Introduction
La miniaturización de los dispositivos que funcionan con líquidos es de suma importancia para el desarrollo de plataformas de "lab-on-a-chip". En este sentido, las dos últimas décadas han sido testigos de un avance significativo en el campo de la microfluídica, con una variedad de aplicaciones. 5.1 En contraste con el transporte de fluidos en los canales cerrados (canal de microfluidos), DMF manipula gotitas en matrices de electrodos. Uno de los méritos más atractivas de esta técnica es la ausencia de partes móviles para el transporte de fluidos, y el movimiento se detiene al instante apagando señales eléctricas.
Sin embargo, el movimiento de gotitas depende de su contenido de gota, sin duda una característica indeseable para una plataforma universal "lab-on-a-chip". Las gotitas que contienen proteínas y otros analitos se adhieren a las superficies de dispositivos, convirtiéndose en inamovible. Sin duda, ésta ha sido la principal limitación para ampliar el alcance de las aplicaciones de DMF; 6-8alternativas para minimizar el ensuciamiento superficie no deseado implican la adición de especies químicas adicionales a la gota o sus alrededores, lo que podría afectar el contenido de las gotas.
Anteriormente, nuestro grupo desarrolló un dispositivo para permitir el transporte de células y proteínas en DMF, sin aditivos adicionales (aparatos de campo-DW). 9 Esto se logró mediante la combinación de una superficie basada en el hollín vela, 10 con una geometría del dispositivo que favorece la gotita de laminación y conduce a una fuerza hacia arriba en la gotita, disminuyendo aún más la interacción de gotitas en la superficie. En este enfoque, el movimiento gotita no está asociado con humectación de la superficie. 11
El objetivo del método detallado se describe a continuación es producir un dispositivo de DMF capaz de transportar gotitas que contienen proteínas, células y organismos enteros, sin aditivos adicionales. Los dispositivos de campo-DW allanan el camino para las plataformas de trabajo totalmente controladas en gran medida independiente de farmacia gotary.
Aquí, también presentes simulaciones que muestran que, a pesar de la alta tensión necesaria para el funcionamiento del dispositivo, la caída de voltaje a través de la gotita es una pequeña fracción de la tensión aplicada, lo que indica efectos insignificantes en bioanalytes dentro de la gotita. De hecho, las pruebas preliminares con Caenorhabditis elegans (C. elegans), un nematodo utilizado para una variedad de estudios de la biología, muestran que los gusanos nadan sin perturbaciones como se aplican voltajes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: En los procedimientos que se describen a continuación, las pautas de seguridad de laboratorio siempre se deben seguir. De particular importancia es la seguridad cuando se trata de alto voltaje (> 500 V) y manipulación de productos químicos.
1. Recubrimiento de un sustrato conductor con la vela hollín
- Cortar en rectángulos de metal de cobre (75 x 43 mm, 0,5 mm de espesor). Limpie cada sustrato de cobre por inmersión en solución de ataque de cobre durante unos 30 segundos, lavar con agua del grifo durante unos 20 segundos, y secar con papel.
NOTA: Si se utiliza el método 1 a continuación, cambie las dimensiones de 75 x 25 mm para encajar en la máquina. - Barrer una vela de parafina iluminada bajo el substrato de cobre durante 30-45 segundos, para obtener un recubrimiento de hollín aproximadamente uniforme (alrededor de 40 m de espesor). Mantenga el sustrato a ~ 1 cm dentro de la llama. No toque la superficie de hollín frágil.
2. La protección de la capa de hollín con Recubrimiento
NOTA: La capa de hollín es muy frágil, Y debe ser cubierto para la protección. Dos alternativas simples (métodos 1 y 2 a continuación) se sugieren aquí, pero los protocolos más robustos están actualmente en desarrollo.
- Método 1
- Cargar la muestra en el evaporador de metal o sistema de pulverización catódica. Siguiendo los procedimientos de operación del sistema, evacuar la cámara y comenzar la deposición controlada de oro sobre la capa de hollín (150-200 nm). Deje que el dispositivo se enfríe a temperatura ambiente.
- Dip-revestir el sustrato metalizado en una solución de 1-dodecanotiol (1% v / v, en etanol al 95%, grado ACS / USP), durante 10 minutos dentro de una campana química. Entonces, sostiene el dispositivo en un ángulo cercano a 60 °, lavar suavemente la superficie con varias gotas de etanol sólo. Deje que los dispositivos seca, durante la noche.
- Método 2
- En una campana química, inmediatamente después de revestir el sustrato con hollín y mientras el sustrato está todavía caliente de la llama de la vela, depositar algunas gotas de líquido fluorado en un lado de lasustrato, e inclinar el sustrato a un ángulo próximo a 90 °. Deposite más gotas, y dejar que ellos ruedan sobre la superficie entera de hollín.
NOTA: Cuando la gota cae en un punto, el hollín se lavará lejos de esa zona. Dejar que las gotitas de líquido fluorado propagación tanto como sea posible. - Hornear el sustrato sobre una placa caliente (160 ° C durante 15 min) dentro de una campana química.
- Deje que el sustrato reposar toda la noche a temperatura ambiente antes de su uso. Almacenar indefinidamente.
- En una campana química, inmediatamente después de revestir el sustrato con hollín y mientras el sustrato está todavía caliente de la llama de la vela, depositar algunas gotas de líquido fluorado en un lado de lasustrato, e inclinar el sustrato a un ángulo próximo a 90 °. Deposite más gotas, y dejar que ellos ruedan sobre la superficie entera de hollín.
3. Fabricación de electrodos superiores (Adaptado de Abdelgawad et al. 12)
- Dibuje los electrodos utilizando software de diseño gráfico. Cada electrodo es de 2 mm de largo, 0,3 mm de ancho, y la brecha entre los electrodos es de 0,3 mm. La brecha entre los contactos (para encajar en el conector, ver más abajo) es de 2,3 mm (Figura 1).
- Recorte un laminado flexible de cobre (35 micras de espesor) en el formato Monarch (3,87 x 7,5 pulgadas). Utilice otros tamaños if compatible con la impresora. Cargue el laminado en la bandeja de alimentación manual de una impresora a color.
- Asegúrese de utilizar "negro rico", o "registro negro", cuando se imprime en la hoja de cobre (ver Abdelgawad et al. 12 para más detalles) para permitir que una capa más densa de tinta negro sobre el sustrato de cobre, protegiendo el patrón impreso durante el grabado . Deje secar completamente el sustrato impreso, durante la noche.
- Dentro de una campana química, caliente (40 ° C) un vaso de precipitados con 50 ml de reactivo de ataque de cobre. Sumerja el laminado impreso en el vaso de precipitados, y agítelo suavemente en la solución durante unos 10 minutos. Tiempo de grabado depende de la solución de grabado de cobre. Cada pocos minutos, comprobar la corrosión y ver si el patrón está intacto.
- Lave cuidadosamente la lámina con agua, y eliminar el recubrimiento con acetona y etanol en la campana química. Lavar una vez más, y seque con cuidado el laminado con una toalla de papel.
- Conecte con cuidado el laminado con electrodos a un gladiapositiva ss (75 x 25 mm, ~ 1 mm de espesor), utilizando cinta de doble cara. Evite las bolsas de aire.
- Adjunte una película de perfluoroalcoxi PFA a los electrodos utilizando cinta. Esto sirve para evitar el contacto accidental de los electrodos con la gota, que daña electrodos superiores debido a cortocircuito.
4. La interfaz electrónica (circuito de la Figura 2)
- Soldar los relés y los condensadores C a una placa de circuito universal.
- Montar el resto de los controladores de relé 10 en un circuito sin soldadura para circuitos electrónicos.
- Cable de entrada de cada conductor del relé a un canal en el tablero de control.
- Romper con cuidado los electrodos superiores en un conector (Figura 3). Cada cable de salida del controlador de relés a un electrodo superior, como se muestra en la figura. Tenga en cuenta que hay un contacto del conector a tierra entre un par de cables de relés, para minimizar el ruido eléctrico.
NOTA: El conector se asienta sobre una plataforma ajustable para controlar la tque la distancia (0,1-0,5 mm) entre el sustrato (hollín-revestido) superior e inferior. - Utilice un programa para controlar el tiempo para la aplicación de alta tensión (HV) (alrededor de 0,8 seg) para 4 electrodos al mismo tiempo, desplazando 1 electrodo en la dirección del movimiento (es decir, para 0,8 seg, 1234 accionar, a continuación, 2345, 3456, etc ., 0,8 seg para cada grupo, y luego hacia atrás, se mueve de modo de gotitas en la dirección opuesta también).
5. Visualización de la gotita y Manipulación
- Para grabar el movimiento de las gotas, utilizar el sistema de visualización, que se compone de un 24X - conjunto de magnificación 96X combinado con una cámara CCD. Conecte la grabadora de vídeo a la cámara mediante S-vídeo.
- Pipetear una gota de 4 l que contiene C. elegans en los medios de comunicación en la parte inferior del sustrato recubierto de hollín.
- Traiga los electrodos superiores a ~ 0,3 mm por encima de la gota. La gota debe estar cerca de la mitad, justo por debajo del quinto electrodo, para facilitar la operación.
- Encienda la interfaz electrónica y alta tensión (500 V RMS), y ajustar la distancia de la parte superior del electrodo a la gota hasta que comienza a moverse. No deje que los electrodos superiores tocan la gota.
- Recopilar datos mediante el registro del número de transferencias exitosas de gotitas en el dispositivo en respuesta a impulsos eléctricos. Un experimento exitoso se caracteriza por al menos 700 transferencias de gotitas, es decir, una transferencia después de cada pulso eléctrico.
- Recopilar datos continuamente, hasta que la gota no se mueve más en respuesta a 5 a 10 pulsos.
NOTA: Cuando la superficie comienza a degradarse, el movimiento podría ser restaurado por traer los mejores electrodos cerca de la gota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anteriormente, hemos utilizado dispositivos Field-DW para permitir el movimiento de las proteínas en DMF. En particular, las gotitas con albúmina de suero bovino (BSA) se pueden mover a una concentración 2.000 veces mayor que lo reportado previamente por otros autores (sin aditivos). Esto era debido a la reducción de la interacción entre las gotitas y superficie; La figura 4 muestra una gotita que contiene marcado con fluorescencia-BSA (ver Freire et al 9 para más información sobre los experimentos.). La primera imagen de la izquierda muestra la gotita que se sienta en la superficie recubierta de hollín; el del medio, el efecto de campo eléctrico, que, además de producir gotita de rodadura, también se aplica una fuerza hacia arriba en la gotita, reduciendo aún más la interacción con la superficie. Note el contraste de cizallamiento (derecha) para una alternativa común utilizado en DMF, que es una superficie recubierta sólo con el líquido fluorado (sin hollín vela); la fuerte interacción con la superficie, indicada por el contacto inferior unangle, muy a menudo dificulta el movimiento.
Aquí, utilizamos el montaje experimental (Figura 3) para continuar las pruebas con estos dispositivos, ahora el transporte de gotitas que contienen organismos más grandes, el gusano C. elegans, un nematodo utilizado en una variedad de ensayos biológicos.
Gotitas con gusanos fueron accionados con éxito en sustratos recubiertos de hollín. En particular, Película 1 muestra una gota se mueve en respuesta a cada pulso de voltaje (~ 0,8 intervalo seg) (tenga en cuenta que la fracción líquida, pegado a un lugar sin hollín, está fuera de la vía de gotitas). Inspección después de los experimentos revelaron que no hay gusanos, los desechos o residuos líquidos, se dejaron en las gotitas de las vías después de los experimentos, indicando reducción de la interacción entre la gota y la superficie.
La interfaz electrónica (Figura 2) permite la automatización y un mejor control de movimiento, ya que el accionamiento simultáneo de grupos de electrodos (Figura 1) Aumenta la fuerza hacia arriba, reduciendo aún más la interacción con la superficie.
Diferentes experimentos han demostrado que los gusanos nadan sin perturbaciones como los movimientos de gota (20 min tiempo total de actuación), lo que indica que la alta tensión (~ 500 V RMS) requerido para el funcionamiento del dispositivo no es perjudicial para las especies biológicas que se transportan. Esto es apoyado por simulaciones, que han demostrado que la caída de voltaje a través de la gota es una fracción insignificante (10 -6%) de la tensión necesaria para el funcionamiento (Figura 5, la diferencia de potencial entre un punto en la parte superior y la parte inferior del plano en el el medio de gotita); de hecho, en gotitas que contienen las células T Jurkat, los estudios previos realizados por otros autores 13 sugieren que tales caídas de tensión mínima no afectan a la viabilidad celular, la proliferación, y la bioquímica. Para una mayor validación, sin embargo, actualmente estamos en el proceso de diseño de experimentos para evaluar los efectos a largo plazode la tensión en C. elegans. Para las simulaciones que aquí se describen, una gotita l ~ 2 se asumió que era de PBS (tampón fosfato salino), que se sienta en una gruesa capa de hollín 30 micras. Electrodos superior e inferior se modelaron como el cobre, y la tensión aplicada igual a 500 V RMS (Para más detalles sobre las simulaciones, ver Freire et al. 9).
Figura 1:. Imagen de electrodos superiores Cada uno de los 10 es de 2 mm de largo y 0,3 mm de ancho. La brecha entre los dos electrodos es también de 0,3 mm, y la distancia entre los contactos (abajo) es de 2,3 mm.
Figura 2:. Esquemática del sistema de control para electrodos superiores, detallando 1 de los controladores de relé 10 Cada electrodo superior is ya sea sometido a tensión, o conectado a un condensador. A la derecha, una foto de la placa con los relés. Tenga en cuenta que la alta tensión necesaria para el funcionamiento se mantiene lejos de la placa de control (base blanca) a la izquierda. Diagrama de la gotita (Oriente) adaptado con permiso de Freire et al. 9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 3: Vista del montaje experimental. La distancia entre el sustrato (hollín-revestido) superior e inferior es ajustable. Los contactos de electrodos superiores se encajan en un conector. Los cables de relés (que se muestran aquí sólo 1, 2 y 3 de los 10 cables) se sueldan al conector, como se indica por el diagrama de la derecha. Tenga en cuenta que hay un contacto del conector a tierra (por ejemplo, los contactos del conector de 2 o 4) entre un par de hilos de relés (por ejemplo, 1 o 3), para minimizar el ruido eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Figura 4:. Las gotitas (4 l) con BSA marcado con fluorescencia (10 g / L) Izquierda, sentado sobre un sustrato a base de hollín; medio, uno de los efectos del campo eléctrico es aplicar una fuerza hacia arriba sobre la gotita, minimizando aún más la interacción con el sustrato; derecho, gotita en una superficie recubierta sólo con líquido fluorado (sin hollín). Adaptado con permiso de Freire et al. 9
Película 1 . Gotita con C. elegans en un dispositivo Field-DW, moviéndose en respuesta a cada pulso de voltaje (~ intervalo de 0,8 seg). La fracción líquida se muestra en la parte inferior izquierda del vídeo no está en la ruta de las gotas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El paso más importante del protocolo es la protección de la capa de hollín, directamente relacionado con el éxito en gotas en movimiento. Metalizar la capa de hollín (método 1 anterior) permite cerca de 100% de éxito de fabricación. Sin embargo, el tiempo máximo de funcionamiento es de aproximadamente 10 min; posiblemente, las fracciones de gotitas están mojando el hollín a través de agujeros en la capa de metal. El recubrimiento de la capa de hollín con el líquido fluorado es la alternativa más fácil y rápida, y requiere un mínimo de recursos, pero sólo el 40-50% de la (min máximo 20) fabricado trabajo sustratos - y el revestimiento no es uniforme. De hecho, la capa de hollín es muy frágil, y los líquidos viscosos fluorados daña fácilmente. Actualmente estamos trabajando en alternativas más robustas para proteger la capa de hollín, lo que aumentaría el tiempo de funcionamiento del dispositivo. Sin embargo, un aspecto importante es la adsorción de los contenidos de las gotitas a la superficie. Anteriormente, el 9 cuantificamos la cantidad de proteína que attdolía a la superficie durante el funcionamiento del dispositivo, y se encontró una correlación entre el movimiento continuo y la reducción de la adsorción superficial de la albúmina de suero bovino (BSA). No obstante, la contaminación biológica es un asunto complejo, y algunos autores incluso sugieren que podría ser imposible de suprimir por completo el efecto; en teoría, aunque sólo sea una sola proteína se adhiere a una superficie, más se sentirán atraídos por este sitio. De hecho, el tiempo de funcionamiento máxima reportada para los dispositivos de microfluidos digitales (por otros autores 6) era de unos 40 minutos. Por lo tanto, la solidez de la superficie es un punto de gran importancia y sigue siendo un trabajo en progreso.
Tenga en cuenta que, en electrohumectación, la aplicación de tensión a menudo se extiende la gota con los analitos en la superficie, dificultando el movimiento del todo, a menos que se utilizan aditivos. Sin embargo, algunos aditivos pueden ser tóxicos, o sólo pueden funcionar dentro de un rango de concentración de analito en la gota. Dispositivos Field-DW permiten el transporte de los analitos que van lado a otrom proteínas a las células individuales y organismos enteros, sin aditivos adicionales. Además, las características del dispositivo son en gran medida independiente de espesor, uniformidad y propiedades eléctricas de la capa de hollín (ver Freire et al. 9 para más información).
Por lo tanto, la importancia del método descrito aquí es que se amplía el alcance de las solicitudes de DMF, allanando el camino para el desarrollo de plataformas totalmente controlados lab-on-a-chip que trabajan en gran medida independiente de la química de las gotas.
Las dimensiones de electrodos superiores son compatibles con la resolución de la impresora, y no son exclusivos; electrodos más estrechos y más estrechos también podían trabajar. De hecho, otros métodos para la fabricación de placas de circuito impreso en la electrónica pueden ser utilizados también. Lo que importa es que la gotita se somete a un campo eléctrico no uniforme, y se moverá hacia la región donde el campo es más intenso. Sin embargo, se debe tener cuidadoen el diseño para mantener el campo eléctrico entre los electrodos energizados y flotantes por debajo de 3 MV / m para evitar chispas; aquí, el campo es de aproximadamente 1,7 MV / m, sin bordes afilados.
El funcionamiento de los circuitos electrónicos es la siguiente. Cada electrodo superior, a través de un contacto de relé, o bien se conecta a la salida de un amplificador de alto voltaje, o a un condensador (C), para minimizar el ruido eléctrico. El transistor T permite que la corriente baja, subcontratadas por la placa de control, a través de la resistencia R y el condensador C 1, para controlar la corriente más grande requerida para la bobina del relé para operar. El diodo D evita daños en los circuitos debido a la corriente variable en la bobina (véase la lista de materiales para la lista de componentes). Sólo una placa de control permite direccionamiento individual de todos los electrodos, y sólo se requiere una fuente de alimentación de alta tensión (Figura 2), que las tensiones de salida (8-18 kHz, 500 a 660 V RMS) después de amplificar la onda senoidal proporcionada por un generator. Tenga en cuenta que HV se mantiene lo más lejos posible del sistema de control, para minimizar el ruido y la posible mal funcionamiento del circuito.
Los ensayos que aquí se utilizan 4 mu l gotitas, simplemente debido al hecho de que las gotitas más pequeñas que contiene C. elegans son más difíciles de pipeta. El cultivo de C. elegans no se discutirá aquí, y el lector debe buscar los protocolos en otros lugares (por ejemplo., Brenner 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Damos las gracias a la Fundación Lindbäck de apoyo financiero, y el Dr. Alexander Sidorenko y Elza Chu para un debate fructífero y asistencia técnica, y el profesor Robert Smith para obtener ayuda con la C. ensayos elegans.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin candle | Any paraffin candle | ||
| Sputtering system | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| Teflon | Dupont | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating. |
| Graphic design software -Adobe Illustrator | Adobe Systems | Other softwares might be used as well. | |
| Copper laminate | Dupont | LF9110 | |
| Laser Printer | Xerox | Phaser 6360 or similar | Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) film | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 or similar | Large enough to allow the assemble of 10 drivers. |
| Universal circuit board | Allied Electronics | 70219535 or similar | |
| Connector | Allied Electronics | 5145154-8 or similar | |
| Control board and control program (LabView software) | National Instruments | NI-6229 or similar | |
| High-voltage amplifier | Trek | PZD700 | |
| Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V | Allied | 8817183 | |
| Transistor T, NPN | Allied | 9350289 | |
| Diode D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | Allied | 8862527 | |
| Visualization system | Edmund Optics | VZM 200i or similar | System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera. |
| Recorder | Sony | GV-D1000 NTSC or similar | It is connected to the camera by an S-video cable. |
| Simulations | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
References
- Fair, R. B. Digital microfluidics: is a true lab-on-a-chip possible. Microfluid Nanofluid. 3 (3), 245-281 (2007).
- Gupta, S., Alargova, R. G., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. On-Chip Dielectrophoretic Coassembly of Live Cells and Particles into Responsive Biomaterials. Langmuir. 26 (5), 3441-3452 (2009).
- Shih, S. C., et al. Dried blood spot analysis by digital microfluidics coupled to nanoelectrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 84 (8), 3731-3738 (2012).
- Gorbatsova, J., Borissova, M., Kaljurand, M. Electrowetting-on-dielectric actuation of droplets with capillary electrophoretic zones for off-line mass spectrometric analysis. J Chromatogr. 1234 (0), 9-15 (2012).
- Qin, J., Wheeler, A. R. Maze exploration and learning in C. elegans. Lab Chip. 7 (2), 186-192 (2007).
- Koc, Y., de Mello, A. J., McHale, G., Newton, M. I., Roach, P., Shirtcliffe, N. J. Nano-scale superhydrophobicity: suppression of protein adsorption and promotion of flow-induced detachment. Lab Chip. 8 (4), 582-586 (2008).
- Perry, G., Thomy, V., Das, M. R., Coffinier, Y., Boukherroub, R. Inhibiting protein biofouling using graphene oxide in droplet-based microfluidic microsystems. Lab Chip. 12 (9), 1601-1604 (2012).
- Kumari, N., Garimella, S. V. Electrowetting-Induced Dewetting Transitions on Superhydrophobic Surfaces. Langmuir. 27 (17), 10342-10346 (2011).
- Freire, S. L. S., Tanner, B. Additive-Free Digital Microfluidics. Langmuir. 29 (28), 9024-9030 (2013).
- Deng, X., Mammen, L., Butt, H. -J., Vollmer, D. Candle Soot as a Template for a Transparent Robust Superamphiphobic Coating. Science. 335, 67-70 (2011).
- Kang, K. H. How Electrostatic Fields Change Contact Angle in Electrowetting. Langmuir. 18 (26), 10318-10322 (2002).
- Abdelgawad, M., Watson, M. W. L., Young, E. W. K., Mudrik, J. M., Ungrin, M. D., Wheeler, A. R. Soft lithography: masters on demand. Lab Chip. 8 (8), 1379-1385 (2008).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8 (4), 519-526 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
