Protocol
참고 : 설명 실험 프로토콜 여기에 중서부 대학에서 실시 중서부 대학 IACUC에 의해 승인되었다.
1. 룸 요구 사항
- 뜨겁고 차가운 수돗물을 실행했다 절차 방 바닥에, 탱크로부터 통상 드레인 물을 제거하는 방법을 확보.
- 다이빙 탱크를 배치에 대한 연구 테이블을 사용합니다. 바닥 배수구가있는 방은 일반적으로 배수 윤곽 때문에, 고무 마개를 줄이고 탱크의 테이블 탑, 따라서 물 표면, 레벨이 있는지 확인하기 위해 테이블 다리 아래에 배치합니다.
2. 다이빙 탱크
- 다이빙 탱크 건설
- 측벽 (그림 1)에 대한 플렉시 유리의 하단 1/2 두꺼운 플렉시 글라스에 3/4를 사용하여 직사각형 탱크 (100 X 60 X 15cm)를 구축합니다. 영구 함께 시아 노 아크릴 레이트 또는 시멘트를 사용 solven 탱크의 외부 플렉시 편 부착이러한 트리클로로 메탄 등의 TS.
- 85 X 15cm 조각으로 잘라 제거 1/2 인치 두께의 플렉시 글라스를 사용하여 5 채널의 길이가 각각 약 100cm,에 탱크를 나눈다. 영구적으로 바닥에 홈과이 채널 디바이더가 위치로 슬롯 될 수있는 탱크의 모서리를 배치합니다.
- 수중 다이빙 "터널"지붕 "을 만들기 위해 채널 디바이더에서 수평 플렉시 유리 조각을 일시 중단합니다.
- 쥐에 대한 이동식 제기 플랫폼, "마침 영역은"물 밖으로 끌어 수영과 다이빙 시험 사이 휴식 탱크 장소의 한 구석에서. 쥐들이 항상 신랑 동안 마무리 영역에서 그들의 모피에서 물을 제거합니다. 쥐가 교육 시험의 플랫폼에 남아 보장 마침 영역의 가장자리 주위에 키가 큰 측면을 놓습니다.
- 마침 지역에서 탱크의 반대편 모서리에서 만 미로 수중 액세스 할 수있는 챔버를 배치합니다. 이것은 제거 "를 시작합니다정말이에요 "만 다이빙 시험에 사용됩니다.
참고 : 시작 챔버 내의 플랫폼에 앉아있는 쥐가 물에 내려 다이빙 재판의 시작 부분에서; 따라서이 플랫폼은 "엘리베이터"라고합니다.
참고 : 시작 영역, 마무리 지역, 모든 채널 디바이더가 탱크에서 제거 가능한 모듈 형 디자인을 사용합니다. 1) 충전 및 모든 채널 칸막이 제거 후 물 탱크를 비우는 촉진하고, 쥐가 혼동됩니다 경우 특히 수중 동안 2), 조각 빠르게에서 쥐를 구출하기 위해 분해 될 수있다 : 이것은 두 가지 이유로 이루어집니다 물.
- 작성 및 물 탱크를 비우는
- 물 탱크 채우기
- 각 교육 세션의 시작 부분에서, 약 12 cm의 깊이에 신선한 32 ° C의 수돗물 탱크를 채우십시오. 따뜻하거나 시원한 포켓을 최소화하기 위해 탱크 내의 물을 교반 하였다.
참고 : 일반적으로는 12 쥐를 훈련하는 데 약 2 시간이 걸립니다. 이 시간 동안물 온도는 약 4 ° C 씩 감소합니다. 훈련의 말에 물이 약 28 ° C로 냉각시킨다. 30 ° C의 물이 아니라, 실온 이하의 물이 온수를 사용하여, 쥐 thermoneutral 때문에, 반복적 인 트레이닝 동안 열 손실을 최소화한다.
- 각 교육 세션의 시작 부분에서, 약 12 cm의 깊이에 신선한 32 ° C의 수돗물 탱크를 채우십시오. 따뜻하거나 시원한 포켓을 최소화하기 위해 탱크 내의 물을 교반 하였다.
- 물 탱크를 비우기
- 각 훈련 세션의 끝에서, 예컨대 1 인치 내경 튜빙 4m 긴 조각으로, 큰 호스를 사용하여 탱크로부터 물을 배출. 완전히 공기 주머니가 튜브에 없는지 확인, 탱크에서 튜브를 잠수함. 빠르게 바닥 드레인으로 튜브의 한쪽 끝을 배치합니다. 생성 된 사이펀 효과 탱크로부터 물을 배출한다.
- 물 표면 아래 튜브 탱크 단부를 유지하는 것이 사이 폰을 유지할 수 있지만, 물의 완전 배수를 용이하게하도록 모서리 탱크 팁.
참고 : 또는 오히려 빨아보다, 탱크의 바닥 근처에 탭을 설치하고 연결탱크에서 호스가 바닥 드레인 누릅니다.
- 물 탱크 채우기
3. 쥐 알레르기 고려 사항
- 취급 및 쥐를 훈련 할 때마다 일회용 장갑을 착용 할 것. 장갑은 변함없이 쥐의 소변을 포함 탱크에있는 물과의 접촉을 제한합니다.
참고 : 쥐가 훈련 도중 물기가되며, 객실은 "습식 쥐"냄새로 가득합니다. 따라서 항히스타민 예방 정권 방지하거나 래트 알레르기 효과를 제한 할 수있다. 그들은 쥐의 알레르기 유발 물질에 민감하게해야 트레이너 또한, 일회용 먼지 마스크, 또는 N95 마스크를 착용해야 할 수도 있습니다.
4. 수영 교육
- 매일 수영 훈련
참고 : 개인의 경험은 젊은 쥐가 더 빨리 미로를 배우고, 따라서 성인 쥐를 사용하는 것이 바람직하다 35g 새로 이유 쥐와 훈련을 시작하는 것을 나타냅니다.- 물 탱크를 채우십시오. 2.2.1를 참조하십시오.
- 삽입 마무리지역 및 채널 디바이더 5 수영 채널을 만들 수 있습니다.
- 첫 번째 훈련 세션 동안 부드럽게 마무리 영역에서 3-5cm에 대해 물에 손으로 쥐를 내립니다.
주 : 먼저 부동의 감각 발생으로 물 쥐에 소개 된이 불안정 나타납니다시. 결국 인근 마무리 영역에 도달, 물을 종료 할 수있는 방법을 찾을 동안 쥐가 조정되지 않은 방식에 대한 노를 저어됩니다. 때문에 수영을 자신의 타고난 능력을, 이후의 실험에서 쥐가 마무리 영역을 향해 훨씬 더 통합 된 방식으로 수영을합니다.
참고 : 그들의 발을 연구자의 손에 위치하도록 아래에서 쥐를 지원합니다. 조심스럽게 물에 쥐를 내려하고 오히려 물에 그들을 삭제하기보다, 손에서 멀리 수영 할 수 있습니다. - 시험 사이에 쥐가 적어도 1 분 동안 마무리 영역에 남아 보자. 이것은 그들이 "안전한"장소로 마무리 영역을 주시도록, 쥐 신랑 탐험 할 수 있도록하는 것입니다시험 사이에 이동합니다. 이것은 다음 시험을 시작 다시 물에의 위치를 바로 바로 시험을 완료 쥐를 잡아와 대조적이다.
NOTE : 뇌 보상 회로의 활성화를 방지하도록, 훈련 동안 외부 보상 (즉, 식품)을 사용하지 않는다. - 마침 지역의 대기 시간 후, 부드럽게 다음 시험을 시작하기 전에 1 분 동안 쥐를 개최합니다. 조심스럽게 아주 젖지 쥐의 원인이됩니다 물에 반복적 인 항목부터이 재판 전 대기하는 동안 수건으로 쥐를 건조하고,이를 건조하는 것은 저체온증을 방지 할 수 있습니다.
- 4.1.3를 반복합니다. 4.1.5을 통해. 각 쥐가 매일 수영 훈련 기간 동안 훈련을 위해 3 ~ 5 시험을 완료합니다.
- 모든 채널 칸막이를 제거하고 탱크에서 영역을 마무리합니다.
- 탱크에서 물을 비 웁니다. 2.2.2를 참조하십시오.
- 주간 수영 훈련 일정
- 행동 매일 훈련 (4.1을 참조하십시오.) 주 5 일, 이상적으로 동시에매일.
- 성공적으로 전날 협상의 거리에서 첫 번째 재판을 시작합니다. 증가 거리에서 두 번째와 세 번째 실험을 시작합니다.
- 각각의 후속 매일 훈련으로 래트 물 및 마무리 영역에 배치되는 위치 사이의 거리를 증가시킨다. 처음 몇 훈련 세션에 대한 5~10cm로이 거리를 증가. 쥐가 수영 더 편안 표시 한 후 30~50cm하여 거리를 증가시킨다.
- 쥐 수영 채널의 직선 부분을 수영을 배우는 동안 수영 거리에서 더 큰 증가를 사용합니다. 반면, 머리핀 수영 학습 2-3 트레이닝 세션이 걸릴 수 있습니다 채널간에집니다.
참고 : 종종, 마무리 지역에서 기다리는 동안, 쥐가 수영 할 수있는 물을 다시 입력합니다 및 / 또는 아직 마무리 영역 플랫폼에 앉아있는 동안 그들의 머리 수중 잠수함. - 전체 5 채널을 성공적으로 수영을 보장하기 위해 3 주 이상이 매일 훈련 프로토콜을 반복합니다.이 반복적 인 트레이닝 프로토콜 미로 좌우 헤어핀 턴 교번 포함 특히 이후 미로의 성공적인 완료를 보장한다.
5. 다이빙 교육
참고 : 쥐가 성공적으로 미로를 통해 수영 협상을 배운 후가 다이빙 훈련을 시작할 수 있습니다.
- 초기 다이빙 훈련 (첫날)
- 시작 챔버를 삽입합니다. 물 탱크 채우기 (2.2.1를 참조하십시오.). 확인 수위는 시작 영역 오프닝 아래 1cm입니다.
- 마무리 영역을 삽입하고 채널 디바이더 5 수영 채널을 만들 수 있습니다.
- 첫 번째 다이빙 세션 동안 쥐가 시작 챔버 내의 물에 엘리베이터를 내릴 수 훈련. 미로에 대한 액세스는 시작 챔버의 바닥으로부터이다. 쥐 쉽게 미로에 시작 챔버에서 수영을 할 수 있도록이 첫 번째 세션 동안 물 수준은 충분히 낮다. 쥐가 미로를 통해 수영을 계속 할 수 있도록 허용마침 지역.
- 시험 사이에 쥐가 적어도 1 분 동안 마무리 영역에 남아 보자.
NOTE : 뇌 보상 회로의 활성화를 방지하도록, 훈련 동안 외부 보상 (즉, 식품)을 사용하지 않는다. - 마침 지역의 대기 시간 후, 부드럽게 다음 시험을 시작하기 전에 1 분 동안 쥐를 개최합니다. 조심스럽게이 재판 전 대기하는 동안 수건으로 쥐를 건조.
- 5.1.3를 반복합니다. 5.1.5을 통해. 각각의 쥐이 초기 다이빙 훈련 세션 동안 훈련을 위해 3 시험을 완료합니다.
- 모든 채널 디바이더를 제거 챔버를 시작하고 탱크에서 영역을 마무리합니다.
- 탱크에서 물을 비 웁니다. 2.2.2를 참조하십시오.
- 초기 다이빙 훈련 (둘째 날)
- 시작 챔버를 삽입합니다. 물 탱크 채우기 (2.2.1를 참조하십시오.). 수위가 약간 개시 영역 개구 위에 확인.
- 마무리 영역을 삽입하고 채널 디바이더 5 수영 채널을 만들 수 있습니다.
- 두 번째 잠수 중그 쥐가 미로를 입력하기 시작 챔버의 가장자리에서 머리를 찍어이 시작 챔버를 종료 할 수 있도록 훈련 수위가 제기되고있다. 쥐의 첫 번째 다이빙으로 이것을 고려하십시오. 쥐가 다음 마침 지역에 미로를 통해 수영을 계속하도록 허용합니다.
- 쥐 실험 사이에 최소 1 분 동안 마무리 영역에 남아 보자.
NOTE : 뇌 보상 회로의 활성화를 방지하도록, 훈련 동안 외부 보상 (즉, 식품)을 사용하지 않는다. - 마침 지역의 대기 시간 후, 부드럽게 다음 시험을 시작하기 전에 1 분 동안 쥐를 개최합니다. 조심스럽게이 재판 전 대기하는 동안 수건으로 쥐를 건조.
- 5.2.3를 반복합니다. 5.2.5을 통해. 각각의 쥐이 다이빙 훈련 중 훈련을위한 3 시험을 완료합니다.
- 모든 채널 디바이더를 제거 챔버를 시작하고 탱크에서 영역을 마무리합니다.
- 탱크에서 물을 비 웁니다. 2.2.2를 참조하십시오.
- 초기 다이빙 훈련 (THIRD 일)
- 시작 챔버를 삽입합니다. 수위가 시작 영역으로 개방 이상 보장, 물 (2.2.1를 참조하십시오.)와 탱크를 채우십시오.
- 마무리 영역을 삽입하고 채널 디바이더 5 수영 채널을 만들 수 있습니다. 바로 5cm 길이 다이빙 터널을 만들 수있는 시작 영역 밖에 플렉시 글라스의 수평 조각을 놓습니다.
- 세 번째 다이빙 훈련 세션 동안 쥐가 시작 챔버의 가장자리 아래에 머리를 담그고 수영 채널의 오픈 워터에 도달 수중 5cm 수영을합니다. 쥐가 다음 마침 지역에 미로를 통해 수영을 계속하도록 허용합니다.
참고 : 시작 영역에 배치되면, 쥐가 자신의 수중 침수를 시작하고, 따라서 이들은 "자발적"다이빙으로 간주됩니다. - 쥐 실험 사이에 최소 1 분 동안 마무리 영역에 남아 보자.
NOTE : 뇌 보상 회로의 활성화를 방지하도록, 훈련 동안 외부 보상 (즉, 식품)을 사용하지 않는다. - 마침 지역의 대기 시간 후, 부드럽게 다음 시험을 시작하기 전에 1 분 동안 쥐를 개최합니다. 조심스럽게이 재판 전 대기하는 동안 수건으로 쥐를 건조.
- 5.3.3를 반복합니다. 5.3.5을 통해. 각각의 쥐이 다이빙 훈련 중 훈련을 위해 3 ~ 5 시험을 완료합니다.
- 모든 채널 디바이더를 제거 챔버를 시작하고 탱크에서 영역을 마무리합니다.
- 탱크에서 물을 비 웁니다. 2.2.2를 참조하십시오.
- 주간 다이빙 훈련 일정
- 실시 매일 훈련 세션 (5.3을 참조하십시오.) 오일을 일주일에 이상적으로 같은 시간에 매일.
- 성공적으로 전날 협상의 거리에서 첫 번째 재판을 시작합니다. 증가 다이빙 거리 두 번째 및 세 번째 실험을 시작한다.
- 각각의 후속 매일 훈련으로 래트 수중 수영해야 할 거리를 확장하기위한 추가 수평 분배기를 추가하여 잠수 터널의 길이를 증가시킨다. 처음 몇 훈련 증가 티를 들어5~10cm로의 거리. 쥐 다이빙 더 편안 표시 한 후 30~50cm하여 거리를 증가시킨다.
참고 : 연속 시험시 시도 다이빙 거리를 잦은하지 마십시오. 필요한 경우, 더 짧은 다이브 거리를 제공하기 위해 수평 채널 커버의 단부를 올려. 다이빙 재판 중에 쥐 다이빙 터널의 끝에 도달하고 신속하게, 주변에 수중 켜 채널 덮개의 끝을 들어 올려 쥐 표면과 그의 수영을 계속 할 수 있도록 시작하지 않습니다. 이것이 성공적으로 긴 거리를 잠수 완료 쥐있게된다. 이 긍정적 인 강화는 각 다이빙 시험과 수중 터널을 통해 앞으로 이동 쥐를 유지합니다. - 쥐 수영 채널의 직선 부분을 다이빙을 배우고있는 동안 다이빙 거리에서 더 큰 증가를 사용합니다. 반면, 머리핀 주위에 다이빙을 배우는 것은 2 ~ 3 훈련이 걸릴 수 있습니다 채널간에집니다.
참고 : 마무리 영역에서 기다리는 동안 종종, 쥐 일 다시 입력합니다아직 마무리 영역 플랫폼에 앉아있는 동안 전자 물은 수영, 및 / 또는 그들의 머리 수중 잠수함합니다. - 전체 5 채널의 성공적인 다이빙을 보장하기 위해 3 주 이상이 매일 훈련 프로토콜을 반복합니다. 이 반복적 인 트레이닝 프로토콜 미로 좌우 헤어핀 턴 교번 포함 특히 이후 미로의 성공적인 완료를 보장한다.
NOTE : 전체 6주 수영 및 잠수 훈련 일정은 300g의 체중에 도달하는 35g 새롭게 이유 된 쥐의 성장과 일치한다. - 매일 훈련을 완료하고, 쥐가 자신의 홈 케이지에 반환 된 후, 쥐가 빨리 정리를 통해 자신의 모피를 건조 보장, 또는 필요한 경우, 그들의 모피가 건조 될 때까지 따뜻한 쥐를 유지하기 위해 자신의 케이지에서 가열 패드를 놓습니다.
6. 실험 유사
NOTE : 기초 실험 장치와 동물 훈련 상술되었다. 그러나, 행동 훈련 만 홍보관심있는 데이터를 수집하기 위해 다른 실험 기법을 사용하는 모델을 ovides. 기본 프로토콜은 다이빙 응답의 특정 측면을 조사하기 위해 수정됩니다. 이러한 수정의 예로, 이러한 생리적, 신경 해부학 적 기술을 사용하여 데이터의 수집에 대한 몇 가지 고려 사항은 다음과 같습니다.
- 이식 할 수있는 텔레 송신기
- 트레이닝 종료 후, 수영과 다이빙 래트에서 박동성 동맥 혈압을 송신하도록 시판 원격 측정 송신기를 사용한다. 수술과 수술 후 회복에 관한 절차는 지역 IACUC 승인을 얻습니다. 자신의 송신기에 대한 회사에 의해 제안 된 주입 절차를 따르십시오, 물에 쥐를 반환하기 전에 수술에서 완전 회복을 보장합니다.
- 래트가 물에있을 때 상기 무선 신호를 수신하는 안테나 근처에 확인.
NOTE는 : 물은 무선 신호를 감쇠하고, 그래서 거리 무선 신호 네브라스카물 탱크 크기의 제한 요인이된다 통해 EDS는 여행. - 이 미로를 통해 진행 쥐를 따라, 오히려 쥐 케이지 크기의 안테나보다, 휴대용 안테나 지팡이를 사용합니다. 쥐 수중 상태에서 무선 신호가 손실되지 않도록 쥐의 30cm 이내에 지팡이 안테나를 유지합니다.
- 후행 캐 뉼러
- 다이빙 터널의 지붕을 만드는 채널 디바이더 및 수평 조각을 재 설계 미로를 통해 진행하는 동안 쥐의 뒤에 따라 정맥이 산책로 있도록.
참고 : 채널의 모듈 형 설계가 가장 중요하고도 빠른 수중 미로에서 쥐의 복구 허용해야합니다. 정맥의 차질과가 쥐에서 탈락되었다 경우 수중 캐 뉼러를 신속하게 재 부착되지 않은 경우 동안 쥐 곧 피가 수 있습니다. - 자발적 다이빙 래트에서 동맥 혈압 및 심박 률을 기록하는 후행 동맥 캐뉼라를 사용한다. PE50의 90cm 조각 등을 사용하여뒤에 정맥.
NOTE :이 캐 뉼러의 길이는 여전히 쥐 미로 통해 진행시키면서 압력 변환기에 쥐를 연결하기에 충분히 긴 아직 뉼러 데드 스페이스를 최소화 할 정도로 짧고 충분한 충실도를 허용하는 압력 변환기에 충분히 가까운 동맥 압력 신호. - 같은 부교감 신경과 교감 신경 작용제와 길항제 등의 약제를 주입하는 후행 정맥 (또는 동맥) 캐 뉼러를 사용하거나, 심 박출량의 분포를 결정 추적자 또는 염료를 주입 할 수 있습니다.
- 쥐 중 카테콜라민 수준 또는 혈액 화학을 결정할 수 중 동안 정맥 (또는 동맥) 캐뉼라를 이용하여 쥐로부터 혈액 시료를 철회.
주 : 뒤에 정맥의 길이를 최소화하고 혈액 그리는 동안 정맥 죽은 공간을 차지한다.
- 다이빙 터널의 지붕을 만드는 채널 디바이더 및 수평 조각을 재 설계 미로를 통해 진행하는 동안 쥐의 뒤에 따라 정맥이 산책로 있도록.
- 활성화 뇌간의 신경 세포의 검출
- 확인 시험하기에 Fos 단백질의 면역 학적 검출을 사용하여다이빙 응답의 일부인 뇌간의 회계 연도 특정 영역.
참고 : 심폐 반사의 반복 시작, 활성화되고에 Fos라는 단백질을 생산 할 수 반사 회로의 일부인 뇌간의 신경 세포 중. - 반복적으로 24 다이빙 총 2 시간 동안 미로를 통해 5 분마다 쥐를 다이빙.
NOTE : 또한 신경에 Fos 생산을 유도하는 다른 프로토콜 또한 사용될 수있다. 스트레스에 대한 반응에 관여하는 뇌간 신경 세포의 활성화를 방지하기 위해, 반복되는 동작은 행동 훈련의 일부로 포함되어야한다.
- 확인 시험하기에 Fos 단백질의 면역 학적 검출을 사용하여다이빙 응답의 일부인 뇌간의 회계 연도 특정 영역.
- 다이빙하는 동안 혈액 코르티 코스 테론 (corticosterone) 수준
- 수영과 다이빙하는 동안 스트레스 쥐 경험의 수준의 지표로 코르티 코스 테론을 사용합니다.
- , 코르티 코스 테론 분석을 위해 혈액을 얻는 15 분 3 자발적 수영이나 다이빙 후 쥐의 꼬리 정맥에서 0.1 ml의 혈액 샘플을 그립니다.
NOTE : 예비 실험은 15 분 스와 인 것으로 나타났다fficient 시간은 순환으로 생산 및 코르티 코스 테론의 방출을 허용하고 혈장 코르티 코스 테론의 수준에서 피크를 야기한다. 코르티 코스 테론의 수준 일 주기성 리듬을 가지고 있기 때문에, 모든 혈액 하루 동시에 묘화 예약하고 트레이닝 세션의 타이밍에 대응.
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Representative Results
설명 수영과 다이빙 교육 과정의 성공적인 완료는 물에서 다이빙 할 때 쥐가 경험하는 스트레스를 줄일 수 있습니다. 혈액 코르티 코스 테론 수준은 반복적 인 매일 훈련이 자발적 다이빙과 관련된 stressfulness을 감소 함을 표시하고 훈련 된 쥐 인간 (그림 2; 17)에 의해 매일 처리되는 것보다 다이빙이 더 이상 스트레스를 찾을 수 없습니다. 반대로, 다이빙 프로토콜에서 교육을받지 쥐 자발적 다이빙 스트레스 (그림 2; 17) 찾을 수 있습니다. 또한, 모두 훈련과 교육을받지 않은 쥐가 가장 스트레스 (17 그림 2)로 다이빙을 강제로 찾을 수 있습니다.
후행 캐 뉼러 (그림 4; 21-23), 수영, 자발적 다이빙 및 강제 다이빙 쥐에서 심장 혈관 반응은 이식 된 원격 측정 장치 (8,17-20 그림 3)를 사용하여 기록되었다. 즉시 자발적시침수 및 단일 비트 내, 심장 박동이 감소하여 78 % 및 25 % (17)에 의해 동맥 혈압의 감소를 의미한다. 이러한 결과는 자발적 다이빙 래트는 전형적으로 다른 다이빙 동물에서 본 같은 심폐 변화를 나타내는 것을 보여준다. 및 자발적 다이빙 동안 뇌 혈류 (23)를 포함하여 심 박출량 (22)의 분포를 결정하기 위해, 후행 동맥 캐뉼라는 자발적 다이빙 (21도 4)와 연관된 서맥을 제거 무스 카린 길항제 아트로핀을 주입하기 위해 사용되어왔다. 후행 캐 뉼러는 또한 18 잠수하는 동안 쥐 동맥 저산소 혈증과과 탄산 혈증을 증가을 무시 것을 보여주기 위해 사용되며,되었는지 기존의 화학 수용체 드라이브하는 자발적 다이빙 (21)에 대한 심혈관 반응에 영향을주지 않습니다.
라미 I 및 복부 수질 척수 후각의 II (MDH) 표현에 Fos 두린 내에서 뉴런G 자발적 다이빙, 이들 뉴런은 다이빙 응답 (24 그림 5)의 초기 뇌간의 구 심성 릴레이를 구성 할 수있다. 같은 꼬리 압축기 영역 (CPA)와 같은 중요한 뇌간 심폐 제어 영역은, 핵 중추 신경 solitaries (NTS), 주동이의 ventrolateral 수질 (RVLM) 및 peribrachial 지역, 모든 쇼는 수영 (25)에 비해 자발적 다이빙 동안의 FOS 라벨 증가했다. 긴 기간은 다이빙 (18)를 강제 후 뇌간의 chemosensitive 지역에서 신경 FOS를 표현한다.
그림 1 :. 다이빙 탱크의 개략도 플렉시 탱크 (100 X 60 X 15cm)은 다섯 1m 길이 채널로 구성된 간단한 미로를 만드는 데 사용되었다. 탱크는 30 ° C의 수돗물로 채워졌다, 쥐가 처음 negotiat에 훈련을받은마침 지역 (맨 왼쪽) 시작 영역에서, 물 표면에 수영으로 전자 미로 (오른쪽 아래). 쥐 다음 미로를 통해 다이빙 훈련을받은, 물 표면 아래 2-3cm를 배치 수평 플렉시 유리 조각에 의한 수중 있었다. [이 수치는 26에서 수정되었습니다]
그림 2 : 코르티 코스 테론 (corticosterone) 측정. 혈액은 쥐가 10 분 / 쥐 수영과 다이빙 (훈련) 훈련을 하루 (취급), 쥐에 대한 처리, 그들의 감 금 (나이브)에 남아있는 쥐에서 코르티 코스 테론 농도 (± SE를 의미)을 측정하는 데 사용 된 쥐의 꼬리 정맥에서 그립니다 그은 수영이나 다이빙 훈련 (훈련되지)를 수신하지. 훈련 된 쥐들이 수영 훈련 (왼쪽 바 세트) 완료 한 후 코르티 코스 테론 (corticosterone)를 측정 한 후 훈련을받은 쥐들은 자발적 DIV를 완료했다전자 교육 (바의 센터 세트), 훈련 쥐 후 (우 바 세트) 그들의 강제 다이빙 교육을 완료했다. 1 값 순진보다 훨씬 큰 나타낸다 2 값을 취급보다 훨씬 큰 나타낸다 3은 값이 훈련보다 훨씬 큰 나타낸다 * 강제 다이빙 동안 훈련 된 쥐 값에 자발적 다이빙 동안보다 훨씬 크다는 것을 나타냅니다. [이 수치는 17에서 수정되었습니다]
그림 3 : 원격 측정 송신기에서 동맥 혈압 흔적 미로를 통해 수영 훈련을받은 쥐와 다이빙에서 (왼쪽 열), 자발적 다이빙 (가운데 열), 강제 다이빙 (오른쪽 열) 수영 동안 박동 동맥 혈압을 보여주는 원시 데이터를 추적합니다. TRAI 없었다고 쥐 (맨 아래 줄) 및닝 절차 (맨 윗줄). 물의 표면에서 수영하는 그러한 심혈관 변화를 발생하지 반면 수중 잠수 (자발적 강제 잠김 모두), 즉시 서맥 동맥압 느린 발병 증가를 만들었다. 흔적에서 바 침수의 기간을 나타냅니다. 원격 측정 신호가 끊어 질 때 추적에 휴식이 기간을 나타냅니다. [이 수치는 17에서 수정되었습니다]
그림 4 : 아트로핀 다이빙 서맥을 제거합니다. 아트로핀 전처리 후 박동성 동맥혈 전에 자발적 다이빙 래트 (A)의 압력 및 (B)의 원래 기록. 흔적 후행 동맥 캐뉼라를 사용하여 얻었다. 아트로핀 전처리하기 전에, 동맥 압력이 침수에 약간 감소하였으나 t암탉은 다이빙의 나머지 부분에 대한 사전 다이빙보다 더 증가했다. 심박수는 인접 맥압 간격에서 측정 하였다. 침수시 다이빙의 기간 동안 지속되었다 즉각적이고 실질적인 서맥이 있었다. 아트로핀 전처리 의하여 부교감 차단 후 서맥이 제거되었다. 다이빙시 동맥압의 증가도 있었다. 추적 아래 바는 침수의 기간을 나타냅니다. [맥 컬록, 미 출판]
그림 5 : MDH 내에서의 FOS 라벨. 삼차 수질 척수 후각 (MDH) 및 수중 잠수 훈련을받은 쥐의 척수 삼차 기관 (SP5)의 현미경 사진. 반복 더의 FOS 라벨이없는 다이빙을하지 않은 제어 쥐 (A). (B) 수영 쥐에서 매우 켜져있다SP5 내 TLE에 Fos MDH의 라벨 (큰 화살표) 또는 paratrigeminal 핵 (작은 화살표). (C) 다이빙 쥐 더의 FOS 라벨이 MDH (큰 화살표) 모두에서 복부가 있고 paratrigeminal 핵 (작은 화살표)에서 비교 수영 및 제어 쥐. 패널 (A)에 삽입은 패널 AC의 주동이의 - 꼬리 위치를 나타냅니다. 패널 C의 스케일 바는 100 ㎛이다. [이 수치는 24에서 수정되었습니다]
그림 6 : 다이빙 쥐 활성화 카테콜아민 신경. 현미경 사진 비 다이빙 제어 쥐 (A, C 및 E) 및 자발적 다이빙 래트 (B, D, 그리고 F)의 medullas를 나타낸다. 뇌 조직은 immunohistologically 모두의 FOS에 대한 처리 된D 티로신 수산화 (TH), 갈색 TH의 somas과 검은 색의 FOS 핵을 생산. 고체 화살표에 Fos + TH 이중 표지 신경 세포를 식별하는 동안 열기 화살촉, 하나의 표지 TH-신경 세포 식별합니다. A1의 뉴런 및 B. C1 뉴런에서 식별은 C에서 식별 및 D. A5 뉴런 E 및 F. 외에 Fos 및 A1, C1에서 보인다 이중 표지 된 TH에서 식별되고, 잠수 쥐보다는의 A5 영역 비 다이빙 제어 쥐. E의 교정 바는 패널 AF입니다, 250 μm의입니다. F에 삽입에서 교정 바는 모든 세트입니다, 50 μm의입니다. [이 수치는 26에서 수정되었습니다]
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Discussion
자신의 야생 형태의 수에서 쥐와 반 수생 환경을 악용 할, 식품 6 꼴을하면서 의지는 종종 수중 다이빙. 따라서 쥐가 아주 쉽게 자발적으로 수중 다이빙을 훈련 할 수있는 너무 놀라운 일이 아니다. 기술 교육 과정은 대부분의 성인 쥐의 뇌지도 책에 사용되는 신체 사이즈 (~ 300g)에 새로 이유 쥐를 가져올 것이다 육주,까지 지속될 수 있습니다. 이러한 교육을받은 동물 따라서 뇌는 더 쉽게 비교할이지도 책에서 확인 된 해부학 적 구조에있을 것입니다.
시작 영역에 배치 된 후 대부분의 쥐를 20 초 이내에 수중 수영을 시작합니다. 그러나, 때때로 쥐 자발적 다이빙을 시작하기 전에 5 분 이상 소요됩니다. 이 수중 터널로 쥐를 강제로이 단계에서 유혹 될 수 있지만, 이는 일반적으로 부정적 경험 물 연관으로부터 래트 않도록 피해야한다. 설치류는 initi 고집 월 수동맹국 훈련 기간 동안 다이빙을 거부하지만, 물을 종료 할 수있는 유일한 방법은 미로를 통해 다이빙을 완료하여 깨닫게되면, 그들은 일반적으로 곧 시작 영역에 배치 된 후 자신의 다이빙을 시작합니다.
반복적 및 조직적 훈련 과정의 중요한 특징은 그들이 쥐가 겪는 스트레스를 줄일 수있는 방식으로 수행된다는 것이다. 쥐가 특히 시험의 마무리 영역에있는 동안, 자신의 환경을 탐구시키는, 더 스트레스를 줄이기 것으로 보인다. 쥐들은 수영을 물을 다시 입력 및 / 또는 아직 마무리 영역 플랫폼에 앉아있는 동안 그들의 머리 수중 잠수함 것입니다. 이 쥐가 본질적으로 물 혐오 아니라는 것을 시사한다. 또한, 쥐가 수영이나 다이빙, 이하의 배설물 펠렛 (17)의 마무리 영역에서 대기, 매일 훈련 결과 동안 배설물 펠렛을 생산하는 것은 드문 일이 아니다된다. 일반적으로 적게는 쥐가 훈련 중에 있습니다 강조, 적은 PEllets 그들은 생성합니다. 작성되는 배설물 펠렛은 상대적으로 깨끗한 물을 유지하기 위해 가능한 한 빨리 물이나 마무리 영역에서 제거됩니다.
쥐 가끔 피 묻은 코를받을 수 있습니다 비강에 물 통기의 결과 일 수있다 수영과 다이빙, 동안. 혈액의 모양은 코 점막 내에서 삼투 스트레스 때문일 수 있습니다. 시험의 마무리 영역에있는 동안 쥐가 자신을 신랑 것입니다. 코에서 그 결과 혈액으로 훈련의 과정 동안, 특히 눈 주위, 쥐에게 약간의 붉은 색조를주는 쥐의 머리와 주둥이를 통해 재배포 얻을 수 있습니다. 또한, 가끔 쥐 다이빙 스트레스를 찾을 수 있습니다 및 / 또는 음의 다이빙 경험이 (턴어라운드와 다이빙 수중 (5.4.3 후 메모를 참조하면서 소실에 의해, 즉. 발생)이 발생하지 않도록하는 방법). 이러한 쥐에서 포르피린은 스트레스 응 답 신호, 눈의 모서리에 표시 될 수 있습니다전자.
다이빙 탱크의 크기는 어느 정도 공간 요구 사항을 확인합니다. 설명 탱크가 쥐가 5 m 길이의 플렉시 글라스를 통해 수면 아래 2-3cm 수영을 갖도록 설계되어 10 ~ 15 초 17,19,24,26,27의 수중 수영 시간을 제공하기 위해 미로. 실험은 더 긴 기간 강하에서 응답을 측정하도록 설계 될 경우, 또는 수중 잠수 깊이에서, 탱크 재 설계 될 필요가있다. 방 요구는 또한 재 설계 잠수 탱크의 크기에 맞도록 변경할 수있다. 절차 방 가능한 바닥 배수가없는 경우, 탱크로부터의 물은 다음 편리한 방식 다른 비워 질 수 60 갤런 쓰레기통과 같은 큰 용기에 수집 할 수있다.
에 Fos 기술은 상기 잠수 응답 뇌간 회로의 일부 뉴런을 식별하고 특성화하기 위해 다른 신경 탐지 방법에 이용 될 수있다. 예를 들어,자발적 동안 활성화되는 측면 A7 영역 (26, 27) 내에서, 그리고 globosa 뉴런; 티로신 수산화 염색과 함께 FOS의 검출은 A1, C1, A2, A5에서 카테콜아민 신경 세포와 하위 coeruleus 영역 (26 그림 6)를 확인했다 다이빙. 또한, 역행 트레이서 콜레라 독소와 결합에 Fos 검출 자발적 다이빙 20 중에 활성화되는 핵 ambiguus의 외부 형성 내 심장 미주 motorneurons의 균체를 확인했다.
다이빙 심폐 반응의 중추 신경의 통합을 조사하는 이유 6,8,28의 수에 대한 중요하다. 다이빙 응답은 오랜 기간 동안 호흡을하지 않고 잠수 수중을 유지하기 위해 동물을 포함하여 인간을, 수 있습니다. 잠수 응답 뇌간 항상성 제어의 기능적 재구성을 나타내며, 가장 강력한 파 중 하나 보여동물에서 관찰 자율 반사의 tterns. 다이빙 응답도 trigemino - 심장 반사의 일부, 인두 반사 및 / 또는 영아 돌연사 증후군 등 인체에 중요한 임상 적으로 할 수있다. 마지막으로, 쥐의 뇌간 내에서 존재하는 신경 회로에 대한 이해는 구 심성 신호가 기본 뇌간 자율 반사 신경을 수정하는 방법 피질 결정하는 데 도움이됩니다. 이러한 고려의 모든 포유류의 다이빙 응답의 중앙 측면의 연구는 본질적으로 가치있는 재미있는합니다. 설명 된 절차를 사용하여 자발적으로 수중 강제 다이빙 동물의 사용보다 포유류의 다이빙 응답의 중앙 측면의 더 나은 조사를 허용 다이빙 쥐를 훈련합니다. 한 바와 같이 트레이닝 절차) CNS 스트레스 회로의 활성화를 감소시키고, 외부 보상이 사용되지 않으므로 2) CNS에게 보상 회로가 활성화되지 않기 때문이다.
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Disclosures
저자는 Stoelting 회사의 컨설턴트, 상업적인 목적을 위해 그들에게 전체적인 디자인과 맥 컬록 다이빙 탱크 미로의 사양을 제공했다.
Acknowledgments
연구는 연구 및 스폰서 프로그램의 중서부 대학 사무실에서 자금을 지원. 또한 중서부 대학 동물 시설과 에릭 워렌 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McCulloch Diving Tank Maze | Stoelting Company | 60139 | |
| 1 inch internal diameter tubing | Fisher | 14-169-63 | Used to fill or drain tank |
| Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer) | Braintree | FB-M/L | For forced dives |
| Telemetric transmitters | DSI | Model PA-C40 (270-0040-008) | Used to transmit pulsatile arterial blood pressure |
| Hand-held antenna wand | DSI | Model RLA 3000 (272-5007) | Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze |
| Intramedic PE50, 0.023" ID | Fisher | 14-170-12B | Used as trailing arterial cannula |
| N95 mask - Moldex #2300N Series | Fisher | 19-003-246D | Used to limit inhalation of rat allergens |
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