Introduction
De miniaturisatie van apparaten die werken met vloeistoffen is van groot belang voor de ontwikkeling van "lab-on-a-chip 'platformen. In deze richting, hebben de afgelopen twee decennia een belangrijke vooruitgang op het gebied van microfluidics getuige, met een verscheidenheid aan toepassingen. 1-5 Contrasterende met het vervoer van vloeistof in gesloten kanalen (kanaal microfluidics), DMF manipuleert druppels op arrays van elektroden. Een van de meest aantrekkelijke voordelen van deze techniek is de afwezigheid van bewegende delen om vloeistoffen te transporteren en beweging direct gestopt door het uitschakelen van elektrische signalen.
Echter, druppeltje beweging afhankelijk inhoud druppel, zeker een ongewenste eigenschap voor een universele "lab-on-a-chip" platform. Druppeltjes bevattende eiwitten en andere analyten vasthouden aan het apparaat oppervlakken, steeds onbeweeglijk. Ongetwijfeld is dit al de grote beperking voor het verbreden van de reikwijdte van de DMF-toepassingen; 6-8alternatieven voor het ongewenste oppervlak vervuiling te minimaliseren omvatten de toevoeging van extra chemische species om de druppel of omgeving die potentieel druppeltje inhoud kunnen beïnvloeden.
Voorheen onze groep ontwikkelde een apparaat om het transport van cellen en eiwitten in DMF toe te staan, zonder extra toevoegingen (Field-DW-apparaten). 9 Dit werd bereikt door het combineren van een oppervlak op basis van kaars roet, 10 met een apparaat geometrie die druppel rollende gunsten en leidt tot een opwaartse kracht op de druppel verder afnemende interactie droplet-oppervlak. In deze benadering wordt druppeltje beweging niet geassocieerd met oppervlaktebevochtiging. 11
Het doel van de gedetailleerde methode hieronder beschreven aan een DMF inrichting kan transporteren druppeltjes bevattende eiwitten, cellen en gehele organismen produceren zonder extra toevoegingen. The Field-DW-apparaten maken de weg vrij voor een volledig gecontroleerde platformen grotendeels zelfstandig werken van de druppel chemicusry.
Hier presenteren we ook simulaties blijkt dat, ondanks de voor de werking van het apparaat hoogspanning, de spanningsval over de druppel is een kleine fractie van de aangelegde spanning, op verwaarloosbare effecten op bioanalytes in de druppel. In feite, voorproeven met Caenorhabditis elegans (C. elegans), een nematode gebruikt voor verschillende studies in de biologie, blijkt dat wormen zwemmen ongestoord als voltages toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: In de hierna beschreven procedures, moet veiligheidsrichtlijnen altijd opgevolgd. Van bijzonder belang is de veiligheid bij de behandeling van hoge spanning (> 500 V) en handen wassen.
1. Coating van een geleidend substraat met Kaars Roet
- Cut koper metaal in rechthoeken (75 x 43 mm, 0,5 mm dik). Reinig elke koper substraat door onderdompeling in koper etsmiddel voor ongeveer 30 sec, wassen met leidingwater voor ongeveer 20 sec, en droog met papier.
OPMERKING: Bij gebruik van methode 1 hieronder, veranderen de afmetingen 75 x 25 mm om te passen in de machine. - Sweep een brandende kaars paraffine onder de koperen substraat gedurende 30-45 seconden, om een ongeveer uniform coating roet (ongeveer 40 urn dik) te verkrijgen. Houd het substraat ~ 1 cm in de vlam. Laat het fragiele roet niet aan.
2. Bescherming van de Roet Layer met Coating
OPMERKING: Het roet laag is zeer fragielEn moet worden bekleed ter bescherming. Twee eenvoudige alternatieven (methode 1 en 2) worden hier voorgesteld, maar robuuster protocollen zijn nog in ontwikkeling.
- Methode 1
- Plaats het monster in de metalen verdamper of sputtering systeem. Na de operatie procedures van het systeem, evacueren de kamer, en start gecontroleerde afzetting van goud op de roet laag (150-200 nm). Laat het apparaat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Dip-coat de gemetalliseerde substraat in een 1-dodecaanthiol oplossing (1% v / v, in 95% ethanol, ACS / USP), gedurende 10 min in een chemische kap. Vervolgens, het toestel op een hoek van bijna 60 °, voorzichtig wassen het oppervlak met enkele druppels alleen ethanol. Laat de apparaten droog, 's nachts.
- Methode 2
- In een chemische kap onmiddellijk na het bekleden van het substraat met roet en terwijl het substraat nog warm van de kaars vlam, deponeren enkele druppels gefluoreerde vloeistof aan één zijde van desubstraat, en kantel het substraat naar een hoek in de buurt van 90 °. Stort meer druppeltjes, en laat ze rollen over de gehele roet oppervlak.
OPMERKING: Wanneer de druppel valt op een plek, zal roet uit de buurt van dat gebied worden gewassen. Laat de druppeltjes van vloeibare gefluoreerde spread zoveel mogelijk. - Bak het substraat op een hete plaat (160 ° C gedurende 15 min) in een chemische kap.
- Laat het substraat zitten overnacht bij kamertemperatuur vóór gebruik. Slaan voor onbepaalde tijd.
- In een chemische kap onmiddellijk na het bekleden van het substraat met roet en terwijl het substraat nog warm van de kaars vlam, deponeren enkele druppels gefluoreerde vloeistof aan één zijde van desubstraat, en kantel het substraat naar een hoek in de buurt van 90 °. Stort meer druppeltjes, en laat ze rollen over de gehele roet oppervlak.
3. Fabricage van Top Elektroden (Aangepast van Abdelgawad et al. 12)
- Teken de elektroden met behulp van software voor grafisch ontwerp. Elke elektrode is 2 mm lang, 0,3 mm breed, en de opening tussen elektroden 0,3 mm. De kloof tussen de contacten (snap in de connector, zie hieronder) is 2,3 mm (figuur 1).
- Knip een flexibele koperen laminaat (35 micrometer dik) in de Monarch-formaat (3,87 x 7,5 inch). Gebruik andere maten if compatibel zijn met de printer. Laad het laminaat in de lade voor handmatige invoer van een kleurenprinter.
- Zorg ervoor dat "rijke zwarte" of "registratie zwarte" gebruiken, wanneer u afdrukt op de koperen plaat (zie Abdelgawad et al. 12 voor details) om een dichtere laag zwarte inkt toe op de koperen ondergrond, de bescherming van het gedrukte patroon tijdens het etsen . Laat het bedrukte substraat volledig opdrogen, 's nachts.
- Binnen een chemische kap, opwarmen (40 ° C) een bekerglas met 50 ml van koper etsmiddel. Dompel de bedrukte laminaat in de beker, en schud het in de oplossing gedurende ongeveer 10 min. Ets hangt af van de koperen etsoplossing. Om de paar minuten, controleer dan de corrosie en zien of het patroon intact is.
- Was de laminaat met water en verwijder de coating met aceton en ethanol in de chemische kap. Was weer, en voorzichtig droog het laminaat met een papieren handdoek.
- Zorgvuldig hechten het laminaat met elektroden om een glass slide (75 x 25 mm, ~ 1 mm dik), met behulp van dubbelzijdige tape. Vermijd luchtbellen.
- Bevestig een film van perfluoralkoxy PFA naar de elektroden met behulp van tape. Dit dient om toevallig contact van de elektroden met de druppel, voorkomen dat die schade top elektroden te wijten aan kortsluiting.
4. De elektronische interface (Circuit figuur 2)
- Soldeer de relais en de condensatoren C om een universele printplaat.
- Monteer de rest van het 10 relais drivers op een Breadboard voor elektronische schakelingen.
- Draads ingang elk relais bestuurder om een kanaal in de besturingskaart.
- Zorgvuldig snap boven elektroden in een connector (figuur 3). Wire uitgang elk relais bestuurder om een bovenelektrode, zoals afgebeeld. Merk op dat er een geaarde connectorcontact tussen twee draden van relais, elektrische ruis te minimaliseren.
Opmerking: De connector zit op een verstelbare platform t besturenhij afstand (0,1-0,5 mm) tussen de boven- en onderkant (roet-gecoat) substraat. - Gebruik een programma om timing voor hoogspanning (HV) applicatie (ongeveer 0,8 sec) 4 elektroden tegelijk bedienen verschuiven 1 elektrode in de richting van beweging (bijvoorbeeld, 0,8 sec aandrijving 1234, dan 2345, 3456, enz ., 0,8 sec voor elke groep, en vervolgens naar achteren, dus druppel in de tegengestelde richting aan).
5. Droplet Visualization and Handling
- Om druppeltje beweging opnemen, gebruikt het visualisatie systeem, dat bestaat uit een 24X - 96x vergroting samenstel gecombineerd met een CCD camera. Sluit de videorecorder aan op de camera met behulp van S-video.
- Pipetteer een 4 pl druppelgrootte met C. elegans media op de bodem van de roet beklede substraat.
- Breng de bovenste elektroden ~ 0,3 mm boven de druppel. De druppel moet dicht bij het midden, net onder de vijfde elektrode, voor gemakkelijkere bediening zijn.
- Zet de elektronische interface en spanning (500 V RMS) en stel de bovenste elektrode afstand tot de druppel tot het begint te bewegen. Laat niet de top elektroden raken de druppel.
- Gegevens verzamelen door het opnemen van het aantal succesvolle overdracht druppel op het apparaat in reactie op elektrische pulsen. Een succesvolle experiment wordt gekenmerkt minstens 700 druppeltje transfers, dwz één overdracht na elke elektrische puls.
- Verzamel data continu tot de druppel niet meer bewegen in reactie op 5 tot 10 pulsen.
Opmerking: Als het oppervlak begint te degraderen, kan beweging worden hersteld door dichter bij de druppel waardoor de bovenste elektroden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerder hebben we Field-DW apparatuur gebruikt voor de beweging van eiwitten in DMF toe. In het bijzonder zou druppeltjes met bovine serum albumine (BSA) in een concentratie 2000 maal hoger dan eerder gerapporteerd door andere auteurs (zonder additieven) worden bewogen. Dit was te wijten aan de verminderde interactie tussen druppel en het oppervlak Figuur 4 toont een druppel die fluorescent gelabeld BSA (zie Freire et al 9 voor meer informatie over de experimenten.). De eerste foto links toont de druppel zitten op de roet-gecoate oppervlak; de middelste, het effect van het elektrisch veld, die naast druppeltje rollen produceren, is ook een opwaartse kracht op de druppel, de interactie met het oppervlak verder verlaagt. Let op de afschuiving contrast (rechts) een gemeenschappelijk alternatief gebruikt in DMF, dat een oppervlak bedekt alleen gefluoreerde vloeistof (zonder kaars roet); de sterke interactie met het oppervlak, aangeduid door het onderste contactvlak eenngle, heel vaak belemmert beweging.
Hier gebruiken we de experimentele opstelling (figuur 3) aan de proeven met deze apparaten verder, nu transporteren druppeltjes die grotere organismen, de worm C. elegans, een nematode gebruikt in een verscheidenheid van biologische assays.
Druppeltjes met wormen met succes bediend op roet beklede substraten. In het bijzonder, Film 1 toont een druppel bewegen in reactie op elke spanningspuls (~ 0.8 sec interval) (merk op dat de dunne fractie, geplakt op een plaats met geen roet, is uit de druppel pathway). Controle na de experimenten bleek dat er geen wormen, puin, of vloeibare resten werden achtergelaten op druppeltjes signaalwegen na de experimenten, geeft de verminderde interactie tussen druppel en het oppervlak.
De elektronische interface (figuur 2) maakt automatisering en betere beheersing van de beweging, aangezien tegelijkertijd ingeschakeld groepen elektroden (figuur 1) Verhoogt de opwaartse kracht, interactie verdere vermindering van het oppervlak.
Verschillende proeven hebben aangetoond dat wormen zwemmen ongestoord de druppel beweegt (20 min totale schakelduur), wat aangeeft dat (~ 500 V RMS) vereist voor de werking van het apparaat hoogspanning is niet schadelijk voor de biologische vervoerde soorten. Dit wordt ondersteund door simulaties, die hebben aangetoond dat de spanningsval over de druppel een onaanzienlijk deel (10 -6%) van de spanning nodig voor gebruik (figuur 5, potentiaalverschil tussen een punt op de boven- en onderkant van het vliegtuig midden druppel); in feite, in druppeltjes met Jurkat T-cellen eerdere studies van andere auteurs 13 suggereren dat dergelijke geringe spanningsval hebben geen invloed op de levensvatbaarheid van cellen, proliferatie en biochemie. Voor verdere validatie, maar we zijn op dit moment in het proces van het ontwerpen van experimenten om de lange termijn effecten te evaluerenvan de spanning op C. elegans. Voor de hier beschreven simulaties werd een ~ 2 ul druppel aangenomen PBS (fosfaat buffer zoutoplossing) om, op een 30 pm dikke laag roet. De bovenste en onderste elektroden werden gemodelleerd als koper, en de aangelegde spanning van 500 V RMS (Voor details over de simulaties, zie Freire et al. 9).
Figuur 1:. Foto van top elektroden Elk van de 10 is 2 mm lang en 0,3 mm breed. De kloof tussen de 2 elektroden is 0.3 mm, en de afstand tussen de contacten (onderkant) is 2.3 mm.
Figuur 2:. Schema van het regelsysteem voor top elektroden, waarin 1 van de 10 relais drivers Elk bovenelektrode is hetzij blootgesteld aan spanning, of verbonden met een condensator. Aan de rechterkant, een foto van het bord met de relais. Merk op dat de voor de werking hoogspanning weg van de besturingskaart (witte basis) links wordt gehouden. Droplet diagram (Midden) aangepast met toestemming van Freire et al. 9 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Mening van de experimentele set-up. De afstand tussen bovenste en onderste (roet beklede) substraat instelbaar. De contacten van boven elektroden zijn vastgeklikt in een connector. De draden van relais (hier slechts 1, 2 en 3 van de 10 draden) zijn gesoldeerd aan de connector, zoals aangegeven door het diagram rechts. Merk op dat er een geaarde connectorcontact (bv connector contacten 2 of 4) tussen een paar draden van relais (bijvoorbeeld 1 of 3), om elektrische ruis te minimaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4:. Druppels (4 pl) met fluorescent-gelabeld BSA (10 g / l) Links, zittend op een roet-gebaseerde ondergrond; midden, een van de effecten van het elektrisch veld om een opwaartse kracht uit te oefenen op de druppel, de interactie met het substraat verder geminimaliseerd; recht, druppel op een oppervlak bedekt alleen met gefluoreerde vloeistof (geen roet). Aangepast met toestemming van Freire et al. 9
Film 1 . Druppeltje met C. elegans op een Gebied-DW-apparaat, bewegen in reactie op elke spanningspuls (~ 0.8 sec interval). De vloeibare fractie die op de linker onderkant van de video is niet in de druppel weg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stap van het protocol is de bescherming van het roet laag rechtstreeks bij het succes bewegende druppeltjes. Metalliseren roet laag (methode 1 hierboven) kan bijna 100% van fabricage succes. De maximale werking is ongeveer 10 min; eventueel worden druppel fracties bevochtigen roet door gaten in de metaallaag. Het roet laag met de gefluoreerde vloeibare coating is de makkelijkste en snelste alternatief, en vereist minimale middelen, maar slechts 40-50% van de (min maximaal 20) gefabriceerd substraten werk - en de coating is niet uniform. In feite, het roet laag is erg fragiel, en de viskeuze vloeistof gefluoreerde gemakkelijk schade het. We werken momenteel aan meer robuuste alternatieven voor het roet laag, die de gebruiksduur van het apparaat zou toenemen beschermen. Echter, een belangrijk aspect is de adsorptie van inhoud druppeltje op het oppervlak. Eerder 9 we gekwantificeerd de hoeveelheid eiwit die attached aan het oppervlak tijdens werking van het apparaat, en een correlatie gevonden tussen voortgezet beweging en minder oppervlak adsorptie van runderserum albumine (BSA). Ondanks biofouling is complex en sommige auteurs suggereren zelfs dat het onmogelijk zou zijn om het effect volledig te onderdrukken; in theorie, als slechts een enkel eiwit hecht aan een oppervlak, meer worden aangetrokken tot de site. In feite is de maximale bedrijfstijd gerapporteerd voor digitale microfluïdische inrichtingen (andere auteurs 6) was ongeveer 40 minuten. Daarom is de robuustheid van het oppervlak is een punt van groot belang is en nog steeds een work in progress.
Merk op dat, in electrowetting, het aanleggen van spanning vaak verspreidt de druppel met analyten op het oppervlak volledig belemmeren beweging, tenzij additieven worden gebruikt. Echter, sommige additieven giftig zijn, of kan alleen binnen een bereik van analyt concentraties in de druppel. Field-DW apparaten kunnen het vervoer van analyten variërend from eiwitten aan enkele cellen en hele organismen, zonder extra toevoegingen. Daarnaast kenmerken van het apparaat zijn grotendeels onafhankelijk van de dikte, uniformiteit, en elektrische eigenschappen van het roet laag (zie Freire et al. 9 voor meer informatie).
Daarom is de betekenis van de hier beschreven methode is dat het verbreedt de scope van de aanvragen voor DMF, de weg vrijmaakt voor de ontwikkeling van volledig gecontroleerde lab-on-a-chip platformen grotendeels zelfstandig werken van de druppel chemie.
De afmetingen van de bovenste elektroden zijn compatibel met de resolutie van de printer, en zijn niet uniek; smaller en dichter elektroden kan ook werken. In feite, kunnen andere werkwijzen voor het vervaardigen van printplaten voor elektronische eveneens worden gebruikt. Van belang is dat de druppel wordt onderworpen aan een niet-uniform elektrisch veld zal bewegen naar het gebied waar het veld intenser. Toch moet erop worden geletin het ontwerp om het elektrisch veld tussen energiek en drijvende elektroden onder de 3 MV / m om vonken te voorkomen houden; hier, het veld is ongeveer 1,7 MV / m, zonder scherpe randen.
De werking van de elektronische circuits is als volgt. Elke top elektrode via een relaiscontact, ofwel verbonden met de uitgang van een hoog voltage versterker, of een condensator (C), elektrische ruis te minimaliseren. De transistor T laat de lage stroom uitbesteed door de control board, door de weerstand R en de condensator C 1, om de grotere stroom die nodig is voor de relaisspoel te bedienen controle. De diode D voorkomt circuit schade als gevolg van de variabele stroom in de spoel (zie lijst materialen voor het overzicht van onderdelen). Slechts één besturingskaart kunnen afzonderlijke adressering van alle elektroden en één HV voeding nodig (figuur 2), die uitgangsspanningen (8-18 kHz, 500-660 V RMS) na versterking van de sinus door een generator. Merk op dat HV wordt gehouden zo ver mogelijk weg van het besturingssysteem, om geluidsoverlast en mogelijke storingen circuit minimaliseren.
De hier vermelde assays gebruikt 4 pl druppels, eenvoudig vanwege het feit dat kleine druppeltjes met C. elegans zijn moeilijker te pipetteren. De cultuur van C. elegans zal hier niet worden besproken, en de lezer moet zoeken naar de protocollen elders (bv., Brenner 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken de Lindback Stichting voor financiële steun, en Dr Alexander Sidorenko en Elza Chu voor vruchtbare discussies en technische bijstand, en professor Robert Smith voor hulp bij de C. elegans assays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin candle | Any paraffin candle | ||
| Sputtering system | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| Teflon | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating. |
| Graphic design software -Adobe Illustrator | Adobe Systems | Other softwares might be used as well. | |
| Copper laminate | Dupont | LF9110 | |
| Laser Printer | Xerox | Phaser 6360 or similar | Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) film | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 or similar | Large enough to allow the assemble of 10 drivers. |
| Universal circuit board | Allied Electronics | 70219535 or similar | |
| Connector | Allied Electronics | 5145154-8 or similar | |
| Control board and control program (LabView software) | National Instruments | NI-6229 or similar | |
| High-voltage amplifier | Trek | PZD700 | |
| Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V | Allied | 8817183 | |
| Transistor T, NPN | Allied | 9350289 | |
| Diode D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | Allied | 8862527 | |
| Visualization system | Edmund Optics | VZM 200i or similar | System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera. |
| Recorder | Sony | GV-D1000 NTSC or similar | It is connected to the camera by an S-video cable. |
| Simulations | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
References
- Fair, R. B. Digital microfluidics: is a true lab-on-a-chip possible. Microfluid Nanofluid. 3 (3), 245-281 (2007).
- Gupta, S., Alargova, R. G., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. On-Chip Dielectrophoretic Coassembly of Live Cells and Particles into Responsive Biomaterials. Langmuir. 26 (5), 3441-3452 (2009).
- Shih, S. C., et al. Dried blood spot analysis by digital microfluidics coupled to nanoelectrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 84 (8), 3731-3738 (2012).
- Gorbatsova, J., Borissova, M., Kaljurand, M. Electrowetting-on-dielectric actuation of droplets with capillary electrophoretic zones for off-line mass spectrometric analysis. J Chromatogr. 1234 (0), 9-15 (2012).
- Qin, J., Wheeler, A. R. Maze exploration and learning in C. elegans. Lab Chip. 7 (2), 186-192 (2007).
- Koc, Y., de Mello, A. J., McHale, G., Newton, M. I., Roach, P., Shirtcliffe, N. J. Nano-scale superhydrophobicity: suppression of protein adsorption and promotion of flow-induced detachment. Lab Chip. 8 (4), 582-586 (2008).
- Perry, G., Thomy, V., Das, M. R., Coffinier, Y., Boukherroub, R. Inhibiting protein biofouling using graphene oxide in droplet-based microfluidic microsystems. Lab Chip. 12 (9), 1601-1604 (2012).
- Kumari, N., Garimella, S. V. Electrowetting-Induced Dewetting Transitions on Superhydrophobic Surfaces. Langmuir. 27 (17), 10342-10346 (2011).
- Freire, S. L. S., Tanner, B. Additive-Free Digital Microfluidics. Langmuir. 29 (28), 9024-9030 (2013).
- Deng, X., Mammen, L., Butt, H. -J., Vollmer, D. Candle Soot as a Template for a Transparent Robust Superamphiphobic Coating. Science. 335, 67-70 (2011).
- Kang, K. H. How Electrostatic Fields Change Contact Angle in Electrowetting. Langmuir. 18 (26), 10318-10322 (2002).
- Abdelgawad, M., Watson, M. W. L., Young, E. W. K., Mudrik, J. M., Ungrin, M. D., Wheeler, A. R. Soft lithography: masters on demand. Lab Chip. 8 (8), 1379-1385 (2008).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8 (4), 519-526 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
