uma característica indesejável para uma plataforma universal "lab-on-a-chip". Gotículas contendo proteínas e outros analitos aderir a superfícies do dispositivo, tornando-se inabalável. Indiscutivelmente, esta tem sido a principal limitação para o alargamento do âmbito de aplicações DMF; 6-8alternativas para minimizar a proliferação indesejada superfície envolvem a adição de espécies químicas extras para a gota ou seus arredores, o que poderia afetar o conteúdo da gota.
Anteriormente, o nosso grupo desenvolveu um dispositivo para permitir o transporte de células e proteínas em DMF, sem aditivos adicionais (dispositivos Campo-DW). 9 Isto foi conseguido através da combinação de uma superfície com base na fuligem vela, 10 com uma geometria do dispositivo que favorece a gotícula de rolamento e leva a uma força ascendente sobre a gotícula, diminuindo ainda mais a interacção gotícula-superfície. Nesta abordagem, gota movimento não está associado a molhar a superfície 11.
O objectivo do método descrito abaixo é detalhado para produzir um dispositivo de DMF capaz de transportar gotas contendo proteínas, células e organismos inteiros, sem aditivos adicionais. Os dispositivos de campo-DW pavimentar o caminho para as plataformas totalmente controlados que trabalham em grande parte de forma independente da gota de químicory.
Aqui, nós também apresentam simulações mostra que, apesar da alta tensão necessária para o funcionamento do dispositivo, a queda de tensão através da gotícula é uma pequena fracção da tensão aplicada, indicando efeitos insignificantes sobre bioanalytes no interior da gotícula. Na verdade, os testes preliminares com Caenorhabditis elegans (C. elegans), um nemátodo usado para uma variedade de estudos em biologia, mostram que os vermes nadar sem perturbações como as tensões são aplicadas.
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Protocol
NOTA: Nos procedimentos descritos a seguir, as diretrizes de segurança do laboratório deve ser sempre seguido. De particular importância é a segurança quando se lida com alta voltagem (> 500 V) e de manuseamento de produtos químicos.
1. revestimento de um substrato condutor com vela Fuligem
- Cobre corte de metal em retângulos (75 x 43 mm, 0,5 mm de espessura). Limpe cada substrato de cobre por imersão em etchant cobre por cerca de 30 segundos, lavar com água corrente por cerca de 20 segundos, e seque com papel.
NOTA: Se estiver usando o método 1 a seguir, alterar as dimensões de 75 x 25 mm para caber na máquina. - Varrer uma vela de parafina iluminada sob o substrato de cobre durante 30-45 segundos, para se obter um revestimento de fuligem aproximadamente uniforme (cerca de 40 um de espessura). Mantenha o substrato em ~ 1 cm para dentro da chama. Não toque na superfície fuligem frágil.
2. Proteger a camada de fuligem com Revestimento
NOTA: A camada de fuligem é muito frágil, E devem ser revestidos para protecção. Duas alternativas simples (métodos 1 e 2 abaixo) são sugeridos aqui, mas protocolos mais robustos estão atualmente em desenvolvimento.
- Método 1
- Coloque a amostra para o evaporador de metal ou de sistema de pulverização. Seguindo os procedimentos de funcionamento do sistema, evacuar a câmara, e começar a deposição controlada de ouro sobre a camada de fuligem (150-200 nm). Deixe o dispositivo de arrefecer até à temperatura ambiente.
- Dip-revestir o substrato metalizado em uma solução de 1-dodecanotiol (1% v / v, em etanol a 95%, ACS / grau USP), durante 10 minutos dentro de uma capa química. Então, segurando o aparelho em um ângulo perto de 60 °, lavar cuidadosamente a superfície com várias gotas de etanol só. Deixe os dispositivos seca, durante a noite.
- Método 2
- Em uma capa de química, imediatamente depois do revestimento do substrato com a fuligem e ao mesmo tempo o substrato ainda está quente da chama da vela, depositar algumas gotas de líquido fluorado sobre um lado dosubstrato, e inclinar o substrato a um ângulo próximo de 90 °. Deposite mais gotas, e deixá-los rolar sobre a superfície inteira fuligem.
NOTA: Quando a gota cai em um ponto, a fuligem serão lavados daquela área. Deixe as gotículas de líquido propagação fluorado, tanto quanto possível. - Asse o substrato sobre uma placa quente (160 ° C durante 15 min) no interior de uma capa química.
- Deixe o substrato se sentar durante a noite à temperatura ambiente antes do uso. Armazenar indefinidamente.
- Em uma capa de química, imediatamente depois do revestimento do substrato com a fuligem e ao mesmo tempo o substrato ainda está quente da chama da vela, depositar algumas gotas de líquido fluorado sobre um lado dosubstrato, e inclinar o substrato a um ângulo próximo de 90 °. Deposite mais gotas, e deixá-los rolar sobre a superfície inteira fuligem.
(12 Adaptado de Abdelgawad et al.) 3. Fabricação de Top Eletrodos
- Desenhe os eletrodos utilizando software de design gráfico. Cada eletrodo é de 2 mm de comprimento, 0,3 mm de largura, ea diferença entre os eletrodos é de 0,3 mm. A diferença entre contatos (para encaixar no conector, veja abaixo) é de 2,3 mm (Figura 1).
- Apare um laminado de cobre flexível (35 mm de espessura) para o formato Monarch (3,87 x 7,5 polegadas). Use outros tamanhos if compatível com a impressora. Coloque o laminado na bandeja de alimentação manual de uma impressora colorida.
- Certifique-se de usar o "preto rico", ou "Registro de preto", ao imprimir na folha de cobre (ver 12 Abdelgawad et al. Para mais detalhes) para permitir que uma camada mais densa de tinta preta sobre o substrato de cobre, protegendo o padrão impresso durante gravura . Deixe o substrato seco impresso completamente, durante a noite.
- Dentro de uma capa química, aquecer (40 ° C) num copo com 50 ml de produto corrosivo de cobre. Mergulhe o laminado impresso no copo e agite-o na solução por cerca de 10 min. Tempo de condicionamento depende da solução de produto corrosivo de cobre. A cada poucos minutos, verifique a corrosão e ver se o padrão está intacta.
- Cuidadosamente lavar o laminado com água, e remover o revestimento com acetona e etanol na capa química. Lavar uma vez, e seca suavemente com a toalha de papel laminado.
- Cuidadosamente anexar o laminado com eletrodos a uma ABLslides ss (75 x 25 mm, ~ 1 mm de espessura), usando fita dupla face. Evite bolsas de ar.
- Anexar um filme de perfluoroalcoxi PFA aos eletrodos utilizando fita. Isso serve para evitar o contato acidental dos eletrodos com a gota, o que prejudica top eletrodos devido a curto-circuito.
4. A interface eletrônica (circuito na Figura 2)
- Soldar os relés e os capacitores C a uma placa de circuito universal.
- Monte o restante dos 10 pilotos de revezamento em uma placa de ensaio sem solda para circuitos eletrônicos.
- Fio de entrada de cada motorista relé para um canal na placa de controle.
- Tirar com cuidado os melhores eletrodos em um conector (Figura 3). Fio condutor de saída de cada retransmissão a um eléctrodo de topo, como mostrado na figura. Note que existe um contato do conector aterrado entre um par de fios de relés, para minimizar o ruído elétrico.
NOTA: O conector fica em uma plataforma ajustável para controlar tele distância (0,1-0,5 mm) entre o substrato superior e inferior (fuligem-revestido). - Utilizar um programa para controlar a temporização para a aplicação de alta voltagem (HV) (cerca de 0,8 seg) para quatro eléctrodos, ao mesmo tempo, deslocando um eléctrodo na direcção de movimento (ou seja, durante 0,8 seg, accionar 1234; em seguida, 2345, 3456, etc. ., 0,8 segundos para cada grupo, e depois para trás, move-se de forma de gotículas na direcção oposta, como bem).
5. Visualização Gota e Manuseio
- Para gravar gotícula de movimento, utilizar o sistema de visualização, o qual é composto por uma 24X - montagem de ampliação 96X combinado com uma câmara CCD. Ligue o gravador de vídeo para a câmera usando S-video.
- Pipetar uma gota de 4 ul contendo C. elegans em meios na parte inferior do substrato revestido de fuligem.
- Trazer os melhores eletrodos para ~ 0,3 milímetros acima da gota. A gota deve ser próximo ao centro, logo abaixo do quinto eletrodo, para facilitar a operação.
- Ligue a interface eletrônica e alta tensão (500 V RMS), e ajustar a distância do eléctrodo superior à gota, até que começa a se mover. Não deixe que os melhores eletrodos tocar a gota.
- Recolha de dados de registo do número de transferências de gotículas de sucesso no dispositivo em resposta a impulsos eléctricos. Uma experiência de sucesso é caracterizado por, pelo menos, 700 transferências de gotículas, ou seja, uma transferência após cada pulso eléctrico.
- Recolha de dados continuamente, até que a gotícula não mais mover-se em resposta a 5 a 10 pulsos.
NOTA: Quando a superfície começa a degradar-se, o movimento pode ser restaurado, trazendo os melhores eléctrodos mais perto da gotícula.
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Representative Results
Anteriormente, foram utilizados dispositivos Campo-DW para permitir o movimento de proteínas em DMF. Em particular, as gotas com albumina de soro bovino (BSA) pode ser movido a uma concentração 2000 vezes mais elevada do que o relatado anteriormente por outros autores (sem aditivos). Isto era devido à interacção reduzida entre as gotículas e a superfície; A Figura 4 mostra uma gota contendo fluorescentemente marcado com BSA (ver Freire et al 9 para obter mais informação sobre os experimentos.). A primeira foto da esquerda mostra a gota sentado na superfície revestida de fuligem; o do meio, o efeito do campo eléctrico, o qual, para além de produzir gotículas de rolamento, também se aplica uma força ascendente sobre a gotícula, reduzindo ainda mais a interacção com a superfície. Nota o contraste de cisalhamento (à direita) para uma alternativa mais comum utilizado em DMF, que é uma superfície revestida apenas com líquido fluorado (sem vela fuligem); a forte interacção com a superfície, indicado pelo contacto inferior umngle, muitas vezes dificulta o movimento.
Aqui, usamos o set-up experimental (Figura 3) para continuar os testes com estes dispositivos, agora o transporte de gotículas contendo organismos maiores, o verme C. elegans, um nemátodo usada em uma variedade de ensaios biológicos.
Gotas com vermes foram accionados com sucesso em substratos revestidos de fuligem. Em particular, um filme mostra uma gotícula em movimento em resposta a cada impulso de tensão (~ 0,8 seg intervalo) (note-se que a fracção de líquido, preso a um local sem fuligem, está fora da via de gotas). Inspecção após as experiências revelaram que não há vermes, detritos, ou resíduos líquidos, foram deixados em vias gotas após as experiências, indicando reduzida interacção entre gotícula e a superfície.
A interface electrónica (Figura 2) permite a automatização e um melhor controlo do movimento, uma vez que a actuação simultânea dos grupos de eléctrodos (Figura 1) Aumenta a força para cima, reduzindo ainda mais a interacção com a superfície.
Diferentes experiências mostraram que os vermes nadar sem perturbações como as gotículas de tempo total de movimentos (a actuação de 20 min), indicando que a alta voltagem (~ 500 V RMS) necessária para o funcionamento do dispositivo não é prejudicial para as espécies biológicas a ser transportado. Isto é suportado por meio de simulações, os quais mostraram que a queda de tensão através da gotícula é uma fracção insignificante (10 -6%) da tensão necessária para a operação (Figura 5, diferença de potencial entre um ponto na parte superior e na parte inferior do plano de o meio de gotícula); na verdade, em gotículas contendo as células T de Jurkat, estudos anteriores realizados por outros autores 13 sugerem que tais quedas de tensão mínima não afectar a viabilidade celular, a proliferação, e bioquímica. Para mais validação, no entanto, estamos atualmente no processo de concepção de experimentos para avaliar os efeitos a longo prazoda tensão em C. elegans. Para as simulações descritas aqui, uma gota ul ~ 2 foi assumido como sendo de PBS (tampão fosfato), sentado em um 30 mm espessa camada de fuligem. Eletrodos superior e inferior foram modeladas como cobre, ea tensão aplicada igual a 500 V RMS (Para detalhes sobre as simulações, ver Freire et al. 9).
Figura 1:. Imagem dos melhores eletrodos Cada um dos 10 é de 2 mm de comprimento e 0,3 mm de largura. A diferença entre dois eletrodos também é 0,3 milímetros, ea diferença entre os contatos (em baixo) é de 2,3 mm.
Figura 2:. Esquemático do sistema de controle para melhores eletrodos, detalhando um dos drivers de relé 10 Cada eletrodo superior is ou submetido a tensão, ou ligado a um condensador. À direita, uma imagem da placa com os relés. Note-se que a alta tensão necessária para a operação é mantida longe da placa de controle (base branca) do lado esquerdo. Diagrama Gota (Médio) adaptado com permissão de Freire et al. 9 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Vista do set-up experimental. A distância entre a parte superior e inferior do substrato (fuligem-revestido) é ajustável. Os contatos das principais eletrodos são agarrados em um conector. Os fios de relés (aqui mostradas apenas 1, 2 e 3 dos 10 fios) são soldadas ao conector, como indicado pelo diagrama da direita. Note que existe um contato do conector aterrado (por exemplo, os contatos do conector 2 ou 4) entre um par de fios de relés (por exemplo, 1 ou 3), para minimizar o ruído elétrico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Gotas (4 mL) com BSA marcadas com fluorescência (10 g / L) Esquerda, sentado em um substrato à base de fuligem; meio, um dos efeitos do campo eléctrico é aplicar uma força ascendente sobre a gotícula, minimizando ainda mais a interacção com o substrato; direito, gota sobre uma superfície revestida apenas com o líquido fluorado (sem fuligem). Adaptado com permissão de Freire et al. 9
Filme 1 . Gota com C. elegans em um dispositivo de campo-DW, movendo-se em resposta a cada pulso de tensão (~ intervalo de 0,8 seg). A fracção líquida mostrado na parte inferior esquerda do vídeo não é na via de gotícula.
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Discussion
A etapa mais crítica do protocolo é a proteção da camada de fuligem, diretamente associado ao sucesso em gotas em movimento. Metalização da camada de fuligem (método 1 acima) permite que perto de 100% de sucesso de fabricação. No entanto, o tempo máximo de operação é de cerca de 10 min; possivelmente, fracções de gotículas são molhar a fuligem através de furos na camada de metal. Revestimento da camada de fuligem com o líquido fluorado é a alternativa mais fácil e rápida, e exige o mínimo de recursos, mas apenas 40-50% do (min no máximo 20) fabricado trabalho substratos - eo revestimento não é uniforme. De facto, a camada de fuligem é muito frágil, e as fluorados líquidos viscosos danifica-lo facilmente. Estamos atualmente trabalhando em alternativas mais robustas para proteger a camada de fuligem, o que aumentaria o tempo de funcionamento do dispositivo. No entanto, um aspecto importante é o conteúdo de gotículas de adsorção à superfície. Anteriormente, 9 quantificamos a quantidade de proteína que attdoía à superfície durante o funcionamento do dispositivo, e foi encontrada uma correlação entre movimento e continuou reduzida adsorção de superfície de albumina de soro bovino (BSA). Não obstante, a incrustação biológica é um assunto complexo, e alguns autores chegam a sugerir que talvez seja impossível suprimir completamente o efeito; em teoria, se apenas uma única proteína liga a uma superfície, mais serão atraídos para este sítio. Na verdade, o tempo de operação máxima registada para dispositivos de microfluidos digitais (por outros autores 6) foi de cerca de 40 minutos. Portanto, a robustez da superfície é um ponto de grande importância e ainda um trabalho em progresso.
Note-se que, em eletroumectação, a aplicação da tensão, muitas vezes se espalha a gota com analitos na superfície, impedindo totalmente movimento, a menos que os aditivos são utilizados. No entanto, alguns aditivos podem ser tóxicos, ou só pode trabalhar dentro de uma gama de concentração de analito na gotícula. Dispositivos de campo-DW permitir o transporte de analitos que vão from proteínas para células únicas e organismos inteiros, sem aditivos adicionais. Além disso, as características do dispositivo são em grande parte independente de espessura, uniformidade e propriedades elétricas da camada de fuligem (ver Freire et al. 9, para mais informações).
Por isso, a importância do método descrito aqui é que alarga o âmbito de pedidos de DMF, abrindo o caminho para o desenvolvimento de lab-on-a-chip plataformas totalmente controlados que trabalham em grande parte de forma independente da gota de química.
As dimensões do topo eléctrodos são compatíveis com a resolução da impressora, e não são únicos; eletrodos mais estreitas e mais estreitos também pode trabalhar. De facto, outros métodos para a fabricação de placas de circuito impresso em electrónica pode ser utilizada como bem. O que importa é que a gotícula é submetido a um campo eléctrico não uniforme, e vai passar para a região onde o campo é mais intenso. No entanto, cuidados devem ser tomadosno projeto para manter o campo elétrico entre os eletrodos energizados e flutuante abaixo de 3 MV / m para evitar a formação de faíscas; aqui, o campo é de cerca de 1,7 MV / m, sem bordas afiadas.
O funcionamento dos circuitos electrónicos é a seguinte. Cada eléctrodo superior, através de um contacto do relé, ou é ligada à saída de um amplificador de alta tensão, ou a um condensador (C), para minimizar o ruído eléctrico. O transistor T permite a baixa corrente terceirizada pela placa de controle, através do resistor R eo capacitor C 1, para controlar a corrente maior exigida para a bobina do relé para operar. O diodo D evita danos circuito devido à corrente variável na bobina (ver lista de materiais para a lista de componentes). Apenas uma placa de controle permite endereçamento individual de todos os eléctrodos, e somente uma fonte de alimentação de alta tensão é requerido (Figura 2), que as tensões de saída (8-18 kHz, 500-660 V RMS) após amplificar a onda sinusoidal é fornecida por um generator. Note que HV é mantido o mais longe possível do sistema de controle, para minimizar o ruído e possível mau funcionamento do circuito.
Os ensaios relatados aqui usado 4 gotas ul, simplesmente devido ao facto de pequenas gotículas contendo C. elegans são mais difíceis de pipeta. A cultura de C. elegans não será discutido aqui, eo leitor deve olhar para os protocolos em outros lugares (por exemplo., Brenner 14).
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Acknowledgments
Agradecemos à Fundação Lindback de apoio financeiro, e Dr. Alexandre Sidorenko e Elza Chu para discussões frutíferas e assistência técnica, eo professor Robert Smith para a assistência com o C. Os ensaios de elegans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin candle | Any paraffin candle | ||
| Sputtering system | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| Teflon | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating. |
| Graphic design software -Adobe Illustrator | Adobe Systems | Other softwares might be used as well. | |
| Copper laminate | Dupont | LF9110 | |
| Laser Printer | Xerox | Phaser 6360 or similar | Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) film | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 or similar | Large enough to allow the assemble of 10 drivers. |
| Universal circuit board | Allied Electronics | 70219535 or similar | |
| Connector | Allied Electronics | 5145154-8 or similar | |
| Control board and control program (LabView software) | National Instruments | NI-6229 or similar | |
| High-voltage amplifier | Trek | PZD700 | |
| Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V | Allied | 8817183 | |
| Transistor T, NPN | Allied | 9350289 | |
| Diode D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | Allied | 8862527 | |
| Visualization system | Edmund Optics | VZM 200i or similar | System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera. |
| Recorder | Sony | GV-D1000 NTSC or similar | It is connected to the camera by an S-video cable. |
| Simulations | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
References
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