Benytte seg av Redusert Droplet-overflaten Interaksjon å optimalisere transport av Bioanalytes i digitale Microfluidics

Introduction

Miniatyrisering av enheter som arbeider med væsker er av avgjørende betydning for utviklingen av "lab-on-a-chip" plattformer. I denne retningen, har de siste to tiårene vært vitne til en betydelig fremgang i feltet av MicroFluidics, med en rekke applikasjoner. ^1-5 kontrast med transport av væske i lukkede kanaler (kanal Microfluidics), manipulerer DMF dråper på matriser av elektroder. En av de mest attraktive fordeler ved denne teknikk er fraværet av bevegelige deler for å transportere fluider, og bevegelse er umiddelbart stoppet ved å slå av elektriske signaler.

Imidlertid er dråpe bevegelse avhengig av dråpe innholdet, sikkert en uønsket egenskap for en universell "lab-on-a-chip" plattform. Dråper som inneholder proteiner og andre analytter holde seg til enhets overflater, blir ubevegelig. Uten tvil, dette har vært den store begrensningen for å utvide omfanget av DMF programmer; ^6-8alternativer for å minimere den uønskede overflate begroing involverer tilsetning av ekstra kjemiske arter til dråpen eller dens omgivelser, som potensielt kan påvirke dråpe innhold.

Tidligere har utviklet vår gruppe en anordning for å tillate transport av celler og proteiner i DMF, uten bruk av ekstra tilsetningsstoffer (Felt DW-enheter). ^9. Dette ble oppnådd ved å kombinere en overflate basert på stearinlys sot, ¹⁰ med en enhet geometri som favoriserer dråpe rullende og fører til en oppadrettet kraft på dråpen, videre nedaddråpe-overflate interaksjon. I denne fremgangsmåten, blir dråpebevegelse ikke forbundet med overflatefuktning. ¹¹

Målet med den detaljerte metode som er beskrevet nedenfor, er å frembringe en anordning DMF stand til å transportere små dråper inneholdende proteiner, celler, og hele organismer, uten ekstra tilsetninger. The Field-DW enheter bane vei for fullt kontrollerte plattformer arbeider i stor grad uavhengig av dråpe kjemikerry.

Her har vi også tilstede simuleringer viser at, til tross for den høye spenning som kreves for drift av enheten, spenningsfallet over dråpe er en liten brøkdel av den påtrykte spenning, noe som indikerer neglisjerbare effekter på bioanalytes inne i dråpen. Faktisk foreløpige tester med Caenorhabditis elegans (C. elegans), en nematode som brukes for en rekke studier i biologi, viser at ormer svømme uforstyrret spenninger som er anvendt.

Protocol

MERK: I de prosedyrene som er beskrevet nedenfor, må retningslinjer laboratorium sikkerhet alltid følges. Av særlig betydning er sikkerheten når du arbeider med høyspenning (> 500 V) og håndtering av kjemikalier.

1. Coating av en ledende substrat med Candle Soot

1. Cut kobbermetall i rektangler (75 x 43 mm, 0,5 mm tykk). Rengjør hver kobber underlaget ved nedsenkning i kobber etsemiddel i ca 30 sek, vask med vann fra springen i ca 20 sek, og tørk med papir.
   MERK: Hvis du bruker metode 1 nedenfor, endre dimensjonene til 75 x 25 mm for å passe inn i maskinen.
2. Feie en tent parafin stearinlys under kobber substrat for 30 til 45 sek, for å oppnå en tilnærmet ensartet sot belegg (ca. 40 mikrometer tykk). Hold underlaget på ~ 1 cm inne i flammen. Ikke berør den skjøre sot overflaten.

2. Beskytte Soot Layer med Coating

MERK: sot laget er veldig skjør, Og må være belagt for beskyttelse. To enkle alternativer (metoder 1 og 2 nedenfor) er foreslått her, men mer robuste protokoller er for tiden under utvikling.

1. Metode 1
   1. Laste prøven inn i metallet fordamper eller sputtering system. Ved å følge de prosedyrer for operasjonen av systemet, å evakuere kammeret, og start kontrollert avsetning av gull på sot lag (150-200 nm). La enheten avkjøles til romtemperatur.
   2. Dip-coat metallisert substrat i en 1-dodecanethiol løsning (1% v / v, i 95% etanol, ACS / USP klasse), i 10 min inne i en kjemisk hette. Deretter holder enheten i en vinkel nær 60 °, forsiktig vaske overflaten med flere dråper av etanol bare. La enhetene tørr, over natten.
2. Metode 2
   1. I en kjemisk hette, umiddelbart etter belegning av substratet med sot, og mens substratet fremdeles er varmt fra flammen, deponere noen dråper av flytende fluorinert på den ene side avsubstrat, og vippe substratet til en vinkel nær 90 °. Deponere flere dråper, og la dem rulle over hele sot overflaten.
      MERK: Når dråpene faller på et sted, vil sot vaskes bort fra det området. La dråpene av flytende fluorinert spredning så mye som mulig.
   2. Bake substratet på en varmeplate (160 ° C i 15 min) på innsiden av en kjemisk hette.
   3. La substratet sitte over natten ved værelsetemperatur før bruk. Oppbevar på ubestemt tid.

3. Fabrikasjon av Topp Elektroder (Hentet fra Abdelgawad et al. ¹²⁾

1. Tegn elektrodene ved hjelp av grafisk design software. Hver elektrode er 2 mm lang, 0,3 mm bred, og avstanden mellom elektrodene er 0,3 mm. Gapet mellom kontakter (for å knipse i kontakten, se nedenfor) er 2,3 mm (figur 1).
2. Trim en fleksibel kobberlaminat (35 mikrometer tykk) i Monarch format (3,87 x 7,5 inches). Bruk andre størrelser if kompatibel med skriveren. Laste laminat i den manuelle mateskuffen på en fargeskriver.
3. Sørg for å bruke "rike svart", eller "registrering black", ved utskrift på kobber arket (se Abdelgawad et al. ¹² for detaljer) for å tillate en tettere lag med sort blekk på kobber underlaget, beskytte trykt mønster under etsing . La den trykte underlaget tørke helt, over natten.
4. Inne i en kjemisk hette, varm opp (40 ° C) et beger med 50 ml av kobber ets. Dypp den trykte laminat i begeret, og rist den i løsningen i ca 10 min. Etsing Tiden avhenger av kobberetseløsningen. Hvert par minutter, sjekk korrosjon og se om mønsteret er intakt.
5. Vask nøye laminat med vann, og fjern belegget med aceton og etanol i den kjemiske hette. Vask en gang, og forsiktig tørke laminatet med papirhåndkle.
6. Feste laminat nøye med elektroder til en glass sleiden (75 x 25 mm, ~ 1 mm tykk), ved hjelp av dobbeltsidig tape. Unngå luftlommer.
7. Fest en film av perfluoralkoksy PFA til elektrodene som bruker tape. Dette tjener til å hindre utilsiktet kontakt mellom elektrodene med dråpen, som skader topp elektroder på grunn av kortslutning.

4. Elektronisk Interface (Circuit i figur 2)

1. Lodd releer og kondensatorer C til en universell kretskort.
2. Monter resten av de 10 stafett drivere på en loddefritt koblingsbrett for elektroniske kretser.
3. Wire hvert relé førerens input til en kanal i kontrollkortet.
4. Nøye knipse de beste elektroder inn i en kontakt (figur 3). Wire hvert relé fører utgang til en øvre elektrode, slik som vist i figuren. Legg merke til at det er en jordet kontakt kontakt mellom et par av ledninger fra releer, for å minimalisere elektrisk støy.
   MERK: Kontakten sitter på en justerbar plattform for å kontrollere than avstand (0,1-0,5 mm) mellom topp og bunn (sot-belagt) substrat.
5. Bruke et program for å styre timing for høyspenning (HV) anvendelse (ca. 0,8 sek) til fire elektroder på samme tid, skiftende en elektrode i bevegelsesretningen (dvs. i 0,8 sekund, aktueres 1234, da 2345, 3456, etc ., 0,8 sek for hver gruppe, og så bakover, så dråpe beveger seg i motsatt retning i tillegg).

5. Droplet visualisering og håndtering

1. For å ta opp dråpe bevegelse, bruke visualiseringssystemet, som består av en 24X - 96 X forstørrelse montering kombinert med en CCD-kamera. Koble videospilleren til kameraet med S-video.
2. Pipette en 4 pl dråpe inneholder C. elegans i media på bunnen av sot-belagte substrat.
3. Ta med de beste elektroder til ~ 0,3 mm over dråpen. Dråpen bør være nær midten, rett under den femte elektrode, for enklere bruk.
4. Slå på elektronisk grensesnitt og høy spenning (500 V _RMS), og justere den øverste elektrodeavstand til dråpen før det begynner å bevege seg. Ikke la de beste elektroder berøre dråpen.
5. Samle inn data ved å registrere antall vellykkede dråpe overføringer på enheten i respons til elektriske pulser. En vellykket eksperiment er karakterisert ved minst 700 dråpetransport, dvs. en overføring etter hver elektrisk puls.
6. Samle inn data kontinuerlig, inntil dråpen ikke beveger seg lenger i respons til 5 til 10 pulser.
   MERK: Når overflaten begynner å bli dårligere, kan bevegelse gjenopprettes ved å bringe de beste elektroder nærmere dråpen.

Representative Results

Tidligere har vi brukt Feltet DW-enhetene for å tillate bevegelse av proteiner i DMF. Spesielt kan små dråper med bovint serumalbumin (BSA) beveges ved en konsentrasjon 2000 ganger høyere enn tidligere rapportert av andre forfattere (uten tilsetningsstoffer). Dette var på grunn av redusert samhandling mellom dråpen og overflate Figur 4 viser en liten dråpe som inneholder fluorescently-merket BSA (se Freire m.fl. ⁹ for mer informasjon om eksperimentene.). Det første bildet til venstre viser dråpen sitter på sot-belagt overflate; den midterste, effekten av elektriske felt, som i tillegg til å produsere dråpe rullende, gjelder også en oppadrettet kraft på dråpen, noe som ytterligere reduserer interaksjon med overflaten. Legg merke til at skjær kontrast (til høyre) til en felles alternativt anvendes i DMF, som er en overflate belagt bare med flytende fluorinert (uten stearinlys sot); den sterke interaksjon med overflaten, indikert ved den nedre kontakt enngle, hindrer ganske ofte bevegelse.

Her bruker vi den eksperimentelle oppsett (figur 3) for å fortsette forsøkene med disse enhetene, nå transportere dråper som inneholder større organismer, ormen C. elegans, en nematode anvendes i en rekke biologiske analyser.

Dråper med ormer ble vellykket aktivert på sot-belagte underlag. Spesielt Movie 1 viser en dråpe beveger seg i respons til hver spenningspuls (~ 0,8 sek intervall) (merk at den flytende fraksjonen, stakk til et sted uten sot, er ute av dråpeveien). Inspeksjon etter forsøkene viste at ingen ormer, rusk, eller væskerester, ble igjen på dråper trasé etter forsøkene, noe som indikerer redusert samhandling mellom dråpen og overflate.

Den elektronisk grensesnitt (figur 2) tillater automatisering og bedre kontroll av bevegelse, siden simultan aktivering av grupper av elektroder (Figur 1) Øker den oppadrettede kraft, som ytterligere reduserer interaksjon med overflaten.

Forskjellige forsøk har vist at ormer svømme uforstyrret som dråpe beveger seg (20 min samlet tid) aktuering, som indikerer at den høye spenning (~ 500 _V rms) som kreves for drift enheten ikke er skadelig for de biologiske arter som transporteres. Dette støttes av simuleringer, som har vist at spenningsfallet over dråpe er en ubetydelig fraksjon (10 ^-6%) av den spenning som kreves for drift (figur 5, potensialforskjellen mellom et punkt på toppen og bunnen av flyet i midten av dråpe); faktisk, i dråper som inneholder Jurkat T-celler, tidligere studier gjort av andre forfattere ¹³ tyder på at slike minimal spenningsfall ikke påvirker celle levedyktighet, spredning, og biokjemi. For ytterligere validering, men vi er nå i ferd med å utforme eksperimenter for å vurdere langsiktige effekterav spenningen på C. elegans. For de simuleringer som er beskrevet her, ble et ~ 2 ul dråpe antas å være av PBS (fosfatbuffersaltløsning), som sitter på en 30 um tykt lag av sot. Topp- og bunn elektroder ble modellert som kobber, og spenningen lik 500 V _RMS (For detaljer om simuleringene, se Freire et al. ^9).

Fig. 1: Bilde av toppelektroder Hver og en av de 10 er 2 mm lang og 0,3 mm bred. Gapet mellom to elektroder er også 0,3 mm, og avstanden mellom kontaktene (bunn) er 2,3 mm.

Figur 2:. Skjematisk av den kontrollerende system for toppelektroder, detaljering en av de 10 stafett drivere Hver topp elektrode is enten utsatt for spenning, eller koblet til en kondensator. Til høyre et bilde av styret med stafetter. Legg merke til at den høye spenningen som kreves for drift holdes borte fra styrekortet (hvit base) til venstre. Dråpe diagram (midt) tilpasset med tillatelse fra Freire et al. ⁹ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Utsikt over eksperimentelle oppsettet. Avstanden mellom toppen og bunnen (sot-belagt) substrat er justerbar. Kontaktene fra topp elektrodene er knipset inn i en kontakt. Ledningene fra releene (her vist bare 1, 2 og 3 av de 10 tråder) er loddet til kontakten, som antydet ved diagrammet på høyre side. Merk at det er en jordet kontakt kontakt (f.eks kontakt kontakter 2 eller 4) mellom et par ledninger fra releer (f.eks 1 eller 3), for å minimere elektrisk støy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 4: Dråper (4 mL) med fluorescens-merket BSA (10 g / L) Venstre, sitter på en sot-basert substrat; midten, er en av virkningene av det elektriske felt å påføre en oppadrettet kraft på dråpen, ytterligere å minimere interaksjonen med substratet; høyre, dråpe på en overflate belagt bare med fluorerte flytende (ingen sot). Tilpasset med tillatelse fra Freire et al. ⁹

-6%) av den nødvendige spenning for driften.

Movie 1 . Droplet med C. elegans på et felt-DW-enhet, beveger seg som reaksjon på hver spenningspuls (~ 0,8 sek intervall). Den flytende fraksjonen vises nederst til venstre i videoen er ikke i dråpeveien.

Discussion

Den mest kritiske trinn i protokollen er beskyttelsen av sot lag, direkte forbundet med suksess i å bevege seg dråper. Metallisering av sot laget (metode 1 ovenfor) gjør det mulig nær 100% av fabrikasjons suksess. Imidlertid er den maksimale driftstiden ca 10 min; eventuelt, er dråpefraksjoner fukte soten gjennom hull i metallaget. Belegging av sot sjikt med den fluorerte væske er den enkleste og raskeste alternativ, og krever et minimum av ressurser, men bare 40-50% av det fabrikkerte substrater arbeids (20 min maksimum) - og belegget er ikke ensartet. Faktisk er det sot laget svært skjøre, og de viskøse fluor flytende lett skader det. Vi jobber for tiden med mer robuste alternativer for å beskytte sot laget, som vil øke driftstiden for enheten. Det er imidlertid et viktig aspekt adsorpsjon av dråpe innholdet til overflaten. Tidligere ⁹ vi kvantifisert mengden av protein som attverket til overflaten under drift av enheten, og en korrelasjon ble funnet mellom fortsatte bevegelse og redusert overflate adsorpsjon av bovint serumalbumin (BSA). Uten hensyn, er biobegroing en kompleks sak, og noen forfattere selv tyder på at det kan være umulig å fullstendig undertrykke effekten; i teorien, hvis bare et enkelt protein festes til en overflate, flere vil bli tiltrukket av dette nettstedet. Faktisk er den maksimale driftstid rapportert for digitale microfluidic enheter (av andre forfattere ⁶⁾ var ca 40 minutter. Derfor er robustheten i overflaten et poeng av stor betydning, og fremdeles et arbeid som pågår.

Merk at, i electrowetting, påføring av spenning ofte sprer dråpe med analyttene på overflaten, helt hindrer bevegelse, med mindre additiver anvendes. Imidlertid kan noen additiver være giftig, eller kan bare arbeide innenfor et område av analyttkonsentrasjon i dråpen. Feltet-DW enheter tillate transport av analytter spenner from proteiner til enkeltceller og hele organismer, uten ekstra tilsetninger. I tillegg maskinkjennetegn er i stor grad uavhengig av tykkelse, ensartethet, og elektriske egenskapene til sot lag (se Freire et al. ⁹ for mer informasjon).

Derfor betydningen av metoden beskrevet her er at det utvider omfanget av søknader om DMF, banet vei for utvikling av fullt kontrollerte lab-on-a-chip plattformer arbeider i stor grad uavhengig av dråpe kjemi.

Dimensjonene av topp elektroder er kompatible med oppløsning på skriveren, og er ikke unikt; smalere og tettere elektroder kan også fungere. Faktisk kan andre metoder for fremstilling av trykte kretskort i elektronikk kan brukes i tillegg. Det avgjørende er at dråpen blir utsatt for en ikke-uniformt elektrisk felt, og det vil bevege seg mot det område hvor feltet er mer intens. Imidlertid bør man være forsiktigi design for å holde det elektriske feltet mellom strømførende og flytende elektroder under 3 MV / m for å unngå gnistdannelse; her er feltet om lag 1,7 MV / m, uten skarpe kanter.

Virkemåten av de elektroniske kretsene er som følger. Hver toppelektrode, gjennom en relékontakt, blir enten koblet til utgangen av en høy spenningsforsterker, eller til en kondensator (C), for å minimalisere elektrisk støy. Transistoren T gjør det mulig for lav strøm satt ut av kontrollbordet, gjennom motstanden R og kondensatoren C _1, for å kontrollere den større strøm som kreves for reléspolen å operere. Dioden D forhindrer krets skade på grunn av variabel strøm i spolen (se liste materialer for liste over komponenter). Bare én styrekortet tillater individuell adressering av alle elektrodene, og bare ett HV strømforsyning er nødvendig (figur 2), som utgangsspenninger (8-18 kHz, 500 til 660 V _rms) etter amplifisering av sinusbølgen levert av en Generator. Merk at HV holdes så langt unna som mulig fra styresystemet, for å redusere støy og mulig feil krets.

De analyser som er rapportert her brukt 4 ul dråper, ganske enkelt på grunn av det faktum at mindre dråper inneholdende C. elegans er vanskeligere å pipette. Den kultur av C. elegans vil ikke bli diskutert her, og leseren bør se etter protokollene andre steder (f.eks., Brenner ^14).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin candle			Any paraffin candle
Sputtering system	Denton Vacuum, Moorestown, NJ		Sputter coater Desk V HP equipped with an Au target.
1-dodecanethiol	Sigma-Aldrich	471364
Teflon	Dupont	AF-1600
Fluorinert FC-40	Sigma-Aldrich	F9755	Fluorinated liquid: Prepare Teflon-AF resin in Fluorinert FC-40, 1:100 (w/w), to create the hydrophobic coating.
Graphic design software -Adobe Illustrator	Adobe Systems		Other softwares might be used as well.
Copper laminate	Dupont	LF9110
Laser Printer	Xerox	Phaser 6360 or similar	Check for the compatibility with "rich black" or "registration black" (see text).
Copper Etchant	Transene	CE-100
Perfluoroalkoxy (PFA) film	McMaster-Carr	84955K22
Breadboard	Allied Electronics	70012450 or similar	Large enough to allow the assemble of 10 drivers.
Universal circuit board	Allied Electronics	70219535 or similar
Connector	Allied Electronics	5145154-8 or similar
Control board and control program (LabView software)	National Instruments	NI-6229 or similar
High-voltage amplifier	Trek	PZD700
Capacitors C and C1, 100 nF, 60 V	Allied	8817183
Transistor T, NPN	Allied	9350289
Diode D, 1N4007	Allied	2660007
Relay	Allied	8862527
Visualization system	Edmund Optics	VZM 200i or similar	System magnification 24X – 96X. It is combined with a Hitachi KP-D20B 1/2 in CCD Color Camera.
Recorder	Sony	GV-D1000 NTSC or similar	It is connected to the camera by an S-video cable.
Simulations	COMSOL Multiphysics	V. 4.4