Drage fordel af reducerede Droplet-overflade Interaktion Optimer Transport af Bioanalytes i Digital Microfluidics

Introduction

Miniaturisering af enheder, der arbejder med væsker er af afgørende betydning for udviklingen af ​​"lab-on-a-chip" platforme. I denne retning, har de seneste to årtier oplevet en markant fremgang inden for mikrofluidik, med en bred vifte af applikationer. ^1-5 kontrast til transport af væske i lukkede kanaler (kanal mikrostrømning), DMF manipulerer dråber på arrays af elektroder. Et af de mest attraktive fordele ved denne teknik er fraværet af bevægelige dele til at transportere væsker, og bevægelse øjeblikkeligt stoppet ved at slukke elektriske signaler.

Men dråbe bevægelse er afhængig dråbe indhold, bestemt en uønsket egenskab for en universel platform "lab-on-a-chip". Dråber indeholder proteiner og andre analytter holde sig til enhedens overflader bliver urokkelige. Formentlig har det været den største begrænsning for at udvide anvendelsesområdet for DMF-applikationer; ^6-8alternativer til at minimere uønskede overflade begroning involverer tilføjelse af ekstra kemiske stoffer til dråben eller dens omgivelser, der potentielt kan påvirke dråbe indhold.

Tidligere vores gruppe udviklet et apparat til at tillade transport af celler og proteiner i DMF, uden ekstra additiver (Field-DW enheder). ^9. Dette blev opnået ved at kombinere en overflade baseret på lys sod, ¹⁰ med en anordning geometri, der favoriserer dråbe rullende og fører til en opadgående kraft på dråben yderligere faldende dråbe-overflade interaktion. I denne fremgangsmåde er dråbe bevægelse ikke forbundet med overfladebefugtning. ¹¹

Målet med den detaljerede nedenfor beskrevne metode er at fremstille en anordning DMF stand til at transportere dråber indeholdende proteiner, celler og hele organismer uden ekstra additiver. Field-DW-enheder bane vejen for fuldt kontrollerede platforme arbejder stort set uafhængigt af dråber kemikerry.

Her vil vi også fremlægge simulationer viser, at på trods af den høje spænding der kræves for enhedens drift, spændingsfaldet over dråben er en lille brøkdel af den påtrykte spænding, hvilket indikerer ubetydelig virkning på bioanalytes inde i dråben. Faktisk indledende forsøg med Caenorhabditis elegans (C. elegans), en nematode, der anvendes til en række undersøgelser inden for biologi, viser, at orme svømme uforstyrret som spændinger anvendes.

Protocol

BEMÆRK: I de nedenfor beskrevne procedurer, skal retningslinjer laboratorium sikkerhedsregler altid følges. Af særlig betydning er den sikkerhed, når der beskæftiger sig med høj spænding (> 500 V) og håndtering af kemikalier.

1. Coating af et ledende substrat med Candle Sod

1. Cut kobbermetal i rektangler (75 x 43 mm, 0,5 mm tyk). Rengør hver kobber substrat ved nedsænkning i kobber ætsemiddel i ca. 30 sek, vask med vand fra hanen i ca. 20 sek, og tør efter med papir.
   BEMÆRK: Hvis du bruger metode 1 nedenfor, ændre dimensioner 75 x 25 mm til at passe ind i maskinen.
2. Feje et tændt stearinlys paraffin under kobber substrat for 30-45 sec, for at opnå en tilnærmelsesvis ensartet sod belægning (ca. 40 um tyk). Hold underlaget på ~ 1 cm inde i flammen. Rør ikke ved den skrøbelige sod overflade.

2. Beskyttelse soden Layer med Coating

BEMÆRK: sod lag er meget skrøbeligOg skal være dækket til beskyttelse. To simple alternativer (metode 1 og 2 nedenfor) er foreslået her, men mere robuste protokoller er i øjeblikket under udvikling.

1. Metode 1
   1. Indlæs prøven i metal fordamper eller sputtering system. Efter transaktionen procedurerne i systemet, evakuere kammeret, og start kontrolleret deponering af guld på sod lag (150-200 nm). Lad enheden køle ned til stuetemperatur.
   2. Dip-belægge metalliserede substrat i en 1-dodecanethiol opløsning (1% v / v, i 95% ethanol, ACS / USP-kvalitet) i 10 min i en kemisk hætte. Derefter holder enheden i en vinkel tæt på 60 °, forsigtigt vaske overfladen med flere dråber af kun ethanol. Lad enhederne tørre natten over.
2. Metode 2
   1. I en kemisk hætte umiddelbart efter overtrækning af substratet med sod og mens substratet stadig er varm fra Flammen, deponere nogle dråber af fluoreret væske på den ene side afsubstrat og vippe substratet til en vinkel tæt på 90 °. Indbetal flere dråber, og lad dem rulle over hele sod overflade.
      BEMÆRK: Når dråben falder på en plet, bliver sod blive skyllet væk fra dette område. Lad dråber af fluorerede flydende spredes så meget som muligt.
   2. Bage substratet på en varm plade (160 ° C i 15 min) i et kemisk stinkskab.
   3. Lad substratet sidde natten over ved stuetemperatur før brug. Opbevar på ubestemt tid.

3. Fremstilling af Top elektroder (tilpasset fra Abdelgawad et al. ¹²⁾

1. Tegn elektroderne ved hjælp af grafisk design software. Hver elektrode er 2 mm lang, 0,3 mm bred, og afstanden mellem elektroderne er 0,3 mm. Kløften mellem kontakter (til at snappe ind i stikket, se nedenfor) er 2,3 mm (figur 1).
2. Trim en fleksibel kobber laminat (35 um tyk) i Monarch-format (3,87 x 7,5 inches). Brug andre størrelser if kompatibel med printeren. Indlæse laminat i bakken til manuel fødning af en farveprinter.
3. Sørg for at bruge "dybsort" eller "registrering black", når der udskrives på kobber ark (se Abdelgawad et al. ¹² for yderligere oplysninger) for at muliggøre en tættere lag af sort blæk på kobber substrat, beskytte det trykte mønster under ætsning . Lad det trykte substrat tørre helt, natten over.
4. Inde i en kemisk hætte, varme op (40 ° C) et bæger med 50 ml kobber ætsemiddel. Dyp den trykte laminat i bægeret, og ryst den forsigtigt i opløsningen i ca. 10 min. Ætsning afhænger af kobber ætsemiddel opløsning. Hvert par minutter, skal du kontrollere korrosion og se, om det mønster er intakt.
5. Vask omhyggeligt laminat med vand og fjerne belægningen med acetone og ethanol i den kemiske hætte. Vask igen, og forsigtigt tørre laminat med papirserviet.
6. Vedhæfte omhyggeligt laminat med elektroderne til en glass objektglas (75 x 25 mm, ~ 1 mm tyk) under anvendelse af dobbeltklæbende tape. Undgå luftlommer.
7. Vedhæft en film af perfluoralkoxy PFA til elektroderne ved hjælp af tape. Dette tjener til at forhindre utilsigtet berøring af elektroderne med dråben, som skader top elektroder på grund af kortslutning.

4. Elektronisk Interface (Circuit i figur 2)

1. Lod relæer og kondensatorer C til en universel printkortet.
2. Samle de resterende 10 relæ drivere på en loddefri breadboard for elektroniske kredsløb.
3. Wire hvert relæ førerens input til en kanal i printkortet.
4. Snap forsigtigt de øverste elektroder ind i en konnektor (figur 3). Wire hvert relæ driver output til en øverste elektrode, som vist i figuren. Bemærk, at der er en jordet stik kontakt mellem et par ledninger fra relæer, for at minimere elektrisk støj.
   BEMÆRK: Stikket sidder på en justerbar platform til at styre than afstand (0,1-0,5 mm) mellem top og bund (sod-coated) substrat.
5. Bruge et program til at styre timingen for højspænding (HV) anvendelse (ca. 0,8 sek) til 4 elektroder på samme tid, flytte en elektrode i retning af bevægelse (dvs. for 0,8 sek aktivere 1234 og derefter 2345, 3456, etc. ., 0,8 sek for hver gruppe, og derefter baglæns, så dråber bevæger sig i den modsatte retning samt).

5. Droplet Visualisering og Håndtering

1. Hvis du vil optage dråbe bevægelse, bruge visualisering system, som består af en 24X - 96X forstørrelse montage kombineret med et CCD-kamera. Tilslut videooptageren til kameraet ved hjælp af S-video.
2. Pipette en 4 pi dråbe indeholder C. elegans i medier på bunden af sod-coatede substrat.
3. Bringe de bedste elektroder til ~ 0,3 mm over dråben. Dråben bør være tæt på midten, lige under den femte elektrode, nemmere at betjene.
4. Tænde den elektroniske grænseflade og høj spænding (500 V _RMS), og indstille den øverste elektrode afstand til dråben, indtil det begynder at bevæge sig. Lad ikke de øverste elektroder røre dråben.
5. Indsaml data ved at registrere antallet af vellykkede dråber overførsler på enheden som reaktion på elektriske impulser. En vellykket eksperiment er kendetegnet ved mindst 700 dråber overførsler, altså, et transfer efter hver elektrisk puls.
6. Indsaml data uafbrudt, indtil dråben ikke bevæge sig mere i reaktion på 5 til 10 pulser.
   BEMÆRK: Når overfladen begynder at nedbrydes, kan motion genoprettes ved at bringe de bedste elektroder tættere til dråben.

Representative Results

Tidligere har vi anvendt Field-DW anordninger, der muliggør bevægelsen af ​​proteiner i DMF. Navnlig kunne dråber med bovint serumalbumin (BSA) bevæges ved en koncentration 2.000 gange højere end tidligere rapporteret af andre forfattere (uden tilsætningsstoffer). Dette skyldtes den reducerede samspil mellem dråbe og overflade Figur 4 viser en dråbe indeholdende fluorescens-mærket BSA (se Freire m.fl. ⁹ for mere information om forsøgene.). Det første billede til venstre viser dråben sad på sod-coatede overflade; den midterste, virkningen af ​​det elektriske felt, som udover at producere dråber rullende gælder også en opadgående kraft på dråben, hvilket yderligere reducerer interaktionen med overfladen. Bemærk shear kontrast (højre) til en fælles alternativ anvendes i DMF, som er en overflade belagt kun med fluorerede væske (uden lys sod); den stærke vekselvirkning med overfladen, angivet ved den nedre kontakt enNGLE ganske ofte hindrer bevægelse.

Her bruger vi den eksperimentelle set-up (Figur 3) at fortsætte forsøgene med disse enheder, nu transportere dråber, der indeholder større organismer, ormen C. elegans, en nematode, der anvendes i en række biologiske assays.

Dråber med orm lykkedes aktiveres på sod-substrater. Især Movie 1 viser en dråbe bevæger sig i respons på hver spændingsimpuls (~ 0,8 sek interval) (bemærk, at den flydende fraktion, fast til et sted uden sod, er ude af dråben pathway). Inspektion efter forsøgene viste, at ingen orme, aflejringer eller flydende rester, blev efterladt på dråber veje efter forsøgene, angivelse af nedsat samspil mellem dråben og overfladen.

Den elektroniske grænseflade (figur 2) tillader automatisering og bedre styring af drift, eftersom samtidig aktivering af grupper af elektroder (figur 1) Forøger den opadgående kraft, hvilket yderligere reducerer vekselvirkning med overfladen.

Forskellige forsøg har vist, at orme svømme uforstyrret som dråben bevæger (20 min total aktivering tid), hvilket indikerer, at den høje spænding (~ 500 V _RMS), der kræves for enhedens drift er ikke skadeligt for de biologiske arter, der transporteres. Dette understøttes af simuleringer, som har vist, at spændingsfaldet over dråben er en ubetydelig brøkdel (10 ^-6%) af den spænding, der kræves til drift (figur 5, potentiel forskel mellem et punkt på toppen og bunden af flyet i midten af ​​dråben); i virkeligheden, i dråber indeholdende Jurkat T-celler, tidligere undersøgelser udført af andre forfattere ¹³ tyder på, at sådanne minimal spændingsfald ikke påvirker cellernes levedygtighed, formering, og biokemi. For yderligere validering, men vi er i øjeblikket i gang med at designe eksperimenter til at vurdere langsigtede virkningeraf spænding på C. elegans. For simuleringerne er beskrevet her, blev et ~ 2 pi dråbe antages at være af PBS (phosphatbuffer saltvand), sidder på en 30 um tykt lag af sod. Top og bund elektroder blev modelleret som kobber, og den påtrykte spænding på 500 V _RMS (oplysninger om de simuleringer, se Freire et al. ^9).

Figur 1:. Billede af top elektroder Hver af de 10 er 2 mm lang og 0,3 mm bred. Kløften mellem 2 elektroder er også 0,3 mm, og afstanden mellem kontakter (nederst) er 2,3 mm.

Figur 2:. Skematisk af styresystemet for top elektroder, detaljering 1 af de 10 relæ drivere Hver top elektrode is enten udsættes for spænding, eller forbundet til en kondensator. Til højre et billede af brættet med relæerne. Bemærk, at den høje spænding, der kræves til drift holdes væk fra printkortet (hvid base) til venstre. Dråbe diagram (i midten) er tilpasset med tilladelse fra Freire et al. ⁹ Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3: Udsigt over den eksperimentelle set-up. Afstanden mellem toppen og bunden (sod-coated) substrat er justerbar. Kontakterne fra top elektroder fastgjort til et stik. Ledningerne fra relæer (vist her kun 1, 2 og 3 af de 10 tråde) er loddet til konnektoren, som er angivet på diagrammet til højre. Bemærk, at der er en jordforbindelse stik kontakt (f.eks forbindelseskontakter 2 eller 4) mellem et par ledninger fra relæer (f.eks 1 eller 3), for at minimere elektrisk støj. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4:. Dråber (4 pi) med fluorescerende mærket BSA (10 g / L) Venstre, sidder på en sod-baserede substrat; midten, en af ​​virkningerne af det elektriske felt er at anvende en opadrettet kraft på dråben yderligere minimere interaktion med substratet; ret, dråbe på en overflade belagt kun med fluorerede væske (ingen sod). Tilpasset med tilladelse fra Freire et al. ⁹

-6%) af spændingen for ønskede operation.

Movie 1 . dråben med C. elegans på en mark-DW-enhed, der bevæger sig i reaktion på hver spænding puls (~ 0,8 sek interval). Den flydende fraktion er vist nederst til venstre på videoen ikke er i dråben pathway.

Discussion

Den mest kritiske trin i protokollen er beskyttelsen af ​​sod lag direkte forbundet med succes i at flytte dråber. Metallisering soden lag (metode 1 ovenfor) giver mulighed for tæt på 100% af fabrikation succes. Den maksimale driftstid er ca. 10 min; eventuelt er dråbe fraktioner fugte sod gennem huller i metallaget. Belægning sod lag med den fluorerede væske er den nemmeste og hurtigste alternativ, og kræver minimum af ressourcer, men kun 40-50% af (min højst 20) fabrikeret substrater arbejde - og belægningen er ikke ensartet. Faktisk sod lag er meget skrøbelige, og de viskose fluorerede flydende let skader den. Vi arbejder i øjeblikket på mere robuste alternativer til at beskytte sod lag, hvilket ville øge driftstiden af ​​indretningen. Imidlertid et vigtigt aspekt er adsorption af dråber indhold til overfladen. Tidligere ⁹ vi kvantificeret mængden af protein, attgjorde ondt til overfladen under enhedens drift, og en korrelation mellem fortsat bevægelse og reduceret overfladeadsorption af bovint serumalbumin (BSA). Uanset, begroning er en kompliceret sag, og nogle forfattere endda foreslå, at det kan være umuligt helt at undertrykke effekt; i teorien, hvis kun et enkelt protein tillægger en overflade, mere vil blive tiltrukket af dette site. Faktisk er den maksimale driftstid rapporteret for digitale mikrofluide anordninger (af andre forfattere ⁶⁾ var ca. 40 minutter. Derfor robustheden af ​​overfladen er et punkt af stor betydning og stadig et arbejde i gang.

Bemærk, at i electrowetting anvendelsen af ​​spænding spreder ofte dråben med analytter på overfladen, helt hindre bevægelse, medmindre der anvendes additiver. Dog kan nogle additiver være giftige, eller måske kun arbejde inden for en række analytkoncentration i dråben. Field-DW-enheder tillader transport af analytter spænder from proteiner til enkelte celler og hele organismer, uden ekstra tilsætningsstoffer. Hertil kommer, at enhedens egenskaber er stort set uafhængig af tykkelse, ensartethed, og elektriske egenskaber af sod lag (se Freire et al. ⁹ for mere information).

Derfor betydningen af ​​den her beskrevne fremgangsmåde er, at det udvider anvendelsesområdet for ansøgninger til DMF, der baner vej for udvikling af fuldt kontrollerede lab-on-a-chip-platforme, der arbejder stort set uafhængigt af dråber kemi.

Dimensionerne af top elektroder er forenelige med printerens opløsning, og er ikke enestående; smallere og tættere elektroder kunne også fungere. I virkeligheden, kan andre metoder til fremstilling af printplader i elektronik skal anvendes. Det afgørende er, at dråben underkastes en ikke-ensartet elektrisk felt, og det vil bevæge sig mod det område, hvor feltet er mere intens. Dog bør der sørgesi design for at holde det elektriske felt mellem spændingsførende og flydende elektroder under 3 MV / m for at forhindre gnister; her er feltet ca. 1,7 MV / m, uden skarpe kanter.

Driften af ​​de elektroniske kredsløb er som følger. Hver øvre elektrode, gennem en relækontakt, enten forbundet til udgangen af ​​en høj spænding forstærker, eller til en kondensator (C), for at minimere elektrisk støj. Transistoren T tillader lav strøm outsourcet af styrekortet, gennem modstanden R og kondensatoren C _1, for at kontrollere større strøm er nødvendig for relæspolen at betjene. Dioden D forhindrer beskadigelse kredsløb på grund af den variable strøm i spolen (se materialer liste til listen over komponenter). Kun én kontrol bord tillader individuel adressering af alle elektroder, og kun én HV strømforsyning er påkrævet (figur 2), som udgangsspændinger (8-18 kHz, 500-660 V _RMS) efter forstærke sinusbølge leveret af en geneator. Bemærk, at HV holdes så langt væk som muligt fra styresystemet for at minimere støj og eventuel kredsløb funktionsfejl.

Assayene her rapporterede anvendes dråber 4 pi, simpelthen på grund af det faktum, at mindre dråber indeholder C. elegans er vanskeligere at pipette. Kulturen af C. elegans vil ikke blive diskuteret her, og læseren skal kigge efter protokollerne andre steder (f.eks., Brenner ^14).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin candle			Any paraffin candle
Sputtering system	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target.
1-dodecanethiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating.
Graphic design software -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Other softwares might be used as well.
Copper laminate	Dupont	LF9110
Laser Printer	Xerox	Phaser 6360 or similar	Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text).
Copper Etchant	Transene	CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 or similar	Large enough to allow the assemble of 10 drivers.
Universal circuit board	Allied Electronics	70219535 or similar
Connector	Allied Electronics	5145154-8 or similar
Control board and control program (LabView software)	National Instruments	NI-6229 or similar
High-voltage amplifier	Trek	PZD700
Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V	Allied	8817183
Transistor T, NPN	Allied	9350289
Diode D, 1N4007	Allied	2660007
Relay	Allied	8862527
Visualization system	Edmund Optics	VZM 200i or similar	System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder	Sony	GV-D1000 NTSC or similar	It is connected to the camera by an S-video cable.
Simulations	COMSOL Multiphysics	V. 4.4