Introduction
液体を扱う装置の小型化は、「ラボオンチップ」のプラットフォームの開発のために最も重要である。この方向では、最後の二十年は、様々なアプリケーションで、マイクロフルイディクスの分野で大きな進歩を目撃した。1-5同封チャンネル（チャンネルマイクロフルイディクス）内の流体の輸送に対照的な、DMFは、電極のアレイ上の液滴を操作する。この技術の最も魅力的なメリットの一つは、流体を輸送するための可動部がないことで、動きを瞬時に電気信号をオフにすることによって停止される。
しかし、液滴の運動は、液滴の内容、ユニバーサル」ラボオンチップ」プラットフォームの確かに望ましくない特性に依存する。タンパク質や他の検体を含む液滴が移動不能になって、デバイス表面に固執する。間違いなく、これをDMFアプリケーションの適用範囲を広げるための主要な制限されている; 6-8不要な表面の汚れを最小にする選択肢は、潜在的に液滴コンテンツに影響を与える可能性が液滴またはその周囲に余分な化学種の添加を含む。
以前、我々のグループは、追加の添加剤（電界DW装置）なしで、DMF中の細胞およびタンパク質の輸送を可能にする装置を開発し9これは、液滴圧延を優先するデバイス·ジオメトリを有するキャンドルすす、10に基づいて、面を組み合わせることによって達成されたさらに、液滴表面相互作用を減少させる、液滴に上向きの力をもたらす。このアプローチでは、液滴の運動は、表面の濡れに関連付けられていない。11
以下に説明する詳細な方法の目的は、余分な添加剤を含まない、タンパク質、細胞、および生物全体を含む液滴を輸送することができるDMFデバイスを製造することである。フィールド-DWデバイスは、大部分が独立して液滴化学者の作業完全に制御プラットフォームへの道を開くRY。
ここでは、それを示す、本シミュレーションでは、デバイスの動作に必要な高電圧にもかかわらず、液滴の両端の電圧降下は、液滴内部bioanalytesにほとんど影響を示し、印加電圧のごく一部である。実際には、 線虫（C.エレガンス ）、生物学の研究のさまざまな目的で使用線虫を用いた予備試験では、電圧が印加されるとワームが乱さ泳ぐことを示している。
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Protocol
注：以下の手順では、実験室の安全ガイドラインは、必ず従わなければなりません。特に重要なのは、高電圧（> 500 V）および取り扱い化学物質を扱う安全である。
キャンドルすすと導電性基板の1.コーティング
- 長方形に切断の銅金属（0.5mm厚75×43ミリメートル）。約20秒間水道水で洗って、約30秒間銅エッチング液に浸漬することにより、各銅基板をきれいにし、紙で乾燥させます。
注：以下の方法1を使用する場合は、マシンに収まるように75×25 mmの寸法を変更します。 - ほぼ均一なすすコーティングを得るために、30〜45秒間、銅基板の下に点灯してパラフィンろうそくをスイープ（約40μm厚）。火炎内部〜1センチメートルで基板を保管してください。脆弱なすす面に触れないでください。
2.コーティングでスート層の保護
注：スート層は非常に脆弱である、および保護のために被覆しなければならない。つの単純な代替案（メソッド1及び2）は、ここで提案されているが、より堅牢なプロトコルが現在開発中である。
- 方法1
- 金属蒸発器またはスパッタリング装置内に試料をロードします。システムの操作手順に従って、チャンバを排気し、スート層（150〜200ナノメートル）の上に金の制御された堆積を開始します。デバイスは、室温まで冷却してみましょう。
- 化学フード内部10分間1-ドデカンチオール溶液（1％v / v、95％エタノール中で、ACS / USPグレード）、ディップコート金属化基板。その後、60°に近い角度でデバイスを保持し、静かにエタノールのみの数滴で表面を洗う。一晩、デバイスは、乾燥してみましょう。
- 方法2
- 基板はまだろうそくの炎から温かいうちに化学フード内で、すぐに煤を基板上に塗布した後、のいずれかの側にフッ素化された液体の一部の液滴を堆積し基板、および90°に近い角度に基板を傾けます。より多くの液滴を堆積し、それらが全体のすす表面上を転がるましょう。
注：液滴がスポットに当たるときは、煤がその領域から洗い流される。フッ素化された液体の液滴の広がりを可能な限りう。 - 化学フード内部のホットプレート（15分間160℃）上の基板焼く。
- 基板は、使用前に室温で一晩放置します。無期限に保管してください。
- 基板はまだろうそくの炎から温かいうちに化学フード内で、すぐに煤を基板上に塗布した後、のいずれかの側にフッ素化された液体の一部の液滴を堆積し基板、および90°に近い角度に基板を傾けます。より多くの液滴を堆積し、それらが全体のすす表面上を転がるましょう。
3.上部電極の作製（Abdelgawad らから適応。12）
- グラフィックデザインソフトウェアを使用して電極を描画します。各電極は、幅0.3mm、長さ2mmであり、電極間のギャップは0.3mmである。接点（下記参照、コネクタにスナップするため）との間のギャップは2.3ミリメートルです（ 図1）。
- モナーク形式に柔軟な銅積層（厚さ35μm）（3.87×7.5インチ）トリム。他のサイズを使用してIプリンタと互換性fを。カラープリンタの手差しトレイに積層体をロードします。
- 銅板に印刷する場合、エッチング中に印刷されたパターンを保護する、銅基板上のブラックインクの密度の高い層を可能にするために「リッチブラック」、または「登録黒"を使用してください（詳細についてはAbdelgawad ら 12を参照）ことを確認してください。プリント基板に完全に乾燥させ、一晩。
- 化学フード内では、（40°C）、銅エッチング液を50 mlのビーカーを温める。ビーカー内の印刷された積層体を浸し、ゆっくり約10分間溶液中にそれを振る。エッチング時間は、銅エッチング溶液によって異なります。数分ごとには、腐食を確認し、パターンが無傷であるかどうかを確認。
- 慎重に水で積層体を洗って、化学フード内でアセトン、エタノールでコーティングを除去。もう一度洗って、優しくペーパータオルで積層体を乾燥させます。
- 慎重にGLAに電極を積層板を取り付けるSSスライド（75×25ミリメートル、厚さの〜1ミリメートル）、両面テープを使用した。エアポケットを避けてください。
- テープを使用して、電極にパーフルオロアルコキシPFAのフィルムを取り付けます。これは、液滴と電極の偶発的な接触を防止するのに役立つによる短絡の損傷上部電極。
4.（図2の回路）電子インターフェース
- ユニバーサル回路基板にリレーやコンデンサCを半田付けします。
- 電子回路用のブレッドボード上で10のリレードライバの残りの部分を組み立てます。
- 各ワイヤは、制御基板内のチャネルに、運転者の入力をリレー。
- 慎重にコネクタ（ 図3）に上部電極をスナップ。図に示すように、ワイヤそれぞれは、上部電極にドライバの出力を中継する。電気ノイズを最小化するために、リレーからの一対のワイヤ間に接地されたコネクタ接点があることに留意されたい。
注：コネクターは、Tを制御するために調節可能なプラットフォーム上に座っ彼は距離頂部と底部との間（0.1〜0.5ミリメートル）（スートコーティングされた）基板。 - その後2345年、3456 など ; 0.8秒、作動させるために1234年、すなわち運動（の方向に1電極をずらし、同時に4電極に高電圧（HV）アプリケーション（約0.8秒）のタイミングを制御するプログラムを使用してください。0.8グループごとに秒、その後、後方に、反対方向に移動するので、液滴も同様）。
5.液滴可視化と取扱い
- CCDカメラと組み合わせ96X倍率アセンブリ - 液滴の動きを記録するために、24Xで構成されている可視化システムを使用する。 Sビデオを使用してカメラにビデオレコーダーを接続します。
- Cを含む4μlの滴をピペットですす被覆基板の底部にあるメディアでエレガンス 。
- 液滴上記〜0.3ミリメートルに上部電極を持参してください。液滴がより簡単に操作のための、ちょうど第五電極直下の、真ん中に近くなければなりません。
- 電子インターフェースと高電圧（500 V RMS）の電源をオンにし、それが移動を開始するまでの液滴に上部電極の距離を調整する。上部電極は、液滴を接触させてはいけません。
- 電気パルスに応答したデバイス上で成功した液滴転送回数を記録することによって、データを収集する。成功した実験は、少なくとも700滴転送、 すなわち 、各電気パルスの後1転送することを特徴とする。
- 滴が5から10パルスに応答して、もはや動かないまで、継続的にデータを収集する。
注：表面が劣化し始めると、動きが近い液滴に上部電極にすることによって回復することができた。
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Representative Results
以前、我々は、DMF中のタンパク質の運動を可能にするためにフィールド-DWデバイスを使用している。特に、ウシ血清アルブミン（BSA）を有する液滴が以前に（添加剤なし）、他の著者によって報告されたものより2000倍高い濃度で移動することができる。これは滴と表面との間の相互作用の減少によるものであった; 図4は、蛍光標識したBSAを（。フレイレら参照実験の詳細については、9）を含む液滴を示しています。左側の最初の画像はススでコーティングされた表面の上に座って、液滴を示している。中央の、液滴圧延を生成するだけでなく、さらに表面との相互作用を減少させる、液滴に上向きの力を加える、電界の影響。のみ（ろうそく煤なし）フッ素系液体でコーティングされた表面であるDMF中で使用される一般的な代替案へのせん断コントラストを（右）に注意してください。下部コンタクトaの表面との強力な相互作用ngle、かなり頻繁に運動を妨げる。
ここでは、現在、より大きな生物を含む液滴を輸送する、これらのデバイスでテストを継続する（ 図3）ワームCを実験設定を使用虫 、生物学的な種々のアッセイで使用される線虫。
ワームと滴が成功裏にすすでコーティングされた基板上で作動させた。特に、映画1は、各電圧パルス（〜0.8秒間隔）に応じて移動する液滴を示している（無すすのある場所に付着した液体画分は、液滴経路から外れていることに注意してください）。実験後の検査ではなく、ワーム、破片、または液体残基は、滴と表面との間の相互作用の減少を示す、実験後に液滴経路に残っていたことを明らかにした。
電子インターフェース（ 図2）は、電極のグループを同時に作動（ 図1は 、動きの自動化とより良い制御を可能にする）さらに、表面との相互作用を低減する、上向きの力を増加させる。
別の実験では、ワームは、生物種が輸送されるため、デバイスの動作に必要な高電圧（〜500 V RMS）は有害ではないことを示し、液滴が移動する（20分の合計作動時間）として乱さ泳ぐことを示している。これは、液滴の両端の電圧降下は、動作に必要な電圧のわずかな画分（10-6％）が（ 図5、上部の点との間の電位差と平面の底部であることを示したシミュレーションによって支持されている液滴の中央）。実際には、ジャーカットT細胞を含む液滴に、他の研究者13によって行われ、以前の研究では、最小の電圧降下は、細胞の生存率、増殖、および生化学に影響を及ぼさないことを示唆している。さらなる検証のために、しかし、我々は、長期的な効果を評価する実験を設計するプロセスで現在C.上の電圧エレガンス 。ここで説明したシミュレーションのために、〜2μlの液滴が煤の厚さ30μmの層の上に座って、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）であると仮定した。上部電極と下部電極は、銅としてモデル化し、500 V RMSに等しい印加電圧（シミュレーションの詳細については、以下を参照してくださいフレイレら 9）。
図1：上部電極の画像 10の各々には、2 mmの長さ0.3mmで幅である。 2つの電極間のギャップも0.3mmで、連絡先（下）との間のギャップ2.3 mmである。
図2：上部電極のための制御システムの概略、10リレー·ドライバの1を詳述し 、各上部電極のisは、電圧を受け、またはコンデンサに接続のどちらか。右側に、リレーとのボードの絵。動作に必要な高電圧を左のコントロールボード（ホワイトベース）から離れて保持されることに留意されたい。滴図（中央）フレイレらの許可を得て適応さ。9 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：実験設備の眺め 。頂部及び底部（すす被覆）基板との間の距離は調整可能である。上部電極からのコンタクトは、コネクタにスナップされ。右の図に示されるように（ここでは10のワイヤのみ1,2および3に示す）のリレーからのワイヤは、コネクタに半田付けされる。 （接地されたコネクタ接点があることに注意してください電気ノイズを最小限に抑えるために例えば 、コネクタ接点2または4）リレー（ 例えば 、1から一対のワイヤまたは3）の間で、。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：蛍光標識BSA（10グラム/ L）と液滴（4μl）を左、すす系基板の上に座って。中央の、電界の効果の一つは、基板との相互作用を最小化する、液滴に上向きの力を適用することである。右、唯一のフッ素系液体（無すす）でコーティングされた表面上の液滴。フレイレらの許可を得て適応さ。9
映画1 。C で液滴各電圧パルス（〜0.8秒間隔）に応答して移動するフィールド-DWデバイス上エレガンス 。映像の左下に示した液体画分は、液滴経路にはない。
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Discussion
プロトコルの最も重要なステップは、直接、液滴を動かすの成功に関連付けられている、スート層の保護である。スート層（上記の方法1）を金属化することは、製造の成功の100％に近いことができる。しかし、最大動作時間は約10分である。おそらく、小滴のフラクションは、金属層の貫通孔煤湿潤される。フッ素化液体とのスート層をコーティングすることは、最も簡単かつ最速の代替であり、最小のリソースを必要とするが、製造された基板の作業（20分以内）のわずか40-50％ - とコーティングが均一ではない。実際には、スート層は、それは非常に脆弱であり、粘性フッ素系液体を容易に損害。現在、デバイスの動作時間を増加させるスート層を保護するために、より堅牢な代替案に取り組んでいる。しかしながら、一つの重要な側面は、表面への液滴の内容物の吸着である。以前は、9我々 は ATTタンパク質の量を定量化デバイスの動作中に表面に痛いと相関が継続運動およびウシ血清アルブミン（BSA）の減少した表面吸着の間に発見された。それにもかかわらず、生物付着は、複雑な問題であり、何人かの著者も、それが完全に効果を抑制することは不可能かもしれないことを示唆している。唯一の単一のタンパク質が表面に付着した場合、理論的には、もっとこのサイトに魅了されます。実際には、（他の著者6によって）デジタルマイクロ流体デバイスについて報告された最大動作時間は約40分であった。したがって、表面の堅牢性は、非常に重要なポイントと、まだ進行中の作業です。
添加剤が使用されない限りは、エレクトロウェッティングは、電圧の印加は、多くの場合、完全に動きを妨げ、表面上の検体と、液滴を分散してください。しかし、いくつかの添加剤は、毒性であり得るか、または唯一の液滴中の検体濃度の範囲内で動作するかもしれません。フィールド-DWデバイスは、分析物の輸送があちこちに至るまで許す余分な添加物を含まない単一の細胞および生物全体へのm個のタンパク質。また、デバイス特性が（フレイレらを参照してください。詳細については、9）を厚さ、均一性、およびスート層の電気的特性の大部分は独立している。
したがって、ここで説明する方法の意義は、それが大幅に独立して液滴化学の作業完全に制御ラボオンチッププラットフォームの開発に道を開く、DMFのためのアプリケーションの範囲を広げることです。
上部電極の寸法は、プリンタの解像度と互換性があり、かつユニークではありません。狭いと近い電極も仕事ができる。実際には、電子機器内のプリント回路基板を製造するための他の方法も同様に使用することができる。重要なことは、液滴が、不均一な電場にさらされ、それは、フィールドがより強い領域に向かって移動することである。ただし、注意が必要ですスパークを防止するために、3 MV / mより通電およびフローティング電極間に電界を維持する設計では、ここで、フィールドは、鋭いエッジなしで、約1.7 MV / mである。
以下のように、電子回路の動作を説明する。各々の上部電極は、リレー接点を介して、高電圧増幅器の出力に接続されているか、コンデンサ（C）に、電気的ノイズを最小化することができる。トランジスタTが動作するリレーコイルに必要な大きな電流を制御するために、抵抗RとコンデンサC 1を介して、制御基板により外部委託低電流を可能にする。ダイオードDは（コンポーネントのリストのための材料のリストを参照）により、コイル内の可変電流による回路の損傷を防止します。唯一つの制御ボードは、GENERによって提供される正弦波を増幅した後、個々のすべての電極のアドレス指定を可能にし、唯一のHV電源が必要とされる（ 図2）、その出力電圧（8-18 kHzの、500から660 V RMS）レータ。ノイズおよび可能な回路の誤動作を最小にするために、HVはできるだけ離し制御システムから保持されることに留意されたい。
ここで報告されたアッセイは、単純により小さな液滴は、Cを含有するという事実のために、4μlの液滴を使用エレガンスは、ピペットがより困難である。 Cの文化虫はここで議論されず、読者は他の場所でのプロトコルを探す必要があります（ 例えば 、ブレンナー14）。
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Acknowledgments
私たちは、財政支援のためのLindback財団、博士アレクサンダー·シドレンコとエルザチュー実り議論や技術支援のために、そしてCと支援のための教授のロバート·スミスに感謝虫アッセイ 。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin candle | Any paraffin candle | ||
| Sputtering system | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| Teflon | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating. |
| Graphic design software -Adobe Illustrator | Adobe Systems | Other softwares might be used as well. | |
| Copper laminate | Dupont | LF9110 | |
| Laser Printer | Xerox | Phaser 6360 or similar | Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) film | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 or similar | Large enough to allow the assemble of 10 drivers. |
| Universal circuit board | Allied Electronics | 70219535 or similar | |
| Connector | Allied Electronics | 5145154-8 or similar | |
| Control board and control program (LabView software) | National Instruments | NI-6229 or similar | |
| High-voltage amplifier | Trek | PZD700 | |
| Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V | Allied | 8817183 | |
| Transistor T, NPN | Allied | 9350289 | |
| Diode D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | Allied | 8862527 | |
| Visualization system | Edmund Optics | VZM 200i or similar | System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera. |
| Recorder | Sony | GV-D1000 NTSC or similar | It is connected to the camera by an S-video cable. |
| Simulations | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
References
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