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Engineering

以减少液滴表面的相互作用来优化Bioanalytes运输中的数字微流体

doi: 10.3791/52091 Published: November 10, 2014

Introduction

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该液体的工作装置的小型化是非常重要的用于“芯片实验室”的平台的开发。在这个方向上,在过去二十年已经见证了在微流体领域的显著进展,具有各种应用。1-5用流体在封闭的通道(通道微流)的传输对比,DMF操纵上的电极阵列的微滴。其中,最有吸引力的这种技术的优点是没有可动部件运送流体,并且运动是通过关闭电信号即刻停止。

然而,雾滴的运动依赖于液滴内容,当然对于通用的“芯片实验室”的平台不希望的特性。含有蛋白质和其它分析物的微滴粘到设备的表面,成为不可移动。可以说,这一直是主要的限制为拓宽DMF的应用范围; 6-8替代方案,以尽量减少不希望的表面结垢涉及添加额外的化学物质,以液滴或它的周围,这有可能影响液滴的内容。

先前,我们小组开发出一种装置,以允许细胞和蛋白质在DMF中的传输,而无需额外的添加剂(现场DW的设备)。9这是通过基于蜡烛烟灰,10与设备的几何形状有利于液滴滚动表面相结合来实现并导致在熔滴上的向上的力,从而进一步降低液滴的表面相互作用。在这种方法中,液滴运动并不与表面润湿相关联。11

下面描述的详细方法的目标是产生一个微流体装置能够输送含有蛋白质,细胞和整个生物体的液滴,而无需额外的添加剂。在现场-DW设备铺平了道路液滴工作的化学家很大程度上独立完全控制平台RY。

在这里,我们还存在模拟表明,尽管所需的设备的操作的高电压,在整个液滴上的电压降是所施加的电压的一小部分,这表明在液滴内部bioanalytes的影响可以忽略。事实上,与秀丽隐杆线虫线虫 ),用于各种生物学研究线虫的初步试验,表明蠕虫游泳原状作为施加电压。

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Protocol

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注:在下面描述的步骤,实验室安全准则必须始终遵循。特别重要的是,当与高电压(> 500 V)和处理化学品处理的安全性。

1,涂料的导电性基板与蜡烛的烟灰

  1. 切割金属铜为矩形(75×43毫米,厚0.5毫米)。清洁浸没在铜蚀刻剂的铜基板为大约30秒,洗净用自来水进行约20秒,干燥的纸。
    注意:如果使用方法1以下,更改尺寸为75×25毫米到适合的机器。
  2. 扫铜衬底下的点燃石蜡蜡烛为30-45秒,以获得近似均匀的烟灰涂层(约40μm厚)。保持基板在约1cm焰内。请勿触摸脆弱的烟灰表面。

2.保护与涂层的烟灰层

注:烟灰层非常脆弱的,必须涂上保护层。两个简单的替代品(方法1和2所示)被认为在这里,但更可靠的协议,目前正在开发中。

  1. 方法1
    1. 加载样品放入金属蒸发或溅射系统。以下所述系统的操作过程,排空腔室,并且开始金受控沉积在烟灰层(150-200纳米)。让该装置冷却到室温。
    2. 浸涂金属化基片在一个1-十二硫醇溶液(1%体积/体积,在95%乙醇中,ACS / USP级),用于化学罩内10分钟。然后,拿着该设备以一定的角度接近60°,轻轻地用只有几个乙醇滴洗表面。让设备干燥过夜。
  2. 方法2
    1. 在化学罩,涂敷煤烟基板后立即和同时衬底仍从蜡烛火焰温,沉积氟化液体的一些液滴上的一侧基板上,并倾斜衬底的角度接近90°。存放更多的水滴,让他们滚在整个油烟面。
      注:当水滴落在一个点,烟灰会被冲离该区域。让的氟化液体扩散的液滴尽可能。
    2. 烘烤的热板上(160℃,15分钟)的化学罩内的衬底。
    3. 让基板放置过夜,在室温下在使用前。保存下去。

3.上电极的制作(从Abdelgawad 等人改编。12)

  1. 通过绘制图形设计软件的电极。每个电极为2毫米长,0.3毫米宽,与电极之间的间隙为0.3mm。触头(卡入连接器中,见下文)之间的间隙为2.3毫米( 图1)。
  2. 修剪灵活的铜层压板(35微米厚)为国君格式(3.87×7.5cm的英寸)。使用其他尺寸的我f相的打印机兼容。加载层压到一台彩色打印机的手动进纸托盘。
  3. 请务必使用“富黑”,或“登记黑”,在铜表打印时(见Abdelgawad 12查看详情),让黑色墨水的一层致密的铜基材上,蚀刻过程中保护印刷图案。让印刷基板完全干燥,过夜。
  4. 内部的化学罩,预热(40℃),用50ml的铜蚀刻液的烧杯中。浸在烧杯中的印刷层压板,并轻轻摇动它在溶液中约10分钟。刻蚀时间取决于铜蚀刻剂溶液中。每隔几分钟,检查腐蚀,看看图案是否完好。
  5. 小心地用水冲洗所述层压体,并用丙酮和乙醇中的化学引擎盖除去包衣。再次洗净,并轻轻擦干用纸巾层压板。
  6. 小心地连接层压用电极为GLASS滑动件(75×25毫米,约1毫米厚),用双面胶带。避免气穴。
  7. 附上氟烷的PFA薄膜,以使用磁带的电极。这用于防止电极与液滴的意外接触,从而损害顶电极由于短路。

4.电子接口(电路如图2)

  1. 焊接继电器和电容器C为通用电路板。
  2. 装配了10继电器驱动器的其余部分在一个无焊面包板的电子电路。
  3. 线各继电器驱动器的输入,以在所述控制板上的频道。
  4. 小心管理单元的顶部电极到一个连接器( 图3)。线的每个中继驱动器的输出到一个顶部电极,如该图所示。注意,有一对导线由继电器之间的接地连接器的接触,以最小化电噪声。
    注:该连接器位于一个可调节的平台来控制T ON他的顶部和底部(碳黑涂覆)衬底之间的距离(0.1-0.5毫米)。
  5. 使用程序来控制高电压(HV)的应用程序(约0.8秒),以4个电极在同一时间定时,移位1电极在运动( 方向为0.8秒时,致动1234,然后2345,3456 等。,0.8秒的每个组,然后向后,使液滴移动在相反的方向上也同样)。

5.滴可视化和处理

  1. 以记录液滴的运动,可以使用可视化系统,它是由一个24X的 - 96X放大率组件结合了CCD照相机。视频记录器连接到使用S视频相机。
  2. 吸管含C的 4微升滴线虫中的烟灰的基板的底部的介质。
  3. 使顶端电极,以-0.3毫米的液滴之上。液滴应当接近中间,只是在第五电极的下方,以便于操作。
  4. 把电子接口和高电压(500伏RMS)上,并调整顶部电极距离的液滴,直到它开始移动。不要让顶部电极接触到液滴。
  5. 通过记录响应于电脉冲在设备上成功液滴转移的次数采集数据。一个成功的实验的特征在于,至少700微滴转移, 也就是说 ,每一个电脉冲后一个传送。
  6. 连续地收集数据,直到微滴不响应再移动到5至10个脉冲。
    注意:当表面开始退化,运动可以通过使顶电极更接近液滴被恢复。

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Representative Results

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以前,我们已经使用现场DW的设备,以允许蛋白质在DMF中的运动。特别是,用牛血清白蛋白(BSA)的液滴可以在一个浓度2000倍高于先前报道的其他作者(无添加剂)移动。这是由于在液滴和表面之间的相互作用减小; 图4显示了含有荧光标记的牛血清白蛋白的液滴(见弗莱雷 9为在实验的详细信息)。在左侧的第一图为液滴坐在烟灰涂覆的表面;中间的一个,电场,其中,除了以产生液滴轧制,也适用于在熔滴上的向上的力,从而进一步降低与表面的相互作用的效果。注意剪切对比度(右)在DMF中使用的通用的替代,这是仅涂覆有氟化液(不含蜡烛烟灰)的表面上;与该表面的强相互作用,由下接触一个指示ngle,往往阻碍运动。

这里,我们用实验装置( 图3),以继续与这些设备的测试,现在输送含有较大生物液滴,蜗杆℃。线虫 ,在各种生物测定中所用的线虫。

液滴与蠕虫成功启动的油烟涂层的基材。特别是,电影1示出了一个微滴移动响应于每个电压脉冲(〜0.8秒的时间间隔)(注意该液体馏分,粘贴至无烟灰的地方,是出了液滴途径)。实验后检查发现,无病虫,杂物或液体残留物,被留在液滴途径的试验后,表示液滴与表面之间的互动减少。

电子接口( 图2)允许自动化和更好地控制运动的,因为电极组的同时致动( 图1中)增加向上的力,从而进一步降低与表面相互作用。

不同的实验已经表明,蠕虫游泳不受干扰的液滴移动时(20分钟,总的致动时间),这表明该高电压(〜500 V RMS)所需的设备操作不损害被运输的生物物种。这是支持的仿真,这表明,在整个液滴上的电压降是操作所需的( 图5,在一个点的平面的顶部和底部之间的电位差的电压的一个很小的部分(10 -6%)液滴的中间);事实上,在含有的Jurkat T细胞的液滴,由其他作者13完成先前的研究表明,这种最小的电压降不影响细胞活力,增殖和生物化学。为了进一步验证,但是,我们目前正处于设计实验的过程中,以评估长期影响在C中的电压的线虫 。对于此处所描述的模拟中,1〜2微升液滴被假定为PBS(磷酸盐缓冲盐水)中,坐在一个30微米厚的一层烟灰。顶部和底部电极被建模为铜,和所施加的电压等于500伏均方根 (详细的模拟,看弗莱雷9)。

图1
图1:图片的顶部电极 10中的每一个是长2毫米和0.3毫米宽。 2电极之间的间隙也是0.3mm时,与接触(底部)之间的间隙为2.3mm。

图2
图2:用于上电极控制系统的原理图,详细说明1 10继电器驱动器的每个顶部电极我š要么进行电压,或者连接到电容器。在右侧板与继电器的图片。需要注意的是操作所需的高电压被保持远离控制板(白坯)的左边。滴图(中)改编自弗莱雷等人的许可。9 ,请点击这里查看该图的放大版本。

图3
图3:查看的实验装置 。顶部和底部(碳黑涂覆)衬底之间的距离是可调的。从顶部电极接触件被卡入连接器。从继电器的导线(这里仅示出了图1中,10导线2和3)被焊接到所述连接器,通过在右边的图中所指示的。注意,有一接地的连接器的接触(例如 ,连接器触点2或4)对电线从继电器( 1或3),以减少电噪声,之间请点击这里查看该图的放大版本。

图4
图4:小滴(4微升)以将荧光标记的牛血清白蛋白(10克/升)左,坐在烟灰系基材;中间的电场的影响的一个是应用一个向上的力在熔滴上,进一步最小化与基板的相互作用;没错,液滴在表面涂上只与氟化液(无油烟)。改编自弗莱雷等人的许可。9

图5
-6%)。

电影1雾滴与C.线虫一个Field-DW的设备上,移动响应于每个电压脉冲(〜0.8秒的时间间隔)。在视频的左下方所示的液体馏分中没有液滴途径。

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Discussion

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该协议中最关键的步骤是保护的烟灰层的,可直接与在移动液滴的成功相关联。金属化的烟灰层(上述的方法1)允许接近制造成功的100%。然而,最大的操作时间约为10分钟;可能的话,微滴级分通过在所述金属层的孔润湿烟灰。涂烟灰层的氟化液是最简单和最快的替代,需要最少的资源,但只有40%-50%的基板制作工作(20分最高)的 - 和涂层不均匀。实际上,该烟灰层是非常脆弱的,而且在粘性液体氟化物容易损坏它。我们目前正在更健壮的替代品,以保护烟灰层,这会增加装置的操作时间。然而,一个重要的方面是微滴内容于表面的吸附。此前,9我们量化的蛋白质是ATT量设备操作期间疼到表面,和一个相关性持续运动和牛血清白蛋白(BSA)的降低的表面吸附之间找到。尽管如此,生物结垢是一个复杂的问题,并且一些作者甚至认为,这可能是不可能完全抑制的效果;在理论上,如果只有一个单一的蛋白质附着到一个表面上,更会被吸引到网站。实际上,报道了数字微流体装置的最大运行时间(由其他作者6)为约40分钟。因此,表面的坚固性是一个十分重要的问题,并仍在进行中的工作。

需要注意的是,在电润湿,施加电压经常散布液滴在表面上的分析物,完全阻碍运动,除非使用添加剂。但是,某些添加剂可以是有毒的,或可能只一个范围中的微滴被分析物浓度的范围内工作。现场-DW器件允许分析物的交通工具,包括来回米蛋白以单细胞和整个生物体,而无需额外的添加剂。此外,器件的特性在很大程度上是独立的厚度,均匀性,和烟灰层的电特性(见弗莱雷 9获得更多信息)。

因此,这里所描述的方法的意义在于,它扩大了对DMF中的应用程序的范围,为全控芯片实验室平台上工作的液滴化学很大程度上独立开发铺平了道路。

的顶部电极的尺寸是与打印机的分辨率相兼容,并且不是唯一的;窄和更密切的电极也可以正常工作。事实上,可以使用其它的方法用于印刷电路板的电子设备的制造。要紧的是,液滴受到非均匀的电场,这将对该区域移动,其中所述场是更强烈的。但是,应注意在设计中,以保持低于3 MV /米,以防止产生火花的通电和浮置电极间的电场;这里,该字段为约1.7 MV / m时,没有尖锐的边缘。

所述电子电路的操作如下。每个顶部电极,通过一个继电器触点,要么是连接到高电压放大器的输出端,或到一个电容器(C),以最小化电噪声。晶体管T允许低电流由控制电路板外包,通过电阻R和电容器C 1中 ,以控制所需的继电器线圈操作的较大的电流。二极管D防止电路损坏,由于在线圈中的可变电流(见材料清单组件的列表)。只有一个控制板允许单独解决所有的电极,并且只有一个高压电源是必须的( 图2),其放大由根儿提供的正弦波后的输出电压(8-18千赫,500-660 V RMS)员。需要注意的是HV保持远越好从控制系统,以减少噪声和可能的电路故障。

这里报道的实验中使用4微升滴,只是由于规模较小的飞沫含有C.事实线虫更难吸管。 C的培养线虫这里将不讨论,读者应该寻找其他的协议( 例如 ,布伦纳14)。

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Acknowledgments

我们感谢Lindback基金会的资金支持,而亚历山大西多连科医 ​​生和埃尔萨楚的富有成果的讨论和技术援助,以及罗伯特·史密斯教授的协助C.线虫检测。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraffin candle Any paraffin candle
Sputtering system Denton Vacuum, Moorestown, NJ Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target. 
1-dodecanethiol Sigma-Aldrich 471364
Teflon Dupont AF-1600
Fluorinert FC-40 Sigma-Aldrich F9755 Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating.
Graphic design software -Adobe Illustrator Adobe Systems Other softwares might be used as well.
Copper laminate Dupont LF9110
Laser Printer Xerox Phaser 6360 or similar Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text).
Copper Etchant Transene CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film McMaster-Carr 84955K22
Breadboard Allied Electronics 70012450 or similar Large enough to allow the assemble of 10 drivers.
Universal circuit board Allied Electronics 70219535 or similar
Connector Allied Electronics 5145154-8 or similar
Control board and control program (LabView software) National Instruments NI-6229 or similar
High-voltage amplifier Trek PZD700
Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V Allied  8817183
Transistor T, NPN Allied  9350289
Diode D, 1N4007 Allied  2660007
Relay  Allied  8862527
Visualization system Edmund Optics VZM 200i or similar System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder Sony GV-D1000 NTSC or similar It is connected to the camera by an S-video cable.
Simulations COMSOL Multiphysics V. 4.4

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References

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以减少液滴表面的相互作用来优化Bioanalytes运输中的数字微流体
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Freire, S. L. S., Thorne, N., Wutkowski, M., Dao, S. Taking Advantage of Reduced Droplet-surface Interaction to Optimize Transport of Bioanalytes in Digital Microfluidics. J. Vis. Exp. (93), e52091, doi:10.3791/52091 (2014).More

Freire, S. L. S., Thorne, N., Wutkowski, M., Dao, S. Taking Advantage of Reduced Droplet-surface Interaction to Optimize Transport of Bioanalytes in Digital Microfluidics. J. Vis. Exp. (93), e52091, doi:10.3791/52091 (2014).

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